EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY
advertisement
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2 SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Lela Francisca Adi Liana NIM : 138114154 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN JUDUL EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2 SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh : Lela Francisca Adi Liana NIM : 138114154 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 i PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI iv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI v PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI HALAMAN PERSEMBAHAN Saya persembahkan skripsi ini untuk: Tuhan Yesus Kristus Kedua orang tuaku Sahabat dan teman-teman Angkatan farmasi 2013 Dan Almamaterku, Universitas Sanatha Dharma vi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PRAKATA Puji dan syukur kepada Tuhan Yesus Kristus atas segala berkat, serta penyertaan yang dilimpahkan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “EKSTRAK METANOLIK DAUN ROSEMARY (Rosmarinus officinalis L.) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF TERHADAP SEL KANKER SERVIKS (HeLa) MELALUI REGULASI Bcl-2” sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar sarjana Farmasi (S.Farm.) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penyeleseaian skripsi ini tentunya tidak lepas dari bantuan berbagai pihak, baik secara langsung maupun tidak langsung. Oleh karena itu penulis hendak mengucapkan terimakasih kepada: 1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Sanata Dharma. 2. Ibu Dr. Riris I. Jenie, M.Si., Apt. selaku dosen pembimbing utama atas segala bimbingan, waktu dan kesabaran yang telah diberikan untuk memberi masukan, dukungan, saran, dan motivasi kepada penulis dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. 3. Ibu Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt., dan Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan masukan dan saran yang sangat berharga dalam penyusunan skripsi ini. 4. Ibu Agustina Setiawati M.Sc., Apt. dan Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing akademik penulis atas pendampingan, bimbingan, arahan serta dukungan kepada penulis selama ini. 5. Dr. Dewi Setyaningsih S.Si., Apt., M.Sc. yang telah memberikan ijin dalam penggunaan laboratorium dan fasilitas guna menunjang penelitian. 6. Bapak Wagiran selaku laboran Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas segala bantuan dan dukungan yang diberikan serta dinamika di laboratorium selama melakukan penelitian. 7. Prof. dr. Supargiyono, Ibu Atin selaku supervisor dan teknisi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Umum Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang telah membantu dan membimbing selama melakukan penelitian. vii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 8. Seluruh Dosen dan Karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta atas ilmu serta bimbingan yang dibagikan. 9. Keluarga terkasih, Bapak, Ibu, adek yang selalu mendoakan, mendukung, dan memberi semangat dalam setiap proses perjalanan penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan studi dengan tepat waktu. 10. Saudara dan saudari saya yang terkasih Mbak Viona dan Mbak Antik yang selalu mendukung dan menyemangati penulis. 11. Sahabat seperjuangan dalam penelitian Bcl-2: Fira Elsa Septiana dan Maria Nareswari atas segala dinamika, kebersamaan, dukungan serta semangat agar dapat mengenakan toga bersama tepat waktu. 12. Sahabat-sahabat penulis Abraham, Upik, Lala, Kak Tika, Futuristic (Reny, Ivan, Rosa, Galih), Geng metropolitan, atas kebersamaan, dukungan, dan selalu menjadi tempat berbagi suka dan duka bagi penulis. 13. Teman – teman FSM D 2013 dan FKK C 2013, serta angkatan 2013 atas kebersamaan yang indah. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih banyak kekurangan, maka penulis mengharapkan kritik dan saran dari semua pihak yang membangun sehingga membuat karya yang lebih baik. Penulis mohon maaf atas segala kesalahan dan kekurangan yang terdapat dalam skripsi ini. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak. Yogyakarta, 28 Januari 2017 Penulis viii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR ISI HALAMAN JUDUL................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ..................................................... iii PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... iv LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI.................................................. v HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. vi PRAKATA .................................................................................................. vii DAFTAR ISI ............................................................................................... ix DAFTAR TABEL ....................................................................................... x DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xi DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................... xii ABSTRAK .................................................................................................. xiii ABSTRACT .................................................................................................. xiv PENDAHULUAN ...................................................................................... 1 METODE PENELITIAN ............................................................................ 2 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................... 7 KESIMPULAN ........................................................................................... 14 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 15 LAMPIRAN ................................................................................................ 18 BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 29 ix PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR TABEL Tabel I. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode flowcytometry ..................... 12 Tabel II. Perhitungan Ekspresi Bcl-2 ........................................................... 14 Tabel III. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Cisplatin .. 23 Tabel IV. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Rosemary............................................................... 23 x PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR GAMBAR Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis ............... 9 Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin pada sel kanker serviks HeLa ..................................................... 9 Gambar 3. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menginduksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa................ 11 Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker serviks HeLa .............. 13 Gambar 5. Tanamanan rosemary dan serbuk daun rosemary ....................... 21 Gambar 6. Ekstraksi dengan refluks dan pemekanatan dengan vaccum rotary evaporator ........................................................................ 21 Gambar 7. Ekstrak metanol daun rosemary .................................................. 21 xi PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun rosemary . 19 Lampiran 2. Surat ethical clearance ........................................................ 20 Lampiran 3. Ekstrak metanol daun rosemary dan alat yang digunakan .. 21 Lampiran 4. Seri konsentrasi cisplatin dan ekstrak ................................. 22 Lampiran 5. Tabel viabiltas sel kanker serviks HeLa .............................. 23 Lampiran 6. Hasil analisis flowcytometry ................................................ 24 Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa . 27 xii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRAK Kanker serviks memiliki karakter ekspresi protein Bcl-2 berlebih sehingga dapat menghambat proses apoptosis. Salah satu pengobatan standar pada kanker serviks dengan menggunakan cisplatin, namun dewasa ini, meningkatnya resistensi cisplatin sering menyebabkan kegagalan pada kemoterapi. Salah satu tanaman yang sudah banyak diteliti di berbagai sel kanker dan memiliki aktivitas antikanker adalah daun rosemary (Rosmarinus officinalis L.) yang diekstraksi menggunakan metanol. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efek pemberian ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa. Penelitian awal dilakukan untuk mengetahui penghambatan viabilitas sel dengan menggunakan metode MTT, dilanjutkan dengan uji flowcytometry untuk mengetahui potensi ekstrak metanol daun rosemary dalam menginduksi apoptosis. Ekspresi protein Bcl-2 dianalisis menggunakan metode imunositokimia. Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak metanol daun rosemary memiliki efek sitotoksik lemah dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL, dan jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks. Berdasarkan hasil tersebut, perlu penelitian lebih lanjut mengenai potensi kemoprevensi ekstrak metanol daun rosemary dalam meregulasi protein lainnya pada induksi apoptosis. Kata kunci: Kanker serviks, Bcl-2, Rosmarinus officinalis L., Sel HeLa. xiii PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI ABSTRACT Cervical cancer has a character of Bcl-2 protein over expression that can be inhibit apoptosis. The standard treatment for cervical cancer using cisplatin, yet nowaday, the increase of cisplatin resistence often lead to the failure of chemotherapy. One of plants that has been widely studied in various cancer cells and having anticancer activity is the leaves of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) which is extracted using methanol. The aim of this study was to determine the effect of rosemary leaves methanol extract against HeLa cervical cancer cells. The initial research was conducted to determine cell viability using MTT, followed by a test using a flowcytometry to detect cells undergo apoptosis. The expression of the Bcl-2 protein was analyzed using immunocytochemistry. The cell viability assay results shows that methanol extract of rosemary leaves have a lower cytotoxic effect on 50% inhibitory concentration (IC50) of 320 µg/mL, the cell death pathway on ½ IC50 shows the amount of apoptotic cells are 27% using a flowcytometry with 24 hours incubation period. Immunocytochemistry showed that the methanol extract of rosemary leaves potentially suppress the expression of the Bcl-2, so the possibility induction of apoptosis mediated by suppress the expression of the Bcl-2 protein in cervical cancer cells. Based on this result, further research is needed on the chemoprevention potential of rosemary leaves methanol extract on the regulation of other proteins in inducing apoptosis. Keywords: Cervical cancer, Bcl-2, Rosmarinus officinalis L., HeLa cells. xiv PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PENDAHULUAN Kanker menjadi salah satu penyebab kematian yang utama di seluruh dunia. Jumlah kasus baru terkait kanker diperkirakan akan meningkat menjadi 70% selama dua dekade ini. Kanker serviks merupakan jenis kanker paling umum kedua yang terjadi pada wanita di Indonesia (IARC, 2015). Kanker serviks sebagian besar disebabkan oleh human papillomavirus (HPV), penyebaran infeksi oleh virus tersebut sebagian besar melalui hubungan seksual. Ibeanaum (2011) mengatakan bahwa DNA onkogenik ditemukan dalam 95% HPV penyebab kanker serviks. Infeksi HPV pada sel kanker serviks HeLa berikatan dengan tumor suppressor protein p53, dimana p53 ekspresinya tertekan (Goodwin dan DiMaio, 2000). Penekanan p53 akan menginduksi protein anti-apoptosis B cell lymphoma-2 (Bcl-2) sehingga jumlah protein anti-apoptosis berlebih dan menyebabkan kemampuan sel untuk apoptosis menurun sehingga memicu terjadinya kanker. Dengan demikian, Bcl-2 dapat menjadi salah satu target molekuler dalam penemuan pengobatan kanker serviks. Usaha pengobatan kanker sudah banyak dilakukan, namun sampai saat ini belum ditemukan obat yang mengatasi kanker secara memuaskan. Kemoterapi menggunakan cisplatin dan 5-flurourasil (5-FU) adalah salah satu strategi untuk pengobatan kanker serviks (American Cancer Society, 2015). Pengobatan tersebut memiliki keterbatasan yaitu dewasa ini penggunaan cisplatin sudah resisten. Resistensi cisplatin menyebabkan kegagalan pada kemoterapi, dan peningkatan dosis cisplatin tidak terbukti efektif karena pasien akan mengalami dose-dependent toxicity (Leisching, dkk., 2015). Menurut Hemaiswarya dan Doble (2013), pengobatan mengunakan 5-FU belum cukup efektif dalam melawan kanker serviks. Oleh karena itu, dibutuhkan agen kemoprevensi yang selektif terhadap kanker serviks. Kemoprevensi merupakan suatu langkah untuk mencegah, menunda, ataupun melawan perkembangan sel kanker dengan menggunakan bahan alam, sintetik, atau kombinasi dari keduanya. Mekanisme utama dalam menghambat karsinogenesis yaitu dengan menghambat aktivasi karsinogen dan induksi sitokrom. Dari studi yang telah dilakukan selama empat dekade terahir ini, banyak target molekul yang terbukti dihambat oleh agen kemopreventif. Salah satu target molekul yang dihambat yaitu protein antiapoptosis seperti Bcl-2 (Sharma, 2012). Daun rosemary yang diekstraksi menggunakan metanol mengandung berbagai senyawa kimia antara lain asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat, yang 1 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI mempunyai khasiat sebagai antikanker (Abe, dkk., 2002). Ekstrak metanol daun rosemary telah ditemukan untuk menghambat proliferasi sel kanker seperti kanker paru-paru dengan nilai IC50 sebesar 24,08 μg/mL, kanker payudara dengan nilai IC50 sebesar 20,42 μg/mL, dan kanker hati dengan nilai IC50 sebesar 22,88 μg/mL (Yesil-Celiktas, dkk., 2010). Menurut Anggraeni (2015) ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan efek sitotoksik pada sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 13,95 μg/mL dan mampu menginduksi apoptosis 19,68%. Asam betulinat pada sel kanker serviks HeLa juga memiliki aktivitas antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar 30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis (Xu, dkk., 2014). Menurut Yim dkk. (2006) asam ursolat sebesar 15 μM mampu menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa, serta menginduksi apoptosis. Berdasarkan data diatas, maka menarik untuk diteliti lebih lanjut mengenai pengembangan daun rosemary sebagai agen kemopreventif pada kanker serviks HeLa. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa terkait aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh terhadap regulasi protein Bcl-2 yang merupakan agen anti-apoptosis. Sel kanker serviks HeLa dipilih karena bersifat immortal dan produktif sehingga banyak digunakan dalam berbagai penelitian ilmiah (Capes, dkk., 2010). Karakteristik sel kanker serviks HeLa memiliki ekspresi p53 dalam jumlah yang kecil, dan overekspresi Bcl-2. Uji aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa dengan metode 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT). Uji flowcytometry dengan menggunakan staining Annexin V Flous untuk mengetahui sel yang mengalami apoptosis, dan metode imunositokimia terhadap ekspresi protein Bcl-2. Dengan demikian diharapkan hasil penelitian ini dapat memberikan tambahan informasi mengenai agen kemopreventif pada kanker serviks. METODE PENELITIAN Bahan Penelitian Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel kanker serviks HeLa yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, dan tanaman rosemary dibeli dari Dipokusumo Farm yang ditanam di kebun Malang. Bahan kimia yang digunakan adalah metanol absolut, metanol 60%, media kultur medium DMEM, Tripsin EDTA 0,025%, PBS (Phosphat Buffer Saline), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl 0.01 N, DMSO (Merck) dengan konsentrasi tertinggi 0,16%, 2 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI akuades, reagen Annexin V Fluos staining kit (Roche) mengandung 100 mL buffer (2 mL of 2 mL Annexin V and Propidium Iodide), reagen MTT (Sigma) 5 mg/mL, primary monoclonal antibody mouse anti-human Bcl-2 Oncoprotein (Dako), biotinylated universal secondary antibody (Biocare), substrat DAB, cisplatin 10 mg/10 mL yang didapatkan dari Kalbe Farma. Alat Penelitian Alat–alat gelas steril (Pyrex), waterbath (Memmert), rotary evaporator (Buchi Labortechnik AG CH-99230), oven, 96 well-plate (Iwaki), 6 well-plate (Iwaki), sentrifuge tube, inkubator CO2 (Thermo Heraeus HeraCell 150), Laminar air flow cabinet (Labconco), mikropipet, hemositometer (Neubauer), ELISA reader (Bio-Rad), kamera digital (Canon 550D), mikroskop cahaya (Olympus), mikroskop inverter (Olympus), flowcytometer (FACS Calibur). Pembuatan serbuk daun rosemary kering Tanaman rosemary dibeli dari Dipokusumo Farm yang ditanam di kebun Malang, dan dideterminasi di laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada (Lampiran 1). Bagian tanaman yang digunakan adalah daun. Daun yang akan dipilih yaitu daun tua yang segar yang terletak bagian tengah pada tanaman antara cabang daun ke lima dari bagian atas tanaman dan daun ke lima dari bawah tanaman, bentuk masih utuh, dan berwarna hijau pekat. Daun rosemary dipisahkan dari batang dan akarnya, serta pengotor lainnya seperti tanah yang menempel pada daun. Pencucian daun rosemary dilakukan dengan menggunakan air mengalir sebanyak tiga kali. Kemudian dilakukan pengeringan menggunakan oven suhu 40-50oC. Daun rosemary yang telah kering tersebut, kemudian diblender hingga hancur dan diperoleh serbuk halus simplisia daun rosemary. Pembuatan ekstrak metanol daun rosemary Serbuk simplisia daun rosemary sebanyak 7,3 g dimasukkan dalam labu alas bulat 500 mL, dan ditambahkan 30 mL metanol absolut, direfluks pada suhu 60oC selama 30 menit. Proses refluks diulang sampai pelarut tidak berwarna dengan menggunakan pelarut yang baru, dan terhadap hasil refluks dilakukan penyaringan, digabungkan, dan dipekatkan menggunakan rotary evaporator sampai metanol menguap, kemudian dilanjutkan dengan menggunakan waterbath pada suhu 80oC sampai mencapai bobot tetap. Residu serbuk diambil sebanyak 0,5 g dan ditambahkan metanol 60% sebanyak 10 mL, kemudian divortex selama 1 menit. Setelah divortex, larutan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 3000 rpm, disaring dan diambil endapan yang terbentuk. Endapan ditambahkan 3 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 10 mL metanol absolut, disaring, dan cairan dipekatkan menggunakan waterbath pada suhu 80oC sampai mencapai bobot tetap (Abe, dkk., 2002; Anggraeni, 2015). Pembuatan larutan uji Sampel (Ekstrak metanol daun rosemary) Ekstrak kering daun rosemary ditimbang sebanyak 10 mg kemudian dilarutkan kedalam 100 μl DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel adalah 100.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi sebesar 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL, 15,625 μg/mL. Kontrol positif (Cisplatin) Cisplatin dengan konsentrasi 10 mg/10 mL, kemudian dibuat larutan stok dengan konsentrasi 1.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat seri konsentrasi sebesar 78 μg/mL, 39 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL. Panen Sel Sel HeLa ditanam dan diinkubasi dalam cawan petri hingga konfluen 80% yang terlihat monolayer di bawah mikroskop, kemudian media kultur DMEM dibuang terlebih dahulu menggunakan mikropipet. PBS ditambahkan ke dalam cawan petri untuk mencuci, kemudian dibuang dan ditambahkan tripsin 0,025% secara merata dalam cawan petri. Cawan petri ditutup dan didiamkan di dalam inkubator selama 3 menit hingga sel terlepas. Pindahkan ke dalam ke conical tube, tambahkan PBS 10 mL, dan disentrifuge selama 10 menit. PBS dibuang, endapan diberi media kultur DMEM 2 mL, disuspensi dan dicuplik sedikit diamati di bawah mikroskop dengan haemocytometer untuk menghitung jumlah sel yang diperlukan selama pengujian. Perhitungan jumlah sel : 1 2 3 4 x 104/mL x faktor pengenceran 4 (Nobakht, dkk., 2014; CCRCd, 2009). Uji Sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary pada sel HeLa Sel sebanyak 1x106 sel/mL yang telah diinkubasi selama 24 jam dan didapati sudah konfluen dapat segera diberi perlakuan. Media kultur dibuang terlebih dahulu. Pada sumuran 96 well-plate diberi 100 μL seri konsentrasi sampel dan seri konsentrasi cisplatin. Kolom kontrol sel hanya diberi media kultur, dan kolom kontrol media hanya dikosongkan tanpa diberi media kultur, kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah diinkubasi selama 24 jam, media kultur dibuang, kemudian tambahkan 100 μL larutan MTT 5 mg/mL yang telah disiapkan dan diinkubasi selama empat jam di dalam 4 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI inkubator CO2. Setelah empat jam, tambahkan 100 μL reagen stopper SDS 10% dalam 0,1N HCl. Plate dibungkus menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat yang gelap (suhu ruangan) selama 24 jam. Setelah 24 jam, dilakukan pembacaan absorbansi dengan menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm yaitu pada daerah cahaya tampak (Xu, dkk., 2014; CCRCc, 2009). Uji apoptosis dengan metode flowcytometry Sel dengan populasi 1 x 106/mL ditanam pada 6 well-plate, dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi, tiap lubang diberi sampel ekstrak konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi ½ IC50 sebanyak dua mL, dan diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi selama 24 jam, media dipindahkan dalam conical tube dengan menggunakan mikropipet. Well-plate dicuci dengan menggunakan PBS sebanyak satu mL, kemudian diambil dan dipindahkan ke dalam conical tube. Pada well-plate diberi tripsin 0,025% sebanyak satu mL, diinkubasi selama 3 menit, dan ditampung lagi ke dalam conical tube. PBS ditambahkan hingga 10 mL dan conical tube disentrifuge selama 10 menit. Supernatan dibuang, sisa endapan ditambahkan PBS dingin sebanyak satu mL. Resuspensi dilakukan dan 1 mL cairan di dalam conical tube dipindahkan ke dalam micro tube 1 mL, disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Supernatan dibuang dan disisakan endapan yang terbentuk, ditambahkan 100 μL reagen Annexin V Fluos ke dalam endapan sampel. Inkubasi selama 10 menit dalam ruang gelap. Buffer 300 μL ditambahkan di dalam micro tube kemudian hasil dibaca menggunakan flowcytometer FACS Calibur (Huang, dkk., 2015; CCRCb, 2009). Uji Imunositokimia Sel HeLa dengan populasi 2 x 105 ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip. Setelah inkubasi 24 jam dan sel telah konfluen, media kultur dibuang. Sel diberi perlakuan dengan menambahkan 1 mL sampel konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam pada inkubator CO2. PBS ditambahkan ke cover slip, lalu dibuang. Penambahan PBS dilakukan sebanyak dua kali dan difiksasi menggunakan metanol 300 μL dengan tujuan untuk mempertahankan morfologi sel, diinkubasi selama 10 menit, lalu dibuang. Cover slip diambil dan dipindahkan ke kaca preparat, kemudian cover slip ditambahkan larutan hidrogen peroksida (H2O2) sebanyak 1 mL untuk menghambat peroksidase endogen, diinkubasi selama 10 menit, lalu dibuang. Cuci cover slip dengan akuades sebanyak 1 mL. PBS 1 mL ditambahkan pada cover slip, dan didiamkan selama 5 menit, lalu dibuang. Cover slip diberi larutan blocking 20 μL selama 10 menit untuk 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI mencegah ikatan tidak spesifik antibodi sekunder, lalu dibuang, diberi antibodi primer 50 μL didiamkan selama 1 jam, setelah itu dibuang dan diberi PBS diulang sebanyak dua kali. Kemudian cover slip diberi antibodi sekunder 30 μL diinkubasi selama 20 menit, lalu dibuang dan diberi PBS didiamkan selama 2 menit dan diulang 2 kali. Reagen yang berisi kompleks streptavidin sebanyak 30 μL untuk memperjelas pewarnaan dan diinkubasi selama 10 menit, lalu ditambahkan PBS inkubasi 2 menit, lalu dibuang, dan diulang 2 kali. Cover slip diberi larutan diaminobenzidin (DAB) sebagai pewarna coklat sebanyak 50 μL diinkubasi selama 7 menit, dan ditambahkan akuades lalu dibuang. Larutan MayerHaematoxylin ditambahkan dan diinkubasi selama 3 menit yang berguna untuk memberikan kontras warna atau membedakan warna sel, lalu ditambahkan akuades dan dibuang. Cover slip diangkat dengan pinset dan digenangi etanol, lalu cover slip dikeringkan. Cover slip diletakkan di atas object glass, dan ditetesi dengan lem (mounting media), kemudian ditutup dengan cover slip kotak. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya (Guimaraes, dkk., 2005; CCRCa, 2009). Analisis Hasil Analisis nilai IC50 Data absorbansi pada setiap sumuran dari uji MTT diperlukan untuk dikonversi menjadi presentase sel yang hidup. Presentase sel yang hidup (% viabilitas) dihitung menggunkan rumus: Data yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai IC50 dengan membuat regresi linear konsentrasi versus persen viabilitas sel menggunakan program Microsoft Excel (Setiawati, Handika, & Utami, 2016; CCRCc, 2009). Analisis Apoptosis Sel Pengamatan kuantitatif dilakukan menggunakan alat FACS Calibur yang terhubung dengan software untuk membaca hasil analisis. Hasil yang didapatkan, kemudian dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel. Warna hijau menunjukkan sel hidup (Annexin-/PI-), warna kuning menunjukkan sel mengalami early apoptosis (Annexin+/PI-), merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+) (Hingorani, dkk., 2011), dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin/PI+) (Nurzijah, dkk., 2012). 6 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Analisis Uji Imunositokimia Pengamatan kualitatif digunakan untuk mengetahui ekspresi protein Bcl-2. Warna coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu menunjukkan tidak terdapat ekspresi protein Bcl-2. Pengamatan secara semikuantitatif dilakukan dengan level scoring. Pembacaan data dilakukan dengan bantuan tiga orang responden (blind reader) untuk menghitung jumlah sel yang mengekspresikan Bcl-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap preparatnya. % Ekspresi Bcl-2 : x 100% Level scoring ekspresi Bcl-2 ditentukan dengan : a. 0 : kurang dari 5% (Sangat kuat) b. 1+ : 6% - 25% (Kuat) c. 2+ : 26% - 50% (Sedang) d. 3+ : 51% - 75% (Lemah) e. 4+ : 76% - 100% (Sangat lemah) (Zang, dkk., 2002). HASIL DAN PEMBAHASAN Pembuatan ekstrak daun rosemary pada penelitian ini dilakukan dengan metode refluks menggunakan pelarut metanol. Refluks merupakan cara ekstraksi menggunakan pemanasan. Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi harus mampu melarutkan senyawa yang diharapkan, dan memiliki titik didih lebih rendah dibandingkan dengan senyawa target, dengan hal tersebut kerusakan senyawa target dapat dihindari. Metanol merupakan pelarut yang mampu menyari senyawa bersifat polar maupun nonpolar, sehingga diharapkan senyawa target dalam daun rosemary mampu tersari dengan baik. Ekstraksi yang dilakukan pada penelitian ini dengan metode refluks menggunakan pelarut metanol didapatkan rendemen sebesar 12%. Berdasarkan penelitian Abe dkk. (2002), diketahui bahwa daun rosemary yang diekstraksi dengan menggunakan pelarut metanol mampu menyari senyawa aktif seperti asam betulinat, asam oleanolat, dan asam ursolat. Metode refluks dapat digunakan pada metode ekstraksi daun rosemary karena senyawa target memiliki titik didih yang tinggi 7 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI yaitu asam betulinat sebesar 295-298oC, asam oleanolat sebesar 300oC, asam ursolat sebesar 284oC, dan pelarut metanol yang digunakan memiliki titik didih 64,5oC. Pada penelitian ini tidak dilakukan uji kandungan senyawa ekstrak metanol daun rosemary, namun diperkirakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas antikanker oleh adanya senyawa-senyawa tersebut. Penelitian lain menggunakan asam betulinat pada sel kanker serviks HeLa memiliki aktivitas antipoliferatif sel dengan nilai IC50 sebesar 30,42 μM dan mampu menginduksi apoptosis Xu, dkk., 2014 . Menurut Yim dkk. 2006) asam ursolat sebesar 15 μM mampu menghambat proliferasi pada sel kanker serviks HeLa. Asam oleanolat sebesar 40 μM memiliki efek sitotoksik dan mampu menginduksi apotosis pada sel kanker hati HepG2 (Wang, dkk., 2013). Perbedaan usia tanaman, tempat tumbuh, cuaca, dan kondisi lingkungan menyebabkan kandungan senyawa aktif dalam daun rosemary berbeda-beda, namun dengan menggunakan metode ekstraksi yang sama pada penelitian sebelumnya oleh Abe dkk. (2002) diharapkan senyawa yang tersari sama dengan penelitian tersebut. Menurut Yesil-Celiktas dkk. (2010), menyatakan bahwa ada beberapa kandungan senyawa aktif lainnya yang diidentifikasi dari daun rosemary antara lain asam carnosic, dan asam rosmarinic. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi kandungan senyawa dalam ekstrak metanol daun rosemary. Uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT) merupakan uji yang digunakan untuk mengukur viabilitas sel. MTT masuk ke dalam sel dan direduksi oleh enzim suksinat dehydrogenase menjadi formazan berwarna ungu yang tidak larut dan pada mitrokondria (Riss, dkk., 2013). Sel HeLa yang hidup ditandai dengan terbentuknya kristal formazan berwarna ungu, sehingga metode ini dapat digunakan untuk mengukur viabilitas sel. Formazan tersebut dapat larut setelah ditambahkan stopper (SDS), sehingga dapat dibaca absorbansinya dengan menggunakan ELISA reader dan dapat mengetahui IC50 dari ekstrak. Aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel kanker serviks HeLa memberikan pengaruh pada morfologi sel setelah 24 jam perlakuan. Pada kelompok kontrol sel, sel berbentuk poligonal dan menempel pada plate (Gambar 1A). Pada kelompok perlakuan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi 62,5 μg/mL (Gambar 1B), morfologi sel HeLa terlihat mengkerut yang ditandai dengan sel berbentuk bulat, tidak menempel pada plate, serta kepadatan sel berkurang, begitu juga pada kelompok perlakuan cisplatin (Gambar 1C). 8 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI B A C Gambar 1. Morfologi sel HeLa observasi sel secara mikroskopis dengan perbesaran 100x setelah perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dengan waktu inkubasi 24 jam. (A) Morfologi kontrol sel HeLa. (B) Morfologi sel pada perlakuan ekstrak metanol daun rosemary dengan konsentrasi 62,5 μg/mL. (C) Morfologi sel pada perlakuan cisplatin dengan konsentrasi 20 μg/mL. Keterangan : menunjukkan sel menjadi mengkerut (berbentuk bulat), menunjukkan sel hidup dengan bentuk sel poligonal. Viabilitas sel (%) 120 100 80 60 40 20 0 0 100 200 300 400 500 600 Ekstrak metanol daun rosemary (µg/mL) A viabilitas sel (%) 120 100 80 60 40 20 0 B 0 20 40 60 Cisplatin (µg/mL) 80 100 Gambar 2. Efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin pada sel kanker serviks HeLa. Sel HeLa (1x106 sel/mL) yang ditanam pada 96 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi seri konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary dan seri konsentrasi cisplatin. Viabilitas sel ditentukan dengan metode MTT. (A) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary selama 24 jam. (B) Viabilitas sel setelah diberi seri konsentrasi cisplatin selama 24 jam. 9 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Hasil yang didapatkan menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL (Gambar 2A) dan nilai IC50 cisplatin yaitu sebesar 36 µg/mL (Gambar 2B). Semakin tinggi konsentrasi ekstrak metanol daun rosemary yang diberikan, sel HeLa yang hidup semakin berkurang. Secara umum efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary menunjukkan fenomena dose-dependent. Cisplatin adalah first line agen kemoterapi yang dalam pengobatan kanker serviks. Oleh karena itu cisplatin dapat dijadikan sebagai kontrol positif dalam pengembangan agen kemoprevensi. Potensi suatu ekstrak dikatakan sebagai agen sitotoksik digolongkan menjadi tiga kategori yaitu agen sitotoksik kuat apabila nilai IC50 < 20 µg/mL, sedang apabila memiliki nilai IC50 < 50 µg/mL dan lemah apabila nilai IC50 > 50 µg/mL (Ellithey, dkk., 2014). Menurut Machana dkk. (2011), menyatakan bahwa ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker apabila nilai IC50 >500 µg/mL. Berdasarkan kriteria tersebut maka dapat dikatakan bahwa ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik atau memiliki aktivitas antikanker yang lemah terhadap sel kanker serviks HeLa. Ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks HeLa, namun tetap dapat dijadikan agen kemopreventif. Efek toksik yang kuat pada obat kemoterapi cisplatin memiliki kelemahan yaitu tidak selektif terhadap sel kanker, cisplatin bersifat toksik pada sel kanker dan sel normal sehingga muncul efek samping (Dasari dan Bernard, 2014). Oleh karena itu, dengan ekstrak metanol daun rosemary tidak cukup toksik terhadap sel kanker serviks HeLa, maka diharapkan tidak bersifat toksik terhadap sel normal, namun tetap diperlukan penelitian lebih lanjut untuk memastikan aktivitas sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal. Ekstrak metanol daun rosemary memiliki efikasi pengobatan yang rendah yang disebabkan efek sitotoksik lemah pada sel kanker serviks, sehingga untuk meningkatkan efikasi pengobatan ekstrak metanol daun rosemary dapat dikombinasikan dengan agen kemoterapi yang sudah ada seperti cisplatin. Kombinasi tersebut bertujuan untuk meningkatan efikasi dengan mengurangi efek toksik cisplatin pada sel atau jaringan normal dan resistensi (Hemaiswarya dan Doble, 2006). Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui efek sinergis dari kandungan ekstrak metanol daun rosemary dan obat kemoterapi. 10 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Jenis kematian sel dibagi menjadi dua yaitu melalui apoptosis dan nekrosis. Apoptosis adalah kematian sel yang terprogram, hal ini memicu fagositosis oleh makrofag, tanpa menimbulkan inflamasi (Hanahan dan Weinberg, 2000). Metode flowcytometry digunakan dalam penelitian ini untuk mengetahui jenis kematian sel dan menampilkan data secara kuantitatif. Sel- sel normal bersifat hidrofobik dan memiliki membran fosfolipid. Pada bagian luar lipid bilayer terdapat fosfatidilkolin dan sfingomielin, sedangkan pada bagian dalam cisplatin HeLa.006 File: KS HeLa.001 terdapat fosfatidilserin. Ketika sel tersebut mengalami apoptosis, fosfatidilserin File: akan Gate: No G ate Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Tota l Even ts: 20000 menuju ke bagian luar dan Annexin V akan berikatan secara spesifik dengan Quad % Gated % Total Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UL 2.54 LR 3.74 3.74 LR 25.91 UR 10.54 UR 2.50 fosfatidilserine dibantu oleh ion Ca2+ (Hingorani, dkk.,2.50 2011). Sel yang mengalami LL 61.02 LL 88.72 88.72 2.54 10.54 61.02 25.91 kerusakan membran reagen propidium iodida akan berikatan dengan DNA, dan dapat memberikan data jumlah sel yang mengalami nekrosis (Vermes, dkk., File: 1995). rosemary HeLa.003 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R3 R4 R4 File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 R2 Quad % Gated % Total UL 18.71 18.71 UR 15.10 15.10 LL 53.87 53.87 LR 12.31 12.31 R2 File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Re gion % Gated % Total R1 61.80 61.80 R2 25.44 25.44 R3 10.62 10.62 R4 2.69 2.69 R1 R1 B A R4 File: rosemary HeLa.003 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 Re gion % Gated % Total R1 54.09 54.09 R2 11.82 11.82 R3 15.20 15.20 R4 19.55 19.55 R1 C Gambar 3. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menginduksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Sel HeLa (1x 106/mL) yang ditanam pada 6 well-plate diinkubasi selama 24 jam, kemudian diberi ekstrak metanol daun rosemary 160 µg/mL dan cisplatin 18 µg/mL diinkubasi selama 24 jam, dan diwarnai dengan reagen annexin V dan propidium iodida (PI). Hasil dibaca menggunakan flowcytometer. (A) Kontrol sel kanker serviks HeLa. (B) Sel kanker serviks HeLa yang diberi cisplatin (18 µg/mL). (C) Sel kanker serviks HeLa yang diberi ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL). Hasil uji apoptosis menunjukkan bahwa pada kelompok kontrol sel, sel yang masih hidup sebanyak 88,28%. Pada sel HeLa yang diberi cisplatin konsentrasi ½ IC50, menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 2,69%, sel yang mengalami apoptosis total sebanyak 36,06%, dan sel yang masih hidup sebanyak 61,80%. Pada sel HeLa yang diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50 11 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 19,55%, sel yang mengalami apoptosis total sebanyak 27,02%, dan sel yang masih hidup sebanyak 54,09% (Tabel I). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary menginduksi kematian sel melalui apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Pada kelompok sel yang mengalami nekrosis, nekrosis tersebut yaitu nekrosis sekunder karena dalam penelitian secara in vitro yang dilakukan tidak ada peristiwa fagositosis oleh makrofag. Tahap kelanjutan dari peristiwa apoptosis akan terdeteksi sebagai nekrosis sekunder (Demoy, dkk., 2000). Pada penelitian yang dilakukan yaitu dengan waktu inkubasi 24 jam, peristiwa apoptosis sebelum terdeteksi sebagai nekrosis sekunder belum teramati. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis sebelum 24 jam. Tabel I. Hasil Uji Apoptosis dengan Metode Flowcytometry Total Sel (%) Radian 1 Radian 2 Radian 3 Radian 4 Sel Hidup Early Apoptosis Late Apoptosis Nekrosis Kontrol Sel 88,28 3,55 2,58 5,67 Cisplatin 61,80 25,44 10,62 2,69 54,09 11,82 15,20 19,55 Ekstrak Metanol Daun Rosemary Apoptosis dibagi menjadi dua jalur, yaitu jalur ekstrinsik dan jalur intrinsik. Jalur ekstrinsik yaitu melalui aktivasi caspase-8 oleh ligan yang berikatan dengan reseptor tumor necrosis factor (TNF) seperti Fas atau TNFR1. Jalur intrinsik disebabkan oleh peristiwa seperti kerusakan DNA sehingga berpengaruh terhadap ekspresi dari family protein Bcl-2 seperti Bax, Bcl-2, dan Bad (Weyhenmeyer, dkk., 2012). Sel kanker serviks Hela memiliki karakteristik ekspresi p53 dalam jumlah yang kecil dan overekspresi Bcl-2. Overekspresi protein Bcl-2 menghambat pelepasan sitokrom–c dari mitokondria. Sitokrom-c tidak akan mengikat apoptotic proteaseactivating factor 1 (Apaf-1), kemudian tidak terbentuk kompleks teraktivasi dari (d)ATP, sehingga caspase-3 tidak teraktivasi dan menyebabkan terjadiya penghambatan apoptosis (Weyhenmeyer, dkk., 2012). Uji imunositokimia digunakan untuk mengetahui aktivitas ekstrak metanol daun rosemary terhadap ekspresi protein Bcl-2. Pada uji imunositokimia, perubahan warna yang terjadi akibat perubahan DAB dapat dijadikan penanda adanya kompleks antigen dan antibodi pada sel (Uhlen, dkk., 2016). Warna coklat pada sitoplasma menunjukkan ekspresi protein Bcl-2, dan warna ungu 12 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI menunjukkan tidak terdapat ekspresi protein Bcl-2. Uji imunositokimia merupakan uji kualitatif, namun dapat dijadikan uji semikuantitatif, dengan pengambilan tiga lapang pandang dari tiap preparat. Pembacaan hasil dilakukan dengan bantuan blind reader. Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 menunjukkan bahwa pada kelompok perlakuan dengan cisplatin konsentrasi IC50 dan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50 mampu menekan ekspresi dari Bcl-2 (Gambar 4). Hasil perhitungan ekspresi Bcl-2 pada kelompok perlakuan dengan cisplatin adalah bernilai 0 (sangat kuat). Pada kelompok perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary level ekspresi Bcl-2 adalah 1+ (kuat) (Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary dalam induksi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa salah satunya diperantarai oleh penekanan ekspresi protein Bcl-2. Perhitungan ekspresi Bcl-2 dalam uji imunositokimia dalam penelitian ini hanya bersifat semikuantitatif, oleh karena itu diperlukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan metode lain untuk mendeteksi adanya suatu protein Bcl-2 secara kuantitatif. A B C D Gambar 4. Efek ekstrak metanol daun rosemary dan cisplatin dalam menekan ekspresi Bcl-2 pada sel kanker serviks HeLa. Sel HeLa (2 x 105/mL) ditanam dalam 6 well-plate yang telah diberi cover slip diinkubasi selama 24 jam. Sel diberi perlakuan dengan ekstrak metanol daun rosemary konsentrasi ½ IC50 dan cisplatin konsentrasi IC50, diinkubasi selama 24 jam. (A) Kontrol sel tanpa antibodi Bcl-2. (B) Kontrol sel dengan antibodi Bcl-2. (C) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak metanol daun rosemary (160 µg/mL). (D) Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin (36 µg/mL). Pengamatan dilakukan di bawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 400x. Keterangan : sel tidak mengekspresikan Bcl-2, sel mengekspresikan Bcl-2. Apoptosis yang terjadi akibat aktivasi caspase-3 tidak hanya diperantarai oleh penghambatan protein Bcl-2. Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Yim dkk. (2006) menyatakan bahwa dengan meningkatkan ekspresi Fas, akan mengaktivasi caspase-8 dan 13 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI mengaktivasi caspase-3, kemudian memicu fragmentasi dan akhirnya terjadi apoptosis pada sel kanker serviks HeLa. Oleh karena itu, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan ekspresi Bcl-2. Tabel II. Perhitungan Ekspresi Bcl-2 Lapang Pandang Kontrol Sel Tanpa Antibodi Kontrol Sel dengan Antibodi Cisplatin Ekstrak Metanol Daun Rosemary Ekspresi Bcl-2 Level 1 (n = 90) 0 (0%) 0 2 (n = 85) 0 (0%) 0 3 (n = 107) 0 (0%) 0 1 (n = 105) 105 (100%) 4+ 2 (n = 97) 97 (100%) 4+ 3 (n = 106) 106 (100%) 4+ 1 (n = 128) 1 (0,78%) 0 2 (n = 125) 3 (2,4%) 0 3 (n = 107) 0 (0%) 0 1 (n = 271) 23 (8,49%) 1+ 2 (n = 257) 31 (12,06%) 1+ 3 (n = 296) 23 (7,77%) 1+ KESIMPULAN Hasil uji viabilitas sel menunjukkan ekstrak metanol daun rosemary memiliki efek sitotoksik lemah terhadap sel kanker serviks HeLa dengan nilai IC50 sebesar 320 µg/mL, namun tetap memiliki potensi sebagai agen kemopreventif. Jalur kematian sel pada konsentrasi ½ IC50 menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menginduksi apoptosis sebesar 27% pada uji flowcytometry dengan waktu inkubasi 24 jam. Hasil uji imunositokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun rosemary mampu menekan kuat ekspresi protein Bcl-2 pada konsentrasi ½ IC50, sehingga kemungkinan induksi apoptosis diperantarai penekanan ekspresi protein Bcl-2 pada sel kanker serviks. Saran untuk penelitian berikutnya yaitu dilakukan identifikasi senyawa aktif dalam ekstrak metanol daun rosemary, mengetahui efek sitotoksik ekstrak metanol daun rosemary terhadap sel normal, melakukan pengamatan time-point peristiwa apoptosis sebelum 24 jam, mendeteksi adanya suatu ekspresi protein Bcl-2 secara kuantitatif, serta mengetahui regulasi protein lainnya dalam menginduksi apoptosis setelah penekanan ekspresi Bcl-2. 14 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI DAFTAR PUSTAKA Abe, F., Yamauchi, T., Nagao, T., Kinjo, J., Okabe, H., Higo, H., dan Akahane, H., 2002. Ursolic acid as a Trypanocidal Constituent in Rosemary. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 25 (11), 1485–1487. American Cancer Society, 2015. Treatment Options for Cervical Cancer, by Stage, http://www.cancer.org/cancer/cervicalcancer/detailedguidecervicalcancer-treatingtargeted-therapy diakses pada tanggal 1 April 2016. Anggraeni, C. D., 2015. Aktivitas Sitotoksik Ekstrak metanolik Daun Rosemary (Rosmarimus officinalis L.) terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui Regulasi Ekspresi Reseptor Estrogen-α ERα . Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. Cancer Chemoprevention Research Centera, 2009. Prosedur Tetap: Pengamatan Ekspresi Protein dengan Metode Immunositokimia, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wp-content/uploads/03.012.-Imunositokimia.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerb, 2009. Prosedur Tetap: Preparasi Sampel untuk Flowcytometry, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wp-content/uploads/03.014.02-flowcytometry.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerc, 2009. Prosedur Tetap: Uji Sitotoksik Metode MTT, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/wpcontent/uploads/03.010.02-uji-sitotoksik-MTT.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Cancer Chemoprevention Research Centerd, 2009. Prosedur Tetap: Panen Sel, Unversitas Gajah Mada, Yogyakarta, http://ccrc.farmasi.ugm.ac.id/en/wpcontent/uploads/03.005.-Panen-Sel.pdf, diakses pada tanggal 1 April 2016. Capes, D., Theodosopoulos G., & Atkin, I., 2010. Check Your Cultures! A List of CrossContaminated or Misidentified Cell Lines. Int J Cancer, 127 (1): 1–8. Dasari, S., dan Bernard, P., 2014. Cisplatin in Molecular mechanisms of action. European Journal 1–15. cancer therapy : of Pharmacology, Demoy, M., Minko, T., & Kopeckova, P. 2000. Time- and concentration-dependent apoptosis and necrosis induced by free and HPMA copolymer-bound doxorubicin in human ovarian carcinoma cells, 69, 185–196. 15 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Ellithey, M. S., Lall, N., Hussein, A. A., & Meyer, D., 2014. Cytotoxic and HIV-1 enzyme inhibitory activities of Red Sea marine organisms. BMC Complementary and Alternative Medicine, 14, 77. Guimaraes, M.C.M., dkk., 2005. Immunohistochemical Expression of p16INK4a and bcl-2 According to HPV Type and to the Progression of Cervical Squamous Intraepithelial Lesions. Journal of Histochemistry & Cytochemistry, 53(4), 509–16. Goodwin, E.C., and DiMaio, D., 2000. Repression of Human Papillomavirus Oncogenes in Hela Cervical Carcinoma Cells Causes the Orderly Reactivation of Dormant Tumor Suppressor Pathways. Biochemistry, Vol.97, no.23. Hanahan, D., dan Weinberg, R.A., 2000. The Hallmarks of Cancer. Cell., 100, 57-70. Hemaiswarya, S., dan Doble, M., 2013. Combination of Phenylpropanoids with 5Fluorouracil as Anti-Cancer Agents against Human Cervical Cancer (HeLa) Cell Line. Phytomedicine, 20(2), 151–58. Hingorani, R., Deng, J., Elia, J., McIntyre, C., & Mittar, D, 2011. Detection of Apoptosis Using the BD Annexin V FITC Assay on the BD FACSVerseTM System. BD Biosciences, 1–12. Huang, H., Chen, A. Y., Ye, X., Li, B., Rojanasakul, Y., Rankin, G. O., & Chen, Y. C., 2015. Myricetin inhibits proliferation of cisplatin-resistant cancer cells through a p53-dependent apoptotic pathway. International Journal of Oncology, 47(4), 1494– 1502. Ibeanau, O.A., 2011. Molecular Pathogenesis of Cervical Cancer. Cancer Biology & Therapy,11(3), 295- 306. International Agency for Research on Cancer WHO (IARC), 2015. Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam www.http://globocan.iarc.fr/, diakses tanggal 5 April 2016. Leisching, G., Loss, B., Botha, M., Engelbrecht, A., 2015. Bcl-2 Confers Survival in Cisplatin Treated Cervical Cancer Cells: Circumventing Cisplatin Dose-Dependent Toxicity and Resistance. J Transl Med, 13, 328. Machana, S., dkk., 2011. Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line. Chin Med, 6(1), 1-8. Nobakht, G. M., Kadir, M. a, Stanslas, J., & Charng, C. W., 2014. Cytotoxic effect of Typhonium flagelliforme extract. Journal of Medicinal Plants Research, 8(31), 1021–1024. Nurzijah, I., Putri, D. D. P., Rivanti, E., & Meiyanto, E., 2012. Secang (Caesalpinia sappan L.) Heartwood Ethanolic Extract Shows Activity as Doxorubicin Co16 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI chemotherapeutic Agent by Apoptotis Induction on T47D Breast Cancer Cells. Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, 3(2), 377–384. Riss, T.L., Richard, A.M., Andrew, L.N., Helene, A.B., Tracy, J.W., Lisa, M., 2013, Assay Guidance Manual: Cell Viability Assays, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK144065/, diakses pada tanggal 8 April 2016. Setiawati, A., Immanuel, H., & Utami, M. T., 2016. The inhibition of Typhonium flagelliforme Lodd. Blume Leaf Extract on COX-2 Expression of WiDr Colon Cancer Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 6(3), 251–255. Sharma, R., 2012. Cancer Chemoprevention: Prevention is Better than Cure. Cancer Science Therapy, S3:e001. Uhlen, M., Ponten, F., Tegel, H., Nilsson, P., Feilitzen, K., Lundberg, E., dkk., 2016, Immunocytochemistry, http://www.proteinatlas.org/learn/method/, immunocytochemistry, diakses pada tanggal 22 April 2016. Vermes, I., Clemens, H., Helga, S., dan Chris, R., 1995, A Novel Assay for Apoptosis Flow Cytrometric Detection of Phospatidylserine Expression on early Apoptic Cells Using Flourescein Labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 184: 3951. Wang, X., dkk., 2013. Inhibitory effect of oleanolic acid on hepatocellular carcinoma via ERK–p53-mediated cell cycle arrest and mitochondrial-dependent apoptosis. Carcinogenesis, 34(6)1323-1330. Weyhenmeyer, B., Murphy, A. C., Prehn, J. H. M., & Murphy, B. M., 2012. Targeting the Anti-apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer. Experimental Oncology, 34(3), 192–199. Xu, T., dkk., 2014. Proteomic Investigation into Betulinic Acid-Induced Apoptosis of Human Cervical Cancer HeLa Cells. PLoS ONE, 9(8), 1–11. Yesil-Celiktas, O., SevimLi, C., Bedir, E., & Vardar-Sukan, F., 2010. Inhibitory Effects of Rosemary Extracts, Carnosic acid and Rosmarinic Acid on the Growth of Various Human Cancer Cell Lines. Plant Foods for Human Nutrition, 65(2), 158–163. Yim, E. K., dkk., 2006. Antiproliferative and Antiviral Mechanisms of Ursolic Acid and Dexamethasone in Cervical Carcinoma Cell Lines. International Journal of Gynecological Cancer, 16(6), 2023–2031. Zhang, H., Ph, D., Sun, X., & Ph, D., 2002. Overexpression of Cyclooxygenase-2 Correlates With Advanced Stages of Colorectal Cancer. Am J Gastroenterol, 97(4), 1–5. 17 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI LAMPIRAN 18 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi sampel daun rosemary 19 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 2. Surat ethical clearance 20 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 3. Ekstrak metanol daun rosemary dan alat yang digunakan Gambar 5. Tanamanan rosemary dan serbuk daun rosemary Gambar 6. Ekstraksi dengan refluks dan pemekatan dengan vaccum rotary evaporator Gambar 7. Ekstrak metanol daun rosemary 21 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 4. Seri konsentrasi cisplatin dan ekstrak Ekstrak metanol daun rosemary 10 mg + 100 µL DMSO = 100.000 µg/mL Intermediet = 2000 µg/mL (16 µL bulk + 784 µL /MK) Konsentrasi Sampel MK 1000 µg/mL (C1) 400 µL intermediet 400 µL 500 µg/mL (C2) 400 µL C1 400 µL 250 µg/mL (C3) 400 µL C2 400 µL 125 µg/mL (C4) 400 µL C3 400 µL 62,5 µg/mL (C5) 400 µL C4 400 µL 31,25 µg/mL (C6) 400 µL C5 400 µL 15,625 µg/mL (C7) 400 µL C6 400 µL Cisplatin 10 mg/10 mL = 1000 µg/mL Konsentrasi Sampel MK 156,25 µg/mL (C1) 125 µL 675 µL 78 µg/mL (C2) 400 µL C1 400 µL 39 µg/mL (C3) 400 µL C2 400 µL 20 µg/mL (C4) 400 µL C3 400 µL 10 µg/mL (C5) 400 µL C4 400 µL 5 µg/mL (C6) 400 µL C5 400 µL 2,5 µg/mL (C7) 400 µL C6 400 µL 22 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 5. Tabel viabiltas sel kanker serviks HeLa Tabel III. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Cisplatin Konsentrasi Cisplatin Viabilitas sel (%) SD 1 2 3 Rata-rata 0 100 100 100 100 0 5 73,003 90,551 105,062 89,539 16,053 10 56,468 78,909 101,181 78,853 22,357 20 39,258 49,888 64,398 51,181 12,62 39 31,159 31,834 37,402 33,465 3,426 78 25,253 9,393 15,804 16,817 7,979 (µg/mL) Tabel IV. Viabilitas Sel Kanker Seviks HeLa dengan Perlakuan Ekstrak Metanol Daun Rosemary Viabilitas sel (%) Konsentrasi SD ekstrak (µg/mL) 1 2 3 Rata-rata 0 100 100 100 100 0 15,63 90,757 92,167 91,854 91,593 0,74 31,25 86,527 89,191 82,924 86,214 3,145 62,5 81,044 83,238 79,948 81,410 1,675 125 76,345 81,514 75,561 77,807 3,234 250 55,352 59,269 61,149 58,590 2,958 500 32,637 22,454 24,334 26,475 5,419 23 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 6. Hasil analisis Flowcytometry File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 5.05 5.05 UR 2.50 2.50 LL 88.72 88.72 LR 3.74 3.74 R4 R3 File: KS HeLa.001 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 24 Re gion % Gated % Total R1 88.28 88.28 R2 3.55 3.55 R3 2.58 2.58 R4 5.67 5.67 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 2.54 2.54 UR 10.54 10.54 LL 61.02 61.02 LR 25.91 25.91 R4 File: cisplatin HeLa.006 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 25 Re gion % Gated % Total R1 61.80 61.80 R2 25.44 25.44 R3 10.62 10.62 R4 2.69 2.69 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI File: rosemary HeLa.003 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 Quad % Gated % Total UL 18.71 18.71 UR 15.10 15.10 LL 53.87 53.87 LR 12.31 12.31 R4 File: rosemary HeLa.003 Gate: No G ate Tota l Even ts: 20000 R2 R1 26 Re gion % Gated % Total R1 54.09 54.09 R2 11.82 11.82 R3 15.20 15.20 R4 19.55 19.55 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Lampiran 7. Pengamatan tiga lapang pandang sel kanker serviks HeLa A. Kontrol sel tanpa antibodi B. Kontrol sel dengan antibodi C. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan cisplatin 27 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI D. Sel kanker serviks HeLa dengan perlakuan ekstrak metanol daun rosemary 28 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI BIOGRAFI PENULIS Penulis skripsi dengan judul “Ekstrak Metanolik Daun Rosemary (Rosmarinus officinalis L.) sebagai Agen Kemopreventif terhadap Sel Kanker Serviks (HeLa) melalui Regulasi Bcl-2” memiliki nama lengkap Lela Francisca Adi Liana. Anak pertama dari pasangan Bapak Risman Adi dan Ibu Dwi Istiyani. Penulis lahir di Jepara, 4 Maret 1995. Pendidikan formal yang ditempuh penulis dimulai di TK Ester 1 Bondo (2000-2001). Pendidikan dilanjutkan ke SD Negeri 4 Bondo (2001-2007), setelah itu dilanjutkan ke SMP Negeri 2 Jepara (2007-2010), pendidikan menengah atas di SMA Negeri 1 Jepara (2010-2013). Kemudian pendidikan dilanjutkan hingga perguruan tinggi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis terlibat dalam keorganisasian dan kepanitian di dalam kampus, antara lain menjadi anggota seksi pubdekdok Pharmacy Performance Road to School (2014), anggota Media Farmasi (2015), anggota seksi acara Donor Darah JMKI (2015), anggota seksi pubdekdok Sidang Terbuka Pengambilan Sumpah Apoteker (2016). Selain itu, penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biologi Sel dan Molekuler (2015 dan 2016). 29
