Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk

6
Tabel 4
Mutan
I 18
II 41
II 4
III 20
I 16
II 23
II 52
II 33
I 30
I 27
III 4
I 29
III 63
II 63
Persentase penurunan asam indol
asetat yang dihasilkan oleh mutan
Pseudomonas sp. CRB17 hasil
mutagenesis dengan transposon
Penurunan
produksi
IAA (%)
2.66
4.39
7.68
8.64
10.39
11.37
11.49
14.37
14.63
14.76
17.90
19.58
20.04
21.62
Mutan
III 52
III 2
I 26
III 11
II 83
V14
II 92
V7
III 23
III 83
V 23
I 28
III 30
II 73
Penurunan
Produksi
IAA (%)
22.79
30.12
31.47
32.94
33.71
34.56
39.68
39.96
40.61
47.31
47.68
54.61
54.73
55.31
PEMBAHASAN
Pseudomonas sp. yang berpotensi dalam
penghasilan IAA yang mampu memacu
pertumbuhan banyak terdapat di rizosfer suatu
tanaman (Dey et al. 2004). Oleh karenanya,
dalam penelitian ini untuk mendapatkan isolat
Pseudomonas sp. penghasil IAA maka
dilakukan isolasi Pseudomonas sp. dari
rizosfer tanaman kedelai. Sebanyak 100 isolat
dikategorikan sebagai Pseudomonas sp.
Karakter-karakter umum yang dimiliki
Pseudomonas sp. tersebut adalah berbentuk
batang, motil, Gram negatif, memiliki
oksidase positif dan mampu tumbuh pada
media semiselektif King’s B (Holt et al.
1994).
Berdasarkan hasil uji produksi IAA
didapatkan bahwa Pseudomonas sp. CRB17
merupakan isolat penghasil IAA tertinggi
yaitu sebesar 16.02 ppm (Tabel 1). Isolat
CRB17 ini selanjutnya dipilih untuk
dikonstruksi mutan yang menghasilkan IAA
lebih tinggi. Karakter lain yang dimiliki
CRB17 ialah menghasilkan pigmen fluoresen
pada media King’s B. Banyak spesies
Pseudomonas sp. yang mampu menghasilkan
pigmen yang berfluoresen terutama pada
kondisi pertumbuhan miskin besi misalnya
jika ditumbuhkan pada media King’s B yang
tidak ditambahkan zat besi. Beberapa pigmen
ini dan turunannya berperan sebagai siderofor
(zat pengkelat besi) yang berpotensi
menghambat pertumbuhan patogen (Garibaldi
1967).
Berdasarkan
hasil
esai
pemacuan
pertumbuhan diketahui bahwa Pseudomonas
sp. CRB17 mampu memacu pertumbuhan
kecambah kedelai. Hal ini dibuktikan dari
nilai parameter esai pemacuan pertumbuhan
kecambah yang diinokulasi CRB17 yang
secara signifikan berbeda nyata dengan
kontrol. Panjang akar primer kecambah yang
diinokulasi CRB17 memiliki rataan sebesar
21.4 cm dan jumlah akarnya sebanyak 75
buah. Sedangkan panjang akar primer kontrol
sebesar 11.4 cm dan jumlah akarnya sebanyak
32 buah (Tabel 2). Dari hasil ini dapat
dikatakan bahwa isolat Pseudomonas sp.
CRB17 dengan konsentrasi IAA yang
dihasilkannya, dapat berperan sebagai
rhizobakteria pemacu pertumbuhan tanaman
khususnya kedelai.
IAA yang disekresikan oleh suatu bakteri
kemungkinan dapat memacu pertumbuhan
baik secara langsung dengan merangsang
pemanjangan atau pembelahan sel atau secara
tidak langsung dengan mempengaruhi
aktivitas
asam
1-aminocyclopropane-1carboxylic (ACC) deaminase. Enzim ini
menghidrolisis ACC tanaman, prekursor
fitohormon etilen, sehingga mencegah
produksi etilen dengan konsentrasi yang
menghambat pertumbuhan. IAA eksogenus
dapat meningkatkan transkripsi dan aktivitas
sintesis ACC pada tanaman. ACC ini memacu
aktivitas ACC deaminase bakteri (Patten &
Glick 2002).
Dari hasil uji resistensi didapatkan bahwa
Pseudomonas sp. CRB17 sensitif kanamisin
50 µg/ml dan resisten kloramfenikol 50
µg/ml. Sehingga E. coli S17-1 λ pir pembawa
plasmid pUTmini-Tn5Km1 yang memiliki
transposon resistensi kanamisin dapat
digunakan dalam proses mutagenesis CRB17.
Selain itu, dari hasil uji resistensi ini
didapatkan bahwa antibiotik kanamisin dan
kloramfenikol dapat digunakan sebagai
marker
seleksi
transkonjugan/mutan
Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis
dengan transposon.
Frekuensi transkonjugasi hasil transposon
mutagenesis tersebut yang didapat dari masa
inkubasi konjugasi selama 24 jam sekitar 3.1
x 10-5 sel per resipien. Frekuensi ini lebih
tinggi dibandingkan penelitian Rukayadi
(1998)
yang
mendapatkan
frekuensi
transkonjugasi pada Xanthomonas campestris
sebesar 8.3 x 10-6 menggunakan galur E. coli
yang sama. Mutan-mutan Pseudomonas sp.
CRB17 yang dihasilkan melalui mutagenesis
dengan transposon diekspresikan melalui
kemampuannya tumbuh pada media King’s B
7
yang ditambah kloramfenikol dan kanamisin.
Hal ini mengindikasikan bahwa gen Km1
yang dibawa transposon mini-Tn5Km1 telah
berhasil disisipkan ke dalam genom
Pseudomonas sp. CRB17.
Transposon Tn5 merupakan salah satu
transposon yang telah banyak dikaji karena
menyediakan model sistem transposisi cut(potong) dan paste- (pindah) yang baik.
Transposon mini-Tn5Km1 merupakan turunan
dari Tn5 yang sangat berguna untuk
mutagenesis pada bakteri
Gram negatif
(Holtwick et al. 1997).
Selama konjugasi plasmid pUTminiTn5Km1 dipotong menjadi utas tunggal dan
utas tunggal ini pindah ke dalam sel resipien
melalui pili. Pada sel resipien transposon
penyandi resistensi kanamisin ini akan
menyisip acak pada genom resipien sehingga
menghasilkan transkonjugan yang resisten
kanamisin. Oleh karena itu pada media untuk
seleksi transkonjugan ditambahkan antibiotik
kanamisin sebagai penanda adanya penyisipan
transposon.
Penyisipan transposon mini-Tn5Km1 ini
bersifat stabil karena gen transposase berada
di luar transposon sehingga setelah transposon
menyisip pada genom resipien tidak terjadi
transposisi lagi yang diperantarai transposase.
Selain itu juga karena plasmid pUTminiTn5Km1 merupakan plasmid bunuh diri.
Plasmid ini tidak dapat bereplikasi dalam sel
resipien karena hanya dapat bereplikasi dalam
sel yang menyediakan protein pir (protein
initiation replication). Kemudian akhirnya
plasmid ini akan terdegradasi oleh DNAase.
.
Dari hasil seleksi diperoleh sebanyak 21
transkonjugan menghasilkan IAA yang lebih
tinggi daripada tipe liarnya yaitu mengalami
kenaikan produksi IAA-nya hingga 77.52 %
(Tabel 3). Hal ini diduga karena adanya
penyisipan transposon di daerah represor dan
mengakibatkan terjadinya perubahan pada
gen-gen yang terlibat dalam regulasi
biosintesis IAA sehingga produksi IAA
menjadi meningkat (Pratiwi et al. 2001).
Selain itu juga didapatkan 28 mutan
menghasilkan IAA yang lebih rendah
dibandingkan dengan tipe liarnya yaitu
dengan persentasi penurunan hingga 55.31 %
dari hasil uji produksi IAA ini (Tabel 4).
Mutan yang mengalami penurunan produksi
IAA ini mungkin disebabkan oleh adanya
penghambatan salah satu gen dalam
penghasilan IAA.
Melalui transposon mutagenesis ini tidak
didapatkan mutan yang tidak menghasilkan
IAA. Hal ini mungkin dikarenakan banyaknya
jalur sintesis yang digunakan dalam
penghasilan IAA yang kemungkinan dimiliki
oleh galur Pseudomonas. Jika salah satu jalur
saja terhambat karena salah satu gen yang
berperan dalam jalur tersebut tidak dapat
diekspresikan akibat penyisipan transposon
maka bakteri penghasil IAA dapat mengambil
jalur sintesis alternatif. Hal serupa juga
ditemui dalam penelitian Pratiwi et al. (2001)
yaitu didapatkan mutan-mutan Azospirillum
braziliense menghasilkan IAA yang lebih
tinggi dan lebih rendah melalui transposon
mutagenesis.
SIMPULAN
Sebanyak 100 isolat Pseudomonas sp. telah
berhasil diisolasi dari tanah rizosfer tanaman
kedelai daerah Cirebon. Sebanyak 98 isolat di
antaranya menghasilkan asam indol asetat.
Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB
17 merupakan penghasil IAA tertinggi yakni
sebesar 16.02 ppm dan mampu memacu
pertumbuhan tanaman kedelai melalui
pemacuan perpanjangan akar primer dan
pembentukan akar. Melalui mutagenesis
dengan transposon dapat dikonstruksi mutan
Pseudomonas sp. CRB17 yang menghasilkan
IAA dengan konsentrasi yang meningkat
hingga 77.52%. Dari hasil penelitian ini,
mutagenesis dengan transposon dapat
digunakan untuk meningkatkan produksi IAA,
khususnya pada Pseudomonas sp. CRB17.
DAFTAR PUSTAKA
Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM.
2004. Growth promotion and yield
enhancement
of
peanut
(Arachis
hypogaea L.) by application of plant
growth-promoting
rhizobacteria.
Microbiol Res 159 : 371-394.
Garibaldi JA. 1967. Media for the
enhancement of fluorescent pigment
production by Pseudomonas species. J
Bacteriol 94 :1296-1299.
Harayama S, Lehrbach PR, Timmis KN.
1984. Transposon mutagenesis analysis
of meta-cleavage pathway operon genes
of the TOL plasmid of Pseudomonas
putida mt-2. J Bacteriol 160 : 251-255
Holt JG, et al. 1994. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. Ed ke-9.
Philadelphia: Lippincott William &
Wilkins