Skrining Hasil Transformasi Gen β–1,3

ISBN 979-98109-0-6
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
Surabaya, 30 Agustus 2003
========================================================
Skrining Hasil Transformasi Gen β–1,3-endoglukanase ke dalam Tanaman
Tembakau Besuki H382 dengan Perantara
Agrobacterium tumefaciens
Y. Sri wulan Manuhara1), Issirep Sumardi 2), Sismindari Sudjadi 3), Taryono4), Widodo5)
1) Fakultas MIPA Biologi Universitas Airlangga,
2) Fakultas Biologi Univesitas Gadjah Mada,
3) Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada,
4) Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada,
5) Fakultas Pertanian Universitas Wijaya Kusuma
ABSTRAK
Karakteristik tanaman setelah proses transformasi adalah langkah yang sangat
penting untuk membuktikan keberhasilan suatu proses tranformasi, oleh karena itu
diperlukan metode skrining populasi tanaman transgenik secara akurat. Metode seleksi
pada medium yang mengandung kanamisin adalah metode awal yang dapat digunakan
untuk mengindentifikasi tanaman yang diduga membawa gen β-1,3-endoglukanase yang
ditransformasikan ke dalam tanaman, karena gen tersebut dibawa oleh vector biner
pROK1a-EG yang dilengkapi dengan gen nptll yang mengekspresikan enzim neomycin
phosphotransferase untuk difat ketahanan tanaman terhadap antibiotika kanamisin.
Konsentrasi kanamisin yang digunakan untuk skrining transforman ditentukan
dengan cara menumbhkan eksplan daun tembakau Besuki H382 pada medium MS
ditambah zat pengatur tumbuh NAA 1 mg/L, BA 3 mg/L, sukrosa 30 g/L serta berbagai
konsenrasi kanamisin (0,50,100,200) mg/L. Konsentrasi kanamisin yang mampu
menonaktifkan pertumbuhan eksplan daun tembakau selanjutnya digunakan untuk
menyeleksi hasil transformasi gen β-1,3 endoglukanase ke dalam eksplan daun tembakau
dengan perantara Agrobactorium tumefaciens LBA4404.
Pada pemberian kanamisin 50 mg/L eksplan tembakau mampu tumbuh membentuk
kalus maupun tunas, sedangkan pada pemberian kanamisin100 mg/L dan 200mg/L eksplan
tidak mampu membentuk kalus maupun tunas dan menunjukan gejala kematian. Pada
minggu ke 5 sebanyak 75,8% eksplan mati. Selanjutnya konsentrasi kanamisin 100 mg/L
digunakan untuk skrining transforman. Dari hasil transformasi diperoleh 29 tunas yang
mampu tumbuh pada medium seleksi dri 106 eksplan yang ditransformasi, sehingga
diperoleh efesiensi transformasi sebesar 27,36%.
PENDAHULUAN
Tanaman tembakau adalah tanaman model
yang banyak digunakan oleh peneliti untuk
berbagai macam percobaan karena tingginya
kemampuan regenerasi tananman ini baik
secara konvensional maupun secara in vitri.
Kegunaan tanaman inipun juga tidak kalah
pentingnya dengan tanaman budidaya lain
karena peranannya dalam menunjang industri
rokok. Tetapi dalam prosses budidayanya
tanaman ini banyak mengalami gangguan baik
berupa hama maupun penyakit. Salah satu
penyakit yang banyak menimbulkan kerugian
adalah penyakit lanas yang disebabkan oleh
jamur Phytophtoranicotianae. Jamur ini
menyerang bibit dan tanaman dewasa. Bagian
tanaman yang diserang adalah leher akar
Y Sri Wulan Manuhara
sehingga
menjadi
hitam
lalu
kering,
selanjutnya daun tembakau menjadi layu
seperti disiram air panas. Akhibat penyakit ini
dapat menurunkan produksi hingga 50%.
Pengendalian secara kimiawi dirasakan
kurang efektif, terlalu mahal bagi petani, dan
residu yang tertinggal pada daun atau biji
tanaman
berbahaya
bagi
konsumen.
Pemuliaan
secara
konvensional
untuk
mendapat varietas berdaya hasil tinggi dan
tahan penyakit memerlukan waktu yang lama
dan dapat membawa karakter tak diinginkan
dari tetua donor. Salah satu alternatif
pemecahan masalah tersebut adalah dengan
rekayasa genetika untuk mengintroduksi gen
anti jamur ke dalam genom tanaman sehingga
dihasilkan tanaman yang toleran terhadap
serangan jamur.
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
ISBN 979-98109-0-6
Surabaya, 30 Agustus 2003
========================================================
Gen
β-1,3-endoglukanase
terbukti
Dalam penelitian ini digunakan bibit tanaman
tembakau (Nicotiana tabacum var. Besuki
memberikan ketahanan terhadap jamur
patogen
Botrytis
cinerea,
Sclerotinia
H382) Nicotiana tabacum var. Besuki H382)
sclerotiorium (Terakawa et al., 1997;
yang memperoleh dari PTPN X Jember.
Nakamura et al.1999), Phytopthora nicotianae
Eksplan tembakau yang digunakan adalah
(Yhosikawa, 1993), serta jamur Rhizoctonia
daun hasil seedling yang berumur 30 hari.
solani.
Beberapa
peneliti
melaporkan
Agrobacterium
yang
digunakan
adalah
Agrobacterium tumefaciens starin LBA4404
usahanya merakit tanaman toleran terhadap
jamur menggunakan gen kitinase dan β-1,3yang membawa vector biner pROK1a-EG
endoglukanase.
Lin
et
al.
(1995)
(Yoshikawa et al., 1993) yang diperoleh dari
mentransformasi tanaman padi menggunakan
Dr. Yoji Takeuchi, Division of Biological
gen kitinase dan padi transforman berpotensi
Sciences, Hokaido University, Sapporo,
meningkat resistensinya terhadap infeksi
Jepang.
jamur. Yoshikawa (1993), Ito et al. (1994) ito et
al.(1995) dan Nakamura et al. (1999) telah
Untuk uji resistensi digunakan jamur
Phytophtora nicotianae yang diisolasi dari
berhasil mentransfer gen β-1,3-endoglukanase
kedalam tanaman terong (egg-plant) dan buah
tanaman tembakau yang terinfeksi jamur
kiwi,
serta
mampu
mengekspresikan
tersebut.
ketahanan
tanaman
tersebut
terhadap
Prosedur Penelitian
penyakit akhibat jamur patogen. Dasar
keberhasilan transformasi genetik adalah
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap
kemampuan sel target untuk berkembang
sebagai berikut.
menjadi tanaman utuh yang identik dengan
Tahap 1. Optimasi konsentrasi kanamisin
induknya, kecuali dalam hal sifat baru dari gen
untuk seleksi transforman.
yang disisipkan. Teknik kultur jaringan
tanaman
membuka
peluang
untuk
Konsentrasi kanamisin yang akan digunakan
menyediakan sel target yang terdapat dalam
untuk seleksi transforman ditentukan terlebih
organ tanaman (daun, batang, hipokotil dan
dahulu dengan cara menumbuhkan daun
kotiledon), kalus atau kultur suspensi sel dan
tanaman tembakau dalam medium MS
bahkan protoplas. Sel-sel ini dapat diinduksi
ditambah zat pengatur NAA 1 mg/L, BAP3
untuk berkembang menjadi tanaman baru
mg/L dan variasi kanamisin 0 mg/L, 50 mg/L,
melalui inisiasi pembentukan tunas baru atau
100 mg/L dan 200 mg/L.
melalui embriogenesis. Secara in vitro
Tahap
2.
Transformasi
gen
β-1,3tanaman tembakau telah banyak digunakan
endoglukanase kedalam eksplan daun
untuk berbagai keperluan pengujianaena
tembakau
tanaman tersebut dapat dengan mudah
diregenerasi membentuk tanaman utuh sesuai
a. Persiapan eksplan
dengan induknya.
Sebagai bahan transformasi digunakan daun
Karakterisasi tanaman setelah transformasi
tembakau yang di prekultur dalam medium
PCM (Pre Cultur Medium) selama 2 hari.
adalah langkah yang sangat penting untuk
membutikan keberhasilan transformasi, oleh
Medium PCM terdiri dari medium Murashige
karena itu diperlukan penerapan metode
and Skoog (MS) (Murashige & Skoog, 1962)
skrining populasi tanaman transgenik secara
ditambah BAP 3 mg/L, NAA 1 mg/L.
akhurat. Metode seleksi kanamycin adalah
b. Transformasi
metode awal yang dapat digunakan untuk
Sebelum
dilakukan
transformasi
perlu
disiapkan dahulu Agrobacterium tumefaciens
mengidentifikasi
tanaman
yang
diduga
membawa gen β-1,3-endoglukanase yang
yang membawa vector biner pROK1a-EG
ditransformasikan
ke
dalam
tanaman
dengan cara menumbuhkannya dalam
tembakau, karena gen β-1,3-endoglukanase
medium LB cair yang mengandung kanamisin
dibawa oleh vector biner pROK1a-EG yang
50 mg/L dan diinkubasi selama 24 jam. Daun
dilengkapi
dengan
gen
nptll
yang
tembakau yang telah dipre-kultur selama 2
mengekspresikan
enzim
neomycin
hari, direndam (cocultur) dalam kultur A,
phosphotrnasferase untuk sifat ketahanan
tumefaciens pROK1a-EG yang diencerkan
tanaman terhadap kanamycin.
dengan medium MSO (MS tanpa zat pengatur
tumbuh) dengan perbandingan 1:10. Setelah
METODE PENELITIAN
itu eksplan dipindahkan kedalam medium
LSM (Low Selective Medium) dengan
Bahan Penelitian
komposisi medium MS ditambah BAP 3 mg/L,
NAA 1 mg/L, kanamisin hasil uji optimasi dan
Y Sri Wulan Manuhara
ISBN 979-98109-0-6
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
Surabaya, 30 Agustus 2003
% Eksplan yang hidup
========================================================
cefotaxin 300 mg/L, kemudian diinkubasi
0
selama 2 hari pada suhu 25 C dengan
HASIL DAN PEMBAHASAN
cahaya lampu TL 20 Watt secara terus
menerus. Setelah 2 hari dalam medium LSM
eksplan dipindahkan kedalam medium SIM
Uji optimasi konsentrasi kanamisin untuk
(Shoot Induction Medium). Setiap 2 minggu
seleksi keberhasilan transformasi gen β-1,3dilakukan sub-kultur.
endoglukanase ke dalam eksplan daun
Parameter yang diamati adalah pertumbuhan
tembakau dilakukan dengan menghitung
dan perkembangan eksplan membentuk
persentase eksplan yang hidup pada
planlet. Planlet yang tumbuh dalam medium
berbagai konsentrasi kanamisin disajikan
yang mengandung kanamisin 100 mg/L
pada gambar 1 dan gambar 2.
diduga transforman, sedangkan yang mati
adalah non-tranforman.
120
100
0 mg/l
80
50 mg/l
60
100 mg/l
40
200 mg/l
20
0
1
2
3
4
5
Gambar 1. Persentase eksplan tembakau
hidup pada berbagai konsentrasi kanamisin
Umuryang
(minggu)
A
C
B
D
Gambar 2. Pertumbuhan eksplan daun tembakau umur 8 minggu pada berbagai konsentrasi
kanamisin. (A) tanpa kanamisin, (B) kanamisin 50 mg/L, (C) kanamisin 100 mg/L, (D) kanamisin 200
mg/L
Y Sri Wulan Manuhara
ISBN 979-98109-0-6
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
Surabaya, 30 Agustus 2003
========================================================
Skrining hasil transformasi gen β-1,3endoglukanase kedalam daun tembakau H382
dengan perantara Agrobacterium tumefaciens
dalam medium seleksi yang mengandung
kanamisin 100 mg/L disajikan pada tabel 1
dan gambar 2.
Tabel 1. Efisiensi transformasi gen β-1,3-endoglukanase kedalam daun tembakau H382 dengan
perantara Agrobacterium tumefaciens
Jenis kultivar tembakau
Jumlah eksplan yang
membentuk tunas (%)
Jumlah tunas resisten
kanamisin(%)
Besuki H382
98/106 (92,45)
29(27,360
B
A
A
C
D
Gambar 3. Transformasi gen β-1,3-endoglukanase kedalam daun tembakau, regenerasi tunas dan
skrining transforman dalam medium seleksi yang mengandung kanamisin. A. Tanaman tembakau
umur 8 minggu, B. Regenerasi tunas dari eksplan daun tembakau setelah transformasi, C.
Regenerasi tunas daun tembakau tanpa transformasi, D. Tunas resisten kanamisin (tanda panah)
Dari gambar 1 tersebut diatas terlihat bahwa
konsentrasi
kanamysin
mempengaruhi
pertumbuhan eksplan hipokotil kubis. Pada
konsentrasi kanamycin 50 mg/l sedikit
mempengaruhi pertumbuhan eksplan daun
tembakau dibanding kontrol, karena pada hari
ke 21 sebagian besar eksplan masih hidup.
Pengalaman secara diskriptif menunjukan
eksplan mampu tumbuh menjadi kalus dan
tunas, tetapi tunas yang terbentuk tidak
Y Sri Wulan Manuhara
sebanyak pada kontrol. Bahkan pada satu
eksplan dapat membentuk akar. Hal ini berarti
bahwa eksplan mampu beradaptasi pada
medium seleksi yang mengandung kanamisin
50 mg/l sehingga konsentrasi kanamisin 50
mg/l tidak dapat digunakan untuk menyeleksi
hasil
transformasi.
Pada
konsentrasi
kanamycin 100 mg/l dan 200 mg/l semua
eksplan masih hidup sampai hari ke 7, tetapi
pada hari ke 14 beberapa ekspan menunjukan
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
ISBN 979-98109-0-6
Surabaya, 30 Agustus 2003
========================================================
gejalakematian
yang
ditandai
dengan
membentuk kalus maupun tunas, sedangkan
perubahan warna pada daun yang semula
pada pemberian kanamisin 100 mg/L dan 200
hijau berubah menjadi kuning. Pada kedua
mg/L eksplan tidak mampu membentuk kalus
konsentrasi kanamisin tersebut eksplan tidak
maupun tunas dan menunjukan gejala
sama sekali mampu tumbuh menjadi kalus
kematian. Pada minggu ke 5 sebanyak 75,8%
maupun tunas. Hal ini berarti bahwa tingginya
eksplan
mati.
Selanjutnya
konsentrasi
konsentrasi kanamisinmenghambat terjadinya
kanamisin 100 mg/L digunakan untukskrining
pembelahan sel pada eksplan daun tembakau
transforman. Dari hasil transformasi diperoleh
sehingga sel tidak mampu berdiferensiasi
29 tunas yang mampu tumbuh pada medium
membentuk kalus maupun tunas. Medium
seleksi dari 106 eksplan yang ditransformasi,
seleksi yang mengandung kanamisin 100 mg/l
sehingga diperoleh efisiensi transformasi
dan 200 mg/l dapat digunakan untuk
sebesar 27,36%.
menyeleksi hasil transformasi, tetapi menurut
Gatehouse et al., 1992 menyatakan bahwa
DAFTAR PUSTAKA
beberapa
faktor
dapat
mempengaruhi
kemampuan atau efektifitas bahan kimia yang
Chen, D.H., C.J. Liu, H.C. Ye, G.F. Li, B.Y.
digunakan untuk seleksi. Bahan-bahan
Liu, Y.L. Meng, X.Y. Chen, 1999. Ri
penyeleksi tersebut bersifat toksik untuk sel
mediated transformation of Ertemisia
tanaman. Jadi toksin yang paling efektif adalah
annua with a recombinant farbesyl
toksin yang menghambat pertumbuhan sel-sel
diphosphate
synthase
gene
for
nontransforman
secara
berlahan-lahan.
artemisin production. Plant, Cell, tissue
Tekanan seleksi akan optimal apabila
and Organ Culture 57:157-162.
menggunakan konsentrasi toksin yang paling
Hartana, I. 1978. Budidaya Tembakau Cerutu.
rendah yang mampu membunuh jaringan
Balai Penelitian Perkebunan Jember.
nontransforman. Berdasarkan hal tersebut
Hiei, Y., S. Okta, T. Komari, T. Kumashiro,
maka konsentrasi kanamisin yang digunakan
1994. Efficient transformationof rice
(Oryza
sativa
L.)
mediated
by
untuk uji seleksi keberhasilan transformasi
Agrobacterium and sequence analysis
pada eksplan daun tembakau adalah 100 mg/l.
of the boundaries of T-DNA. The plant
Dari tabel 1. di atas diperoleh bahwa
journal 6 (2):271-282.
keberhasilan
transformasi
gen
β-1,3endoglukanase
kedalam
eksplan
daun
Gatehouse, A.M.R, V.A. Hilder and D. Boulter,
1992. Plant Genetic manipulation for
tembakau adalah 27,36 % dengan konsentrasi
Crop Protection, C A B International,
kanamisin 100 mg/l dalam medium MS
sebagai medium seleksi transforman dapat
United Kingdom.
ditentukan tunas yang diduga transforman
Ito, S., K. Inaba, T. Masumura, T. Tanaka, Y.
dengan cara menghitung eksplan yang
Takeuchi,
M.
Yoshikawa,
1994.
mampu membentuk tunas hidup. Hal ini berarti
Production of transgenic egg-plant with
soybean β-1,3-endoglucanase. Breed
bahwa tunas yang mampu tumbuh normal
diduga telah tersisipi gen nptll yang
Sci 44 (Suppl 2):43.
menyebabkan
tanaman
mampu
Ito, S., T. Fukhunisi, K. Inaba, T. Masumura, T.
menonaktifkan antibiotika kanamisin. Efisiensi
Tanaka, Y. Takeuchi, M. Yoshikawa,
transformasi pada eksplan daun tembakau
1995. Disease resistance of transgenic
yang diperoleh cukup tinggi (27,36)bila
eggplant
with
soybean
β-1,3endoglucanse. Breed Sci 45 (Suppl2):
dibanding dengan transformasi pada tanaman
lain
dengan
perantara
Agrobacterium
106.
tumefaciens, seperti pada gerbera 0,58%
Lin, W., C.S. Anuratha, K. Datta, I Potrykus,
(Elomaa et al.,1993),Oryza sativa 23% (Hiei et
Muthukrishnan & S.K. Datta, 199.
al., 1994), apel 5%(De Bondt et al., 1996),
Genetic engineering of rice for
Vigna unguiculata L. Walp 12% (Muthukumar,
resistance
to
sheath
bligth.
1996), Artemisia annua 10,7% (Chen et
Biotechnology 13:686-691.
al.,1999), Brassica campestris ssp. 3,64%
Muthukumar, B., M. Mariama, K. Veluthambi,
(Xianget al., 2000).
A. Gnanam, 1996. Genetic transformtion
of cotyledon explant of cowpea (Vigna
KESIMPULAN
unguiculata
L.
Walp)
using
Agrobacteriumtumefaciens. Plant Cell
Reports 15:980-985.
Dari hasil penelitian ini dapat disimpulkan
bahwa pemberian kanamisin 50 mg/L pada
Nakamura Y, sawada S, Kobayashi S,
medium seleksi, eksplan tembakau mampu
Nakajima l, Yoshikawa M, 1999.
Y Sri Wulan Manuhara
Page 69
Prosiding Seminar Nasional Biologi I
ISBN 979-98109-0-6
Surabaya, 30 Agustus 2003
========================================================
transformation of Brassica campestris
Expression
of
soybean
β-1,3ssp. Parachinensis with synthetic
endoglucanase cDNA and effect on
Baccilus thuringiensis cry1AB and
disease tolerance In kiwifruit plants.
Plant Cell Report18:527-532.
cry1Ac genes. Plant Cell Reports
19:251-256.
Takeuchi, Y., M. Yoshikawa, G. Takeba, K.
Tanaka, D. Shibata, O. Horino, 1990.
Yoshikawa, M., N.T. Keen and M,C. Wang,
Molecular cloning and ethilene Induction
1983.
A
receptor
on
soybean
of mRNA encoding a phytoalexin
membranes for a fungal elicitor of
phitoalexin accumulation. Plant Physiol.
elicitor-releasing
factor,
β-1,3endoglucanase, in soybean. Plant
73:49-52.
Physiol 93:673-682.
Yoshikawa, 1993. Resistance to fungal
Terakawa, T., N. Takaya, H. Horiuchi, and M.
disease in transgenic tobacco plants
Koike, 1997. A fungalchitinase gene
expressing tje phytoalexin elisitorfrom
Rhizopusoligosporus
confers
releasing factor, β-1,3-endoglucanase,
from soybean. Naturwissenschaften
antifungal activity to transgenic tobacco.
Plant Cell Rep. 16:439-443.
80:417-420.
Xiang, Y., W.K.R. Wong, M.C. Ma, R.S.C.
wong, 2000. Agrobacterium-mediated
Y Sri Wulan Manuhara
Page 69