materi dan metode

29
MATERI DAN METODE
Waktu dan Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2009 sampai dengan Mei
2010 di Pusat Studi Satwa Primata (PSSP) Institut Pertanian Bogor setelah
mendapatkan persetujuan dari Animal Care and Use Committee (ACUC) nomor
P.10-08-IR tanggal 20 Oktober 2008. Sebagian pemeriksaan laboratorium yaitu
pemeriksaan kadar peroksida lipid dan glutation jaringan mukosa lambung
dilakukan di laboratorium Departemen Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia.
Materi
Hewan Model
Penelitian ini menggunakan delapan ekor beruk (Macaca nemestrina)
jantan dewasa, berumur antara 4-6 tahun dengan bobot badan 5,5-7,5 kg (dengan
rerata 6,625±0,83 kg), yang berasal dari penangkaran PT. Wanara Satwa Loka.
Hewan model tersebut menjalani masa adaptasi dan dipelihara dalam kandang
individu. Pakan yang disediakan adalah monkey chow (dengan kandungan protein,
lemak, mineral, serat, karbohidrat, kalsium dan fosfat) serta buah-buahan,
sedangkan air minum disediakan secukupnya.
Bahan dan Alat-alat Penelitian
Untuk keperluan penelitian diperlukan berbagai peralatan sebagai berikut
ini:
1. Peralatan laboratorium dan bahan reagen yang dipergunakan untuk
pemeriksaan biokimia darah yang meliputi pemeriksaan protein total
(Ptot)/albumin (Alb)/globulin (Glob), bilirubin total (BT)/bilirubin direk
(BD)/bilirubin indirek (BI), serum glutamic oxaloacetic transaminase
(SGOT)/ serum glutamic pyruvic transaminase (SGPT), fosfatase alkali
(ALP), gamma glutamyl transpeptidase (GGT), kolinesterase (CHE), profil
lemak darah yang meliputi kolesterol total (KT) dan trigliserida (TG),
hemostasis yaitu pemeriksaan prothrombin time, kadar peroksida lipid mukosa
lambung dan kadar glutation mukosa lambung.
30
2. Endoskopi saluran cerna merek Olympus tipe Excera 160 beserta asesorinya
yang terdiri dari light source, video monitor, printer, suction pump dan forsep
biopsi.
3. Satu set peralatan bedah laparotomi lengkap dengan operating lamp, infusion
pump, pulse oxymeter, dan obat-obat anastesi yang terdiri dari ketamin dan
propofol, serta obat analgetik fentanil transdermal.
4. Cairan ivelip 20% yang merupakan cairan lipid esensial sebagai sumber PUFA.
Komposisi ivelip terdiri dari soybean oil, egg lecithins, gliserol dan natrium
oleat. Kandungan PUFA di dalam cairan ivelip 20% adalah asam linoleat
(54%) dan asam linolenat (8%), serta sisanya berupa mono-unsaturated fatty
acids (MUFA) yaitu asam oleat (26%) dan saturated fatty acids berupa asam
palmitat (9%) dan asam stearat (3%) (Consumer medicine information 2002).
Metode
Adaptasi
Hewan model dikondisikan dengan makanan standar serta air minum yang selalu
tersedia di dalam kandang individu. Setelah masa adaptasi dua minggu, dilakukan
pemeriksaan sampel darah perifer untuk pemeriksaan biokimiawi dan dilakukan
evaluasi makroskopik mukosa lambung dengan pemeriksaan endoskopi saluran
cerna bagian atas sekaligus mengambil sampel biopsi mukosa lambung untuk
pemeriksaan
peroksida
lipid
dan
glutation.
Selanjutnya
hewan
model
dikelompokkan menjadi 2 kelompok secara acak, masing-masing terdiri dari 4
ekor.
Pemeriksaan Endoskopi Saluran Cerna Bagian Atas
Pemeriksaan endoskopi saluran cerna bagian atas (SCBA) dilakukan dengan
memasukan (insersi) alat gastroskop melalui mulut, esofagus, lambung sampai
dengan duodenum, setelah beruk disuntik obat anestesi ketamin intramuskular
dengan dosis 10-30 mg/kg bobot badan dan propofol secara intravena dengan
dosis inisiasi 2,5-10 mg/kg bobot badan yang dilanjutkan dengan dosis
maintenance 0,3-0,6 mg/kg bobot badan/menit. Selama tindakan endoskopi,
dilakukan observasi secara makroskopik mukosa lambung disertai dengan
pengambilan sampel biopsi di korpus dan antrum lambung dengan menggunakan
31
alat forsep biopsi. Dilakukan pemotretan gambar mukosa lambung untuk
selanjutnya dicetak sebagai dokumentasi. Pemeriksaan endoskopi SCBA ini
diulang setiap 2 minggu sampai 8 minggu dengan prosedur pemeriksaan yang
sama.
Ligasi Duktus Koledokus
Setelah menjalani pemeriksaan endoskopi SCBA yang pertama dilanjutkan
dengan tindakan bedah laparotomi dengan anestesi yang sama yaitu ketamin
intramuskular dengan dosis 10-30 mg/kg bobot badan dan propofol secara
intravena dengan dosis inisiasi 2,5-10 mg/kg bobot badan yang dilanjutkan
dengan dosis maintenance 0,3-0,6 mg/kg bobot badan/menit. Dilakukan bedah
laparotomi melalui linea mediana dinding perut lapis demi lapis sampai ke dalam
rongga peritoneum. Setelah duktus koledokus diidentifikasi, dilakukan ligasi
duktus koledokus dengan lokasi distal dari duktus sistikus namun proksimal dari
duktus pankreatikus dengan menggunakan benang sutra. Dilakukan ligasi pada
dua titik dengan jarak kira-kira 1 cm, setelah itu dilakukan pemotongan di antara
kedua ikatan. Setelah diyakini tidak ada perdarahan, dilakukan penutupan dinding
perut lapis demi lapis. Tindakan bedah laparotomi ini dilakukan oleh sejawat
dokter hewan yang ahli dibidangnya dibantu oleh anggota tim yang lain.
Perlakuan
Kelompok I merupakan kelompok model ligasi duktus koledokus yang
diberi PUFA 4 minggu sesudah dilakukan ligasi duktus koledokus. Setelah
dilakukan pembiusan, dilanjutkan dengan pengambilan sampel darah sebanyak ±
25 ml dari pembuluh darah vena iliaka untuk pemeriksaan biokimiawi yang
meliputi Ptot, Alb, Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE, KT, TG
dan prothrombine time. Kemudian dilakukan pemeriksaan endoskopi SCBA
untuk evaluasi makroskopik mukosa lambung terhadap ada tidaknya erosi atau
ulkus sekaligus pengambilan sampel biopsi dua di korpus dan dua di antrum untuk
pemeriksaan peroksida lipid dan glutation. Setelah itu dilakukan bedah laparotomi
untuk pengikatan (ligasi) duktus koledokus (common bile duct), pada posisi distal
dari muara duktus sistikus namun proksimal dari muara duktus pankreatikus.
32
Pemeriksaan biokimiawi fungsi hati dan profil lemak darah (Ptot, Alb, Glob, BT,
BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE, KT, TG) dilakukan dengan
menggunakan teknik spektrofotometri, sedangkan pemeriksaan prothrombine time
menggunakan teknik foto optikal. Pemeriksaan kadar peroksida lipid mukosa
lambung
(dalam
hal
ini
dilakukan
dengan
memeriksa
kadar
malondialdehyde/MDA yang merupakan produk akhir dari peroksida lipid) dan
pemeriksaan kadar glutation mukosa lambung dilakukan dengan menggunakan
teknik spektrofotometri. Selain dilakukan pengamatan harian terhadap hewan
model, dilakukan pengamatan berkala setiap 2 minggu yang meliputi pemeriksaan
bobot badan dan endoskopi SCBA untuk pengamatan makroskopik mukosa
lambung dan pengambilan sampel biopsi di korpus dan di antrum untuk
pemeriksaan peroksida lipid dan glutation serta pemeriksaan laboratorium
biokimiawi darah. Setelah pengamatan berkala yang kedua (4 minggu pasca ligasi
duktus koledokus) diberikan PUFA intravena 2 g/hari setiap hari. Pengamatan
berkala setiap 2 minggu dilanjutkan sampai 8 minggu pasca ligasi
duktus
koledokus. Selanjutnya dilakukan eutanasia pada semua hewan model.
Kelompok II merupakan kelompok model ligasi duktus koledokus yang
diberi PUFA sejak awal dilakukan ligasi duktus koledokus. Setelah dilakukan
pengambilan sampel darah untuk pemeriksaan biokimiawi yang meliputi Ptot, Alb,
Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE, KT, TG dan prothrombine
time, kemudian dilakukan pemeriksaan endoskopi saluran cerna bagian atas
(SCBA) untuk evaluasi makroskopik mukosa lambung terhadap ada tidaknya
erosi atau ulkus sekaligus pengambilan sampel biopsi dua di korpus dan dua di
antrum untuk pemeriksaan peroksida lipid dan glutation. Setelah itu dilakukan
bedah laparotomi untuk ligasi duktus koledokus, pada posisi distal dari muara
duktus sistikus namun proksimal dari muara duktus pankreatikus. Sejak dilakukan
ligasi duktus koledokus, diberikan PUFA intravena setiap hari dengan dosis 2
g/hari. Selain dilakukan pengamatan harian terhadap hewan model, dilakukan
pengamatan berkala setiap 2 minggu yang meliputi pemeriksaan bobot badan dan
endoskopi SCBA untuk pengamatan makroskopik mukosa lambung dan
pengambilan sampel biopsi di korpus dan di antrum untuk pemeriksaan peroksida
lipid dan glutation serta pemeriksaan laboratorium biokimiawi darah sampai 8
33
minggu pasca ligasi duktus koledokus. Selanjutnya dilakukan eutanasia pada
semua hewan model.
Analisis Data
Peubah-peubah yang diamati terdiri dari nilai biokimiawi fungsi hati (Ptot,
Alb, Glob, BT, BD, BI, SGOT, SGPT, ALP, GGT, CHE), KT, TG, prothrombine
time, peroksida lipid dan glutation mukosa lambung serta evaluasi makroskopik
mukosa lambung berupa ada tidaknya erosi atau ulkus dengan pemeriksaan
endokopi SBCA pada hewan model sejak sebelum dilakukan ligasi duktus
koledokus sampai 8 minggu setelah ligasi duktus koledokus.
Data yang didapat dianalisis statistik secara deskriptif dan analisis ragam
(ANOVA) tersarang (nested). Interpretasi didasarkan pula pada nilai rerata dan
koefisien keragaman. Apabila hasil analisis ragam menunjukan perbedaan yang
bermakna (P<0,05 atau P<0,01) maka dilanjutkan dengan uji jarak pada periode
pengamatan (uji Tukey).
Persamaan yang digunakan untuk analisis deskriptif dan uji keragaman
adalah:
Rerata ( )
Simpangan Baku ( )
–
Koefisien Keragaman (
Derajat bebas (DB)
)
34
Jumlah kuadrat (JK)
Dengan
= rerata pengamatan ke
= rerata semua pengamatan
= nilai pengamatan ke dan faktor ke
Kuadrat tengah (KT)
F hitung
Uji Tukey
Dengan:
= rerata pengamatan faktor ke
= rerata pengamatan faktor ke
= jumlah pengamatan ke
= jumlah pengamatan ke
= jumlah level
= simpangan baku
= persentil dengan distribusi
dan derajat bebas