BAB I Pengantar kromatografi Sejarah dan

BAB I
Pengantar kromatografi
Sejarah dan perkembangan kromatografi
Teknik
pemisahan
yang
sebenarnya
dapat
dikatagorikan
teknik
kromatografi adalah pada waktu Runge, F.F. (1834-1843) melakukan spot test
campuran zat warna dari ekstrak tumbuh-tumbuhan pada pita kain dan atau
kertas. Pada tahun 1850 ia memisahakan larutan garam dengan kertas.
Selanjutnya Goppel sroeder, F (1868) menganalisis zat warna, hidrokarbon,
alkohol-alkohol, beer, milk pada minuman dan air minum menggunakan kertas.
Sedangkan peneliti Schobeinc menggunakan pita kertas untuk memeriksa
cairan. Baru kemudian Day D.T. (1897-1903) menggunakan kolom yang diisi
serbuk tanah untuk pemisahan. Namun yang populer adalah kimiawan Rusia,
Mikhail Tswett (1906-1907) telah berhasil memisahkan pigment kloroplast
dengan fase diam CaCO3 dan petroleum eter sebagai fase gerak. Mulai saat itu
konsep kromatografi lebih jelas. Kromatografi diturunkan dari bahasa greek, iaitu
chromato (warna) dan grafe (tulisan) yang berarti penulisan dengan warna
(writing with colors). Kemudian diikuti beberapa peneliti misalnya: Wilson, J.N.
(1940) mempelajari tentang teori pada kromatografi kertas. Tiselius, A (1941)
pemenang hadiah nobel atas penemuannya mengenai analisis adsorpsi dan
elektroforesis. Martin, A.J.P. dan Synge, R.L.M.(1941) mengajukan pertama kali
model yang menjelaskan efesiensi kolom dan mengembangkan kromatografi cair
dan berhasil mendapatkan hadiah Nobel tahun 1952. Masih banyak lagi peneliti
lain untuk disebut satu persatu, namun yang perlu diingat adalah Van Deemter,
JJ dkk yang mengembangkan teori kecepatan dengan menyederhanakan hasil
kerja
Lapidus
dan
Ammundson
pada
fungsi
distribusi
Gauss.
Dari
perkembangannya nama kromatografi tidak sesuai lagi karena sekarang tidak
hanya dilakukan pemisahan pada campuran senyawa berwarna saja.
Dasar pemisahan kromatografi adalah perbedaan kecepatan migrasi
komponen (senyawa-senyawa) yang dibawa oleh fasa gerak (mobile phase) dan
ditahan secara selektif oleh fasa diam (stationary phase). Metode pemisahan ini
sangat dikenal di laboratorium kimia karena dasar pemikiran yang sederhana
dan mudah difahami. Hasil pemisahan yang dikehendaki tergantung untuk
keperluannya, sehingga dapat dipilih teknik kromatografi yang sesuai, dari yang
sederhana hingga yang sangat rumit.
Hampir semua senyawa kimia dapat dipisahkan dengan metode
kromatografi dari molekul yang mempunyai berat molekul besar hingga yang
kecil. Perkembangan yang kemudian adalah mampu memisahkan senyawasenyawa sterio isomer.
Pemisahan secara kromatografi dilakukan dengan memanipulasi sifat
kimia-fisika dari molekul yaitu:
1. Kecenderungan molekul larut dalam cairan, hubungannya dengan
kelarutan senyawa dalam dua fase cairan dan konsep Like dissolves like.
Hubungan ini tidak lepas dengan pengertian polaritas senyawa.
2. Kecenderungan molekul untuk berinteraksi dengan molekul fase gerak
ataupun fase diam. Interaksi ini dapat melibatkan terjadinya ikatan hydrogen
(adsorpsi), proses filtrasi atau permeasi, dan terjadinya interaksi ionik.
3. Kecenderungan molekul untuk mudah menguap. Kemudahan molekul
menguap tergantung dari sifat fisika-kimia, apakah itu ikatan kimia, bobot
molekul dan lain-lain. Perbedaan volatilitas ini digunakan sebagai dasar
pemisahan pada kromatografi gas.
Penggolongan kromatografi
Atas dasar mekanisme pemisahan:
1. kromatografi serapan (absorption chromatography)
2. kromatografi partisi (partition chromatography)
3. kromatografi eksklusi (exclusion chromatography)
4. kromatografi penukar ion (ion exchange chromatography)
Atas dasar (wujud) fase gerak:
1. kromatografi gas (fase geraknya adalah gas)
2. kromatografi cair (fase geraknya adalah zat cair)
Atas dasar bentuk atau bahan fase diam:
1. Kromatografi planar
a. kromatografi lapis tipis
b. kromatografi kertas
c. kromatotorn
2. Kromatografi kolom
a. kolom terbuka
b. kromatografi gas,
c. kromatografi cair kinerja tinggi
Atas dasar cara mengalirkan fase gerak
1. vacuum column chromatography
2. flash column chromatography
3. gravity column chromatography
4. high pressure liquid chromatography
Penamaan pada umumnya didasarkan keadaan fase gerak dan fase diamnya,
misalnya
GLC
= gas liquid chromatography (KGC)
GSC
= gas solid chromatography (KGP)
LLC
= liquid liquid chromatography (KCC)
LSC
= liquid solid chromatography (KCP)
Definisi istilah
Sampel atau cuplikan : senyawa atau campuran senyawa yang larut dalam fase
gerak. Senyawa yang larut dalam cairan fase gerak disebut linarut atau solute.
Fase diam : dapat berbentuk cairan atau padat, berfungsi menghambat migrasi
linarut.
Fase gerak : dapat berbentuk cairan atau gas yang berfungsi membawa linarut
menelusuri fase diam.
Fase pendukung : bahan padat netral terhadap linarut, berfungsi menahan fase
diam supaya berfungsi sesuai yang dikehendaki.
Elusi : proses awal hingga selesai digerakkan linarut oleh fase gerak menelusuri
fase diam.
Visualisasi : proses mendeteksi hasil pemisahan baik langsung dengan mata
atau melalui tahapan perlakuan terhadap hasil pemisahan tsb.Misalnya dengan
sinar ultra lembayung ataupun dengan dengan reagen pewarna.
Mekanisme Pemisahan
Molekul polar dan non-polar
Sebelum
membicarakan
mekanisme
pemisahan
perlu
difahami
pengertian senyawa yang bersifat polar dan non polar. Untuk lebih mudahnya
diambil contoh H2O, air tersusun dari 2 atom hydrogen dan 1 atom oksigen.
Ikatan antara H dan O adalah kovalen. Bila ditarik garis dari atom H ke O akan
terbentuk dua garis lurus yang bertemu di atom O dengan sudut 104,5 °C. Maka
bentuk molekul air tidak merupakan garis lurus, Diingat bahwa atom O adalah
atom yang mempunyai sifat elektronegatif, yaitu atom yang mempunyai
kemampuan menarik electron lebih kuat. Seperti halnya atom F, Cl, Br dan I.
Dalam hal ini pasangan elektron ikatan tertarik kearah atom O, maka ada 2 gaya
dari H ke O yang tidak saling menghilangkan, tetapi dihasilkan resultant yang
merupakan momen dipole dari senyawa H2O. Jadi dengan demikian ada
muatan positif dan negatif atau muatan terkutub dalam molekul air, oleh karena
itu air dinyatakan sebagai senyawa polar. Demikian juga methanol, etanol,
aseton dapat dijelaskan seperti tersebut diatas, hanya saja kekuatan momen
dipolenya berbeda-beda, sehingga polaritasnyapun berbeda.
Bagaimana dengan heksan ? Nah molekul ini tidak mempunyai atom
elektronegatif sehingga tidak ada momen dipole yang berarti, dengan demikian
senyawa ini bersifat non-polar. Bagaimana dengan CCl4 dan CHCl3 ?
Konsep like dissolves like
Hubungan polaritas suatu senyawa dengan kelarutan dalam cairan
menunjukkan bahwa senyawa polar akan larut dalam cairan polar (pelarut),
sedangkan
senyawa
non-polar
larut
dalam
pelarut
non-polar.
Dengan
pendekatan struktur molekul kiranya dapat diketahui polaritas suatu senyawa.
Bila dua senyawa perbedaan polaritas demikian jauh maka keduanya saling
tidak larut dan bila keduanya berbentuk cairan maka keduanya tidak dapat
saling campur (immicible), dan bila dicampur akan ada dua lapisan cairan.
Mekanisme pemisahan secara partisi
Mekanisme ini terjadi pada kromatografi yang fase diamnya berbentuk
cairan dan fase geraknya berbentuk cairan juga (kromatografi cair-cair). Konsep
like dissolves like, interaksi terjadinya ikatan hidrogen juga berlaku disini.
Dianalogikan dengan solute terlarut dalam dua cairan (pelarut) yang tidak
campur. Solute akan terlarut sebagian pada pelarut yang satu dengan
konsentrasi [xjidan sebagian lain terlarut pada pelarut ke dua [x]2. Bila terjadi
kesetimbangan distribusi diatara [x]i dan [xk maka mempunyai nilai tetapan
partisi (Ka), nilai K tetap pada temperature tetap. Hukum Nernst.
[X]1
---------= Kd
[X]2
Jika suatu solute mempunyai Ka = 1, pada pelarut A (fase A)/ pelarut B (fase B).
Sebanyak 1000 bagian solute terlarut dalam fase A kemudian larutan ini
dimasukkan ke dalam corong pisah, selanjutnya dimasukkan fase B volume
sama dengan volume fase A. Campuran digojok hingga terjadi kesetimbangan.
Karena K = 1, maka 500 bagian solute berada di fase A dan 500 bagian yang
lain berada di fase B. Selanjutnya campuran ini kita pindahkan ke tabung
pertama pada alat ekstraksi counter current dari Craig. Proses ekstraksi
dilanjutkan dengan selalu menambah pelarut baru (fresh solvent) setelah terjadi
kesetimbangan diantara kedua fase, fase atas dipindahkan ke no tabung
berikutnya yang sudah berisi fase bawah. Demikian seterusnya, maka suatu saat
solute akan terbawa terdistribusi ke nomor-nomor tabung lebih besar dan tidak
terdapat dalam tabung pertama lagi. Demikian dapat dijelaskan bagaimana
solute dapat terbawa oleh fase gerak berpindah ke nomor tabung lebih besar.
Bagaimana bila ada tiga solute yang mempunyai nilai Kd berbeda (misal:
Kd1=0,2; Kd2=1,0; Kd3=5) semua terlarut pada tabung pertama alat ekstraksi
counter current dari Craig ? Maka solute yang mempunyai nilai Ka terbesar
(solute dengan Kd 3) akan lebih cepat meninggalkan tabling pertama diikuti solute
dengan Kd 2 dan terakhir dengan Kd 1. Dengan demikian senyawa-senyawa dapat
dipisahkan berdasarkan perbedaan tetapan partisi (distribusi) antara dua pelarut
yang tidak campur (immiscible)
Mekanisme pemisahan secara adsorpsi
Mekanisme ini terjadi pada kromatografi dengan fase diam berbentuk padat,
sedangkan fase gerak dapat berbentuk cairan atau gas. Interaksi antara linarut,
fase diam dan fase gerak adalah terjadinya ikatan hidrogen. Sebagai misal kita
ambil contoh fase diam yang banyak digunakan adalah silika gel. Di permukaan
silikagel terdapat ujung-ujung gugus OH (OH bebas). Gugus inilah yang
menyebabkan silika gel bersifat polar. Bila ada senyawa polar (mempunyai
gugus OH, C=O atau adanya atom dengan pasangan elektron bebas) maka
akan terjadi ikatan hidroden antara molekul linarut dengan OH fase diam. Selain
interaksi itu ada juga interaksi terbentuknya ikatan hidrogen antara molekul fase
gerak dengan linarut dan antara malekul fase gerak dengan fase diam. Jika
interaksi fase diam dengan linarut lebih kuat dibandingkan interaksi yang lain,
maka fase diam tersebut tertahan (teradsorpsi) lebih lama pada fase diam.
Sebaliknya jika interaksi fase gerak dengan molekul linarut lebih kuat maka
linarut tersebut mudah terelusi. Maka terjadi persaingan mana lebih kuat ikatan
hidrogen yang terjadi antara molekul linarut dengan fase diam atau linarut
dengan fase gerak, karena perbedaan afinitas dengan fase diam inilah senyawasenyawa dapat dipisahkan antara satu dengan yang lain. Perbedaan affinitas
molekul-molekul linarut dengan fase diam inilah dasar mekanisme adsorpsi.
Mekanisme pemisahan secara eksklusi
Mekanisme ini juga disebut pemisahan secara jel permeasi. Digunakan
fase diam yang inert, oleh karena itu tidak ada interaksi lain misalnya adsorpsi
atau partisi. Molekul cuplikan akan berdifusi secara selektif kedalam fase diam
yang mempunyai pori-pori dengan ukuran tertentu. Sedangkan molekul yang
berukuran besar tidak dapat berdifusi, maka ia akan keluar kolom lebih awal dari
pada molekul yang berukuran kecil. Molekul kecil dapat masuk dalam fase diam
dan tertahan lebih lama. Fase diam yang digunakan adalah
Mekanisme pemisahan secara pertukaran ion
Pada awalnya kromatografi dengan mekanisme ini digunakan untuk
pemisahan unsur tanah jarang dan berbagai hasil pemecahan pada penelitian
energi atom. Kemudian setelah ditemukan dan dikembangkan resina polistirena,
penggunaan kromatografi penukar ion dapat mengatasi kesulitan pemisahan
pada senyawa biokimia.
Kromatografi ini menggunakan fase diam resin bermuatan. Dibedakan
dua macam resin yaitu resin penukar an ion dan resin penukar kation.
Mekanisme pemisahan dapat di lukiskan sebagai berikut :
a.
x- + r + y-
r- + r+x-
b.
X+ + r – y+
r+ + r-x+
a. Reaksi penukaran anion
b. Reaksi penukaran kation
x adalah ion cuplikan
y adalah ion fase gerak
r adalah bagian ion fase gerak
Reaksi diatas menunjukkan bahwa pada kromatografi penukar ion terjadi
persaingan antara ion fase gerak dengan ion cuplikan untuk berikatan dengan
bagian resin ion. Perbedaan kekuatan interaksi diantara ion cuplikan dengan
fase diam resina inilah komponen dapat dipisahkan. Jika senyawa terlarut
(cuplikan) berinteraksi kuat dengan bagian ionic resina maka senyawa tersebut
ditahan lebih lama didalam kolom, sedangkan senyawa terlarut berinteraksi
lemah dengan bagian ionic resina akan tidak ditahan lama oleh resina maka
akan keluar dari kolom lebih cepat.