BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Kanker

BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kanker merupakan penyakit akibat perubahan pertumbuhan sel-sel
jaringan tubuh yang tidak normal dan tidak terkendali. Faktor-faktor yang
mempengaruhi terjadinya kanker yaitu adanya paparan karsinogen sehingga
terjadi mutasi pada gen-gen regulator yang berfungsi dalam pengaturan sistem
homeostasis dalam tubuh (Ruddon, 2007). Indonesia merupakan salah satu negara
berkembang dan dua pertiga dari penderita kanker di dunia berada di negaranegara berkembang seperti Indonesia. Berdasarkan data WHO (World Health
Organization) tahun 2008, kanker menjadi penyebab utama kematian di dunia di
antaranya adalah kanker paru-paru, kanker lambung, kanker hati, kanker kolon,
serta kanker payudara. Yayasan Kesehatan Payudara Jakarta (YKPJ) RS Kanker
Dharmais melaporkan bahwa kanker payudara menjadi urutan kedua sebagai
penyebab kematian terbesar bagi kaum wanita di Indonesia (Anonim, 2009).
Hingga pada tahun 2030 diperkirakan kematian akibat kanker dapat meningkat
sekitar 11 juta orang (WHO, 2011). Hal ini disebabkan karena sifat dari sel-sel
kanker dapat menyebar kebagian jaringan tubuh yang lain sehingga menyebabkan
kematian (DeVita et al., 2011).
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang banyak diderita
oleh kaum wanita. Sekitar 1,7 juta wanita didiagnosa menderita kanker payudara
hingga menyebabkan kematian. Hal ini sesuai dengan data yang dilaporkan oleh
1
2
IARC tahun 2013. Penderita kanker payudara di Indonesia mencapai 25.208
penderita per 100.000 jiwa dan sebanyak 43% penderita mengalami kematian
(Green et al., 2008). Pada 50% kasus kanker payudara disebabkan oleh ekspresi
berlebih protein estrogen dan 30% kasus kanker payudara disebabkan oleh
ekspresi berlebih Human Epidermal Receptor-2 (HER-2) (Gibbs, 2000).
Reseptor HER-2 merupakan epidermal growth factor receptor (EGFR),
sehingga dalam jumlah berlebih mampu mempengaruhi proliferasi sel tumor
secara terus menerus (Laskin and Sandler, 2004). Siddiqa et al., (2008)
melaporkan bahwa ekspresi berlebih reseptor HER-2 dapat menyebabkan
terjadinya peningkatan reseptor antiapoptosis Bcl-2 dan survivin. Peningkatan
ekspresi survivin, menyebabakan inaktivasi caspase, induktor apoptosis menjadi
inaktif, sehingga mampu memicu terjadinya proliferasi sel kanker payudara secara
terus menerus (Zhong et al., 2009). Penelitian terdahulu melaporkan bahwa
aktivasi reseptor-reseptor yang berperan dalam migrasi dan invasi sel kanker
dapat terjadi akibat ekspresi berlebih reseptor HER-2 (Wolf-Yadlin et al., 2006).
Ekspresi berlebih reseptor HER-2 mampu menginduksi dimerisasi secara spontan
dan terjadi autofosforilasi, dan memicu terjadinya aktivasi focal adhesion kinase
(FAK) sehingga mampu menginduksi terjadinya proses migrasi dan metastasis sel
kanker (Johnson et al., 2010).
Pengobatan yang saat ini banyak digunakan dalam penanganan kasus
kanker payudara yaitu dengan memanfaatkan agen kemoterapi berupa obat
sintesis dan monoclonal antibody seperti Transtuzumab. Transtuzumab memiliki
mekanisme aksi melalui penghambatan dimerisasi reseptor HER-2. Namun,
3
transtuzumab dilaporkan mengalami resistensi dalam penggunaannya (Kute et al.,
2004). Saat ini terjadi perkembangan agen kemoterapi kanker payudara,
khususnya pada sel kanker payudara HER-2 positif. Agen kemoterapi kanker
payudara HER-2 positif yang saat ini banyak digunakan yaitu lapatinib. Lapatinib
merupakan molekul kecil yang memiliki aktivitas sebagai inhibitor tyrosine
kinase (TKI) (Johnston et al., 2006). Namun, saat ini Lapatinib telah resisten
terhadap penanganan kasus kanker payudara HER-2 positif (Mitra et al., 2009).
Hal ini sesuai dengan pernyataan Natha (2012), bahwa adanya ekspresi berlebih
reseptor HER-2 pada kanker payudara mampu meningkatkan progresi sel tumor
dan resistensinya terhadap agen kemoterapi. Oleh karena itu, penghambatan
terhadap ekspresi reseptor HER-2 menjadi sangat penting.
Salah satu tanaman yang telah diteliti terkait potensinya sebagai agen
sitotoksik pada beberapa sel kanker adalah kayu secang (Caesalpinia sappan L.).
Kandungan senyawa kimia yang terkandung dalam kayu secang seperti
homoisoflavanoid brazilin, brazilein, 4-O-methylsappanol, protosappanin A, dan
caesalpin J memiliki sifat sitotoksik pada beberapa sel kanker (Lim et al., 1996).
Brazilin dan brazilein merupakan senyawa aktif pada kayu secang yang memiliki
kemampuan sebagai antioksidan, antiinflamasi, antibakteri serta antitumor (Liang
et al., 2013). Brazilin dan brazilein telah terbukti mempunyai aktivitas sitotoksik
pada enam kultur sel kanker yaitu HepG2 dan Hep3B (liver), MDA-MB-231 dan
MCF-7 (payudara), A549 (paru-paru), dan Ca9-22 (gingiva) (Yen et al., 2011).
Brazilein mampu menginduksi terjadinya mekanisme apoptosis pada sel kanker
hepar HepG2 (Zhong et al., 2009) dan sel kanker payudara MCF-7 melalui
4
penghambatan ekspresi survivin (Tao et al., 2011). Khamsita (2012) melaporkan
bahwa ekstrak etanolik kayu secang memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel
kanker payudara MCF-7 dengan nilai IC50 37 µg/mL. Serta ekstrak etanolik kayu
secang mampu meningkatkan aktivitas sitotoksik agen kemoterapi doxorubicin
dengan nilai kombinasi optimum ekstrak 18 µg/mL dan doxorubicin 25 µM.
Penelitian aktivitas sitotoksik secang terhadap sel kanker payudara telah banyak
diteliti. Namun, pengamatan aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik kayu secang
(Caesalpinia sappan L.) pada sel kanker payudara HER-2 positif belum diteliti.
Oleh karena itu, melalui penelitian ini diharapkan dapat menjadi dasar dalam
pengembangan ekstrak etanolik kayu secang (EEKS) pada sel kanker payudara
bertarget molekuler pada reseptor HER-2 menggunakan sel kanker payudara
MCF-7 yang mengekspresikan HER-2 secara berlebih (MCF-7/HER-2).
B. Rumusan Masalah
1. Apakah ekstrak etanolik kayu secang memiliki aktivitas sitotoksik pada sel
kanker payudara MCF-7/HER-2?
2. Apakah ekstrak etanolik kayu secang mampu menghambat ekspresi reseptor
HER-2 pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2?
5
C. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menelusuri potensi ekstrak etanolik
kayu secang (Caesalpinia sappan L.) sebagai agen sitotoksik bertarget
molekuler pada reseptor HER-2.
2. Tujuan Khusus
a. Mengetahui aktivitas sitotoksik EEKS terhadap sel kanker payudara MCF7/HER-2 serta nilai IC50-nya.
b. Mengkaji pengaruh EEKS terhadap penghambatan ekspresi reseptor HER-2
pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2.
D. Pentingnya Penelitian
Penelitian ini menjadi sangat penting bagi mahasiswa, institusi dan ilmu
pengetahuan. Bagi mahasiswa dan institusi penelitian ini dapat menjadi salah satu
sarana peningkatan kualitas riset dan menjadi bahan publikasi pada jurnal ilmiah,
sehingga dapat menambah kakayaan informasi dan menjadi landasan untuk
perkembangan penelitian selanjutnya. Bagi ilmu pengetahuan, penelitian ini
menjadi penting karena menjadi sumber informasi dan sumber data yang valid
dalam pengembangan ekstrak etanolik kayu secang (Caesalpinia sappan L.)
sebagai agen sitotoksik pada sel kanker payudara yang bertarget molekuler pada
reseptor HER-2.
6
E. Tinjauan Pustaka
1. Tanaman Secang (Caesalpinia sappan L.)
a. Morfologi dan Klasifikasi
Secang (Caesalpinia sappan L.) merupakan bahan alam yang berasal dari
bagian serutan batang kayu kering dari Caesalpinia sappan L.. Tanaman secang
berbentuk pohon kecil dengan ukuran 5-10 m. Tanaman secang memiliki bentuk
batang yang bercabang-cabang, berduri dan letaknya tersebar. Batang bulat dan
berwarna hijau kecokelatan. Daun yang dimiliki merupakan daun majemuk,
menyirip ganda, panjang 25-40 cm, jumlah anak daun 10-20 pasang yang letaknya
berhadapan dan berwarna hijau. Bunganya majemuk berbentuk malai, keluar dari
ujung tangkai dengan panjang 10-40 cm, mahkota bentuk tabung, berwarna
kuning. Buah tanaman secang berupa buah polong, panjang 8-10 cm, lebar 3-4
cm, ujung seperti paruh berisi 3-4 biji, bila masak warnanya hitam. Biji bulat
memanjang, panjang 15-18 mm, lebar 8-11 mm, tebal 5-7 mm, warnanya kuning
kecokelatan. Pemanenan kayu dapat dilakukan mulai umur 1-2 tahun.
Perbanyakan dengan biji atau stek batang. Klasifikasi Caesalpinia sappan L.:
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Magnoliophyta
Kelas
: Magnoliopsida
Ordo
: Fabales
Famili
: Caesalpiniaceae
Genus
: Caesalpinia
Spesies
: Caesalpinia sappan L. (Verheij and Coronel, 1992)
7
Caesalpinia sappan L. mempunyai sinonim Biancaea sappan (L.) Tadaro. Nama
umum Caesalpinia sappan L. yaitu secang sedangkan beberapa nama daerahnya
yaitu Seupeng (Aceh); Sopang (Batak); Cacang (Minangkabau); Secang (Sunda);
Kayu secang, Soga Jawa (Jawa); Kaju secang (Madura); Cang (Bali); Sapang
(Makasar) (Verheij and Coronel, 1992).
Secang telah banyak dimanfaatkan sebagai sumber pewarna alami.
Pewarna ini digunakan untuk mewarnai pakaian, dan minuman penyegar. Di
Yogyakarta kayu
secang
banyak
diaplikasikan
sebagai
wedang
secang
dan wedang uwuh. Caesalpinia sappan L. merupakan tanaman obat tradisional
yang diproduksi di Taiwan, China, India, Myanmar, Vietnam, Sri Lanka, dan
Semenanjung Malaya. Secara tradisional, kayu secang digunakan sebagai ramuan
berair dan diresepkan untuk memperbaiki sistem darah, melancarkan menstruasi,
mengurangi rasa sakit dan bengkak, pengobatan deuretik serta penyakit kulit
tertentu (Wang et al., 2011).
Gambar tanaman kayu secang dapat dilihat pada Gambar 1.
(A)
(B)
Gambar 1. Tanaman Secang (Caesalpinia sappan L.) (A) Pohon Secang, dan (B) Batang Kayu
Secang (BPOM RI, 2008)
8
b. Kandungan Kimia
Komponen kandungan kimia kayu secang adalah brazilin, brazilein,
protosappanin A, 4-O-methylsappanol, dan caesalpin J (Shimokawa et al., 1985;
Namikoshi et al., 1987; Kim et al., 2012; Lee et al., 2010; Washiyama et al.,
2009).
Struktur kandungan kimia kayu secang dapat dilihat pada Gambar 2:
A
B
D
E
C
Gambar 2. Struktur Kandungan Kimia Kayu Secang. Brazilin (A), Brazilein (B),
Protosappanin A (C), 4-O-methylsappanol (D), dan Caesalpin J (E)
c. Potensi dan Penelitian Terdahulu
Ekstrak etanolik kayu secang mengandung senyawa flavonoid, terpenoid,
saponin dan fenolik (Lim et al., 1997). Berdasarkan penelitian terdahulu
melaporkan bahwa senyawa flavonoid dalam kayu secang (Caesalpinia sappan
L.) seperti brazilin dan brazilein terbukti mempunyai efek antiinflamasi,
9
antioksidan, antimikroba, antivirus, antitumor, antiatherosclerosis, hipoglikemik,
dan lain-lain (Wang et al., 2011; Bae et al., 2005), serta mampu menjaga sistem
homeostasis tubuh dan mampu menginduksi kematian sel pada sel kanker leher
(Badami et al., 2003). Brazilein merupakan bentuk oksidatif dari brazilin yang
memiliki berbagai macam aktivitas biologi, seperti agregasi platelet (Chang et al.,
2013), vasorelaksasi (Sasaki et al., 2010), dan anti alergi pada asma (Lee et al.,
2012). Brazilin juga diketahui dapat menghambat proliferasi sel glioblastoma
(Yen et al., 2010).
Brazilein merupakan termasuk kedalam golongan homoisoflavonoid
tetrasiklik (Yan et al., 2005). Brazilein terbukti memiliki aktivitas sitotoksik
vyang signifikan terhadap sel kanker HepG2 dan Hep3B (liver), MDA-MB-231
dan MCF-7 (payudara), A549 (paru-paru), dan CA9-22 (gingiva) (Yen et al.,
2010). Penelitian lain membuktikan bahwa brazilein juga memiliki aktivitas
antikanker pada sel leukimia K562/AO2 yang mengalami ekspresi berlebih
ABCB1 serta menginduksi apoptosis pada sel tersebut (Tao et al., 2011).
Brazilein merupakan kelompok IAP (Inhibitor of Apoptosis) yang memiliki
kemampuan untuk menghambat ekspresi reseptor survivin, yaitu reseptor yang
memiliki peranan penting dalam regulasi kematian sel, perkembangan siklus sel,
dan divisi sel. Brazilein juga memiliki aktivitas menghambat migrasi dan invasi
sel kanker metastasis MDA-MB-23 melalui inaktivasi jalur PI3K/Akt dan p38
MAPK sehingga menghambat aktivasi NFκB (Hsieh et al., 2013)
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh group Cancer
Chemoprevention
Research
Center
(CCRC)
terhadap
tanaman
secang
10
(Caesalpinia sappan L.), dilaporkan bahwa fraksi etil asetat Caesalpinia sappan
L. (FEC) memiliki efek sitotoksik melalui jalur apotosis pada sel kanker payudara
T47D dengan nilai IC50 sebesar 55 µg/mL (Kristiani, 2013), serta kombinasi FEC
dan agen kemoterapi doxorubicin memiliki sinergisitas yang sangat kuat dengan
konsentrasi FEC dan doxorubicin senilai 1 10 IC50 – 1 10 IC50, 1 10 IC50 – 1 8
IC50, 1 8 IC50 – 1 10 IC50, dan 1 8 IC50 – 1 8 IC50 (Kristiani, 2013). Ekstrak
etanolik kayu secang memiliki efek sitotoksik pada sel kanker kolon WiDr dengan
nilai IC50 senilai 32 µg/mL, dan mampu meningkatkan sensitivitas agen
kemoterapi 5-Fluorourasil pada sel kanker kolon WiDr dengan dosis kombinasi
optimum ekstrak 16 µg/mL (1 2 IC50) dan 5-Fluorourasil 168,75 µM (Rivanti,
2013). Fraksi brazilein kayu secang mampu meningkatkan aktivitas sitotoksik
pada sel kanker payudara T47D melalui induksi apoptosis dengan dosis kombinasi
optimum esktrak 1 2 IC50 (34 µg/mL) dan doxorubicin 1 2 IC50 (201 µg/mL)
(Utomo, 2014). Fraksi etil asetat secang (FES) memiliki aktivitas sitotoksik yang
poten melalui induksi jalur apoptosis pada sel kanker kolon WiDr dengan nilai
IC50 11 µg/mL, dan mampu meningkatkan sensitifitas agen kemoterapi 5-FU
dengan dosis kombinasi optimum ekstrak 1 µg/mL dan 5-FU 50 µM. Induksi
apoptosis pada sel kanker kolon WiDr oleh FES ditunjukkan pada peningkatan
cleaved PARP (Novarina, 2014). Fraksi brazilein kayu secang memiliki efek
sitotoksik melalui induksi apoptosis pada sel kanker payudara T47D dengan nilai
IC50 sebesar 68 µg/mL, serta mampu meningkatkan sensitivitas agen kemoterapi
Cisplatin dengan nilai combination index (CI) sebesar 0,66 (Tirtanirmala, 2014).
Berdasarkan penelitian Laksmiani pada tahun 2013 melaporkan bahwa brazilein
11
mampu meningkatkan aktivitas sitotoksik doxorubicin pada sel kanker payudara
MCF-7, serta brazilein memiliki potensi dalam menduduki sisi aktif reseptor Pgp,
IKK dan HER-2 berdasarkan uji in silico.
2. Kanker Payudara dan Sel MCF-7/HER-2
Kanker merupakan penyakit seluler akibat proliferasi sel secara terus
menerus dan tidak terkendali. Kanker menjadi istilah umum untuk penyakit yang
mampu mempengaruhi seluruh bagian tubuh. Tumor ganas dan neoplasma
merupakan beberapa istilah lain dari kanker (King, 2000). Beberapa faktor dalam
perkembangan tumor atau ketidakberhasilan dari suatu terapi tumor karena adanya
ketidakseimbangan antara kematian dan proliferasi sel kanker. Kanker terjadi
akibat adanya mutasi gen-gen regulator yang berfungsi untuk mengatur
homeostasis normal seluler. Regulator terbagi menjadi regulator positif
(oncogene) dan negatif (tumor suppressor gene). Regulator positif yang dapat
termutasi dan mengalami peningkatan ekspresi, sehingga dapat memicu proliferasi
sel. Begitu pula pada gen regulator negatif yang dapat mengalami mutasi sehingga
reseptor fungsionalnya menjadi inaktif, sehinga sel kehilangan kontrol untuk
menghentikan aktivasi proliferasi sel yang abnormal, contohnya mutasi gen p53
(DeVita et al., 2011).
Ciri-ciri sel kanker secara umum berdasarkan laporan Hanahan et al., pada tahun
2011 yaitu:
a. Memiliki potensi dalam produksi sinyal pertumbuhan secara mandiri. Secara
normal, sel akan membela jika terdapat sinyal dari luar sel. Namun, pada sel
12
kanker mampu menyediakan sinyal proliferasi secara mandiri sehingga
mampu membelah dan tumbuh secara terus menerus.
b. Memiliki kemampuan dalam menghindari sinyal penghambatan pertumbuhan.
Sel kanker tidak merespon inhibisi kontak, sehingga walaupun telah
bersinggungan dengan sel tetangganya sel kanker akan tetap tumbuh. Sel
kanker juga mengalami kerusakan pada jalur antiprolliferasi sehingga
menganggap tidak ada yang menghambat pertumbuhannya.
c. Secara normal sel yang mengalami kerusakan gen akan memprogram dirinya
untuk mati melalui mekanisme apoptosis. Namun, pada sel kanker dapat
bertahan dari kematian akibat apoptosis karena terjadi kerusakan pada jalur
apoptosis.
d. Sel kanker mampu menginduksi angiogenesis. Proses ini dibutuhkan untuk
memenuhi kebutuhan sel akan nutrisi dan oksigen sehingga sel-sel kanker
dapat tumbuh dan menyebar.
e. Sel kanker mengekspresikan telomerase dalam jumlah tinggi sehingga telomer
akan dipertahankan panjangnya. Oleh karena itu, sel kanker tidak akan
mengalami kematian ataupun senescence.
f. Pada sel kanker mampu melakukan proses invasi dan metastasis melalui
proses regulasi secara mandiri karena pada sel kanker terjadi kehilangan Echaderin, yaitu suatu molekul yang berperan dalam adhesi sel dengan sel yang
lain. Oleh karena itu, sel kanker mampu melepaskan diri dari koloninya,
kemudian melakukan intravasasi (masuk ke pembuluh darah dan limfa),
transit dalam sistem limfatik dan pembuluh darah, ekstravasasi (keluar dari
13
lumina) dan masuk ke dalam parenkim jaringan yang letaknya jauh,
membentuk nodul kecil sel kanker (mikrometastasis), dan akhirnya tumbuh
menjadi tumor yang makroskopis (kolonisasi).
g. Sel kanker mampu menghindari pengenalan dari sistem imun. Sistem imun
surveillance berespon untuk mengenali dan mengeliminasi tanda-tanda
pembentukan sel kanker yang akan berkembang. Perkembangan sel tumor
yang menginduksi terjadinya kanker ditandai dengan terjadinya defisiensi
sistem imun seperti CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs), CD4+Th1 helper T
cells dan natural killer (NK).
h. Sel kanker mampu melakukan regulasi kembali terhadap energetik seluler.
Sehingga melalui kemampuan ini menyebabkan proliferasi secara terus
menerus dan tidak terkontrol, hal ini dapat terjadi karena adanya anomali
metabolisme energi pada sel kanker yang terkait dengan proses glikolisis.
Oleh karena itu, dalam penanganan kasus ini dilakukan pengembangan
melalui inhibitor glikolisis aerobik untuk menurunkan energi metabolisme
yang dibutuhkan oleh pertumbuhan dan pembelahan sel kanker.
i. Sel kanker mengalami ketidakstabilan dan mutasi genom. Gen-gen penjaga
DNA biasanya mengalami kerusakan seiring dengan perkembangan kanker.
Ketidakstabilan genetik dapat menyebabkan kegagalan sel kanker untuk
melakukan apoptosis.
j. Sel kanker mampu memicu terjadinya proses inflamasi. Pada mekanisme kerja
sel-sel imun yang mampu mengenali sel tumor sehingga menimbulkan
peristiwa inflamasi minor pada jaringan non-neoplastik. Inflamasi dapat
14
menyediakan molekul bioaktif pada perkembangan tumor seperti faktor
pertumbuhan sehingga tetap dapat berproliferasi, faktor survival sehingga sel
bersifat immortal, faktor proangiogenik berperan dalam angiogenesis. Dari
pemicuan faktor-faktor tersebut, maka sel-sel normal dapat meningkatkan
kemampuan untuk berproliferasi dan menjadi neoplastik.
Pada tahun 2012, kanker payudara menjadi salah satu penyebab kematian
terbesar bagi kaum wanita diseluruh dunia (WHO, 2014). Berikut merupakan
rangkuman statistik kanker payudara di Indonesia yang diambil dari Pfizer Facts –
The Burden of Cancer in Asia pada tahun 2008:
a.
Di negara Asia kecepatan in
b.
sidensi kanker payudara terjadi per 100.000 wanita: dengan nilai sebesar
26,1 Indonesia berada di posisi keenam setelah negara Taiwan, Singapura,
Filipina, Jepang dan Malaysia.
c.
Di Indonesia jumlah kasus baru kanker payudara yang terjadi pada wanita
berada pada posisi pertama di antara negara-negara Asia dengan nilai
25.208.
d.
Di Indonesia kecepatan mortalitas kanker payudara yang terjadi pada wanita
berada pada posisi ketiga dengan nilai 11,3 dibanding negara Filipina dan
Malaysia.
e.
Di Indonesia kecepatan prevalensi kanker payudara yang terjadi pada
100.000 per wanita selama lima tahun, dengan nilai 82,3 Indonesia berada
di posisi kelima setelah negara Jepang, Singapura, Filipina dan Malaysia.
15
f.
Indonesia berada di posisi kedua dengan nilai 90.611 setelah negara China
untuk jumlah wanita yang sedang menderita dan terdiagnosis kanker
payudara selama lima tahun terakhir.
Kanker payudara adalah jenis kanker dimana terjadi penyerangan pada
membran mukosa dan kelenjar payudara terutama pada ductus (saluran yang
menyalurkan susu) dan lobus (kelenjar susu tempat produksi susu). Kanker
payudara terjadi ketika sel-sel pada payudara tumbuh tidak terkendali dan mampu
menginvasi jaringan tubuh yang lain. Penyakit ini termasuk penyakit yang sangat
kompleks baik secara klinis, morfologi, maupun secara molekuler (Eroles et al.,
2009). Secara molekular kanker payudara terjadi akibat mutasi pada onkogen cmyc, ERBB2 dan Ras, maupun mutasi pada gen BRCA1 (breast cancer type 1),
BRCA2 (breast cancer type 2), dan gen p53, atau inaktivasi gen p53 yang
mengakibatkan terjadinya kanker payudara karena hilangnya fungsi sebagai gen
tumor supresor (Ruddon, 2007). Proses proliferasi kanker payudara diinisiasi oleh
adanya ekspresi berlebih beberapa reseptor, misalnya estrogen reseptor (ER),
progesteron reseptor (PR) dan c-erbB (HER-2) yang merupakan reseptor
predisposisi kanker payudara (Eccles, 2001). Estrogen merupakan hormon yang
paling berperan dalam karsinogenesis kanker payudara. Estrogen jika berikatan
dengan reseptornya akan menimbulkan transduksi sinyal yang menyebabkan
proliferasi sel dan penghambatan apoptosis. Metabolit quinon merupakan hasil
metabolit estrogen yang bersifat genetoksik sehingga dapat menginisiasi
terjadinya sel kanker. Polimorfisme gen yang mengkode sintesis dan metabolisme
estrogen, seperti cytochrome P450 1B1 (CYP1B1) dan catechol-o-methyl
16
transferase (CMOT) menjadi salah satu faktor resiko lain terjadinya kanker
payudara (Yager et al., 2006).
Salah satu jenis sel kanker payudara yaitu sel kanker payudara MCF-7
yang merupakan jenis sel kanker payudara yang banyak digunakan dalam
penelitian. Sel kanker MCF-7 memiliki karakteristik eskpresi berlebih Pgp (Davis
et al., 2003), eskpresi berlebih Bcl-2 dan tidak mengekspresikan caspase-3
sehingga mampu melakukan proliferasi sel (Simstein et al., 2010). Sel MCF-7
diperoleh dari pleural effusion breast adenocarcinoma seorang pasien wanita
Kaukasian berumur 69 tahun, golongan darah O, dengan Rh positif. Sel MCF-7
termasuk estrogen receptor (ER) positif sehingga sering digunakan dalam studi
kanker payudara dan reseptor estrogen, serta ekspresi berlebih Bcl-2 dan tidak
mengeskpresikan caspase-3. Sel ini bersifat adheren (melekat), dapat tumbuh
dalam media pertumbuhan MEM dengan penambahan 10% FBS dan PenicilinStreptomycin 1% (ATCC, 2014).
Sel kanker payudara yang digunakan dalam penelitian ini yaitu sel kanker
payudara MCF-7 ekspresi berlebih HER2 (MCF-7/HER-2). Sel kultur MCF7/HER-2 dibuat dengan cara mentransfeksikan pcDNA5/TO-HER-2 yang telah
terkonjugasi dengan gen resisten antibiotik hygromicin dan ditanam didalam
media yang mengandung antibiotik hygromicin. Tujuan konjugasi gen resisten
antibiotik hygromicin yaitu untuk memastikan bahwa sel yang hidup merupakan
sel MCF-7 yang telah tertransfeksi gen HER-2.
17
3. Human Epidermal Receptor-2 (HER-2)
Reseptor HER-2 atau HER-2/neu merupakan anggota dari erbB/epidermal
growth factor receptor (EGFR)/reseptor tirosin kinase kelas I. Gen HER-2
menyandi 185 kDa reseptor sehingga HER-2 juga dikenal sebagai p185HER-2.
HER-2 mempunyai karakteristik struktur yang terdiri dari ligan ekstraseluler
(extracellular ligand-binding domain), suatu transmembran, tyrosine kinase
domain, dan ujung karboksil terminal. Reseptor HER-2 adalah salah satu dari
empat anggota keluarga HER dari reseptor tirosin kinase transmembran. Jalur
transduksi sinyal HER-2 melalui dimerisasi dan autofosforilisasi dengan reseptor
lain dari anggota HER (HER-1 atau EGFR, HER-3, HER-4). HER-2 berpengaruh
pada proliferasi sel tumor, survival, metastasis, kemampuan menginvasi jaringan
dan angiogenesis (Laskin et al., 2004).
HER-2 memiliki potensi dalam peningkatan reseptor antiapoptosis Bcl-2
dan survivin melalui aktivasi jalur MAP kinase dan PI3K-Akt. Jalur MAP kinase
memiliki kemampuan dalam memfosforilisasi IĸB sehingga terbentuk kompleks
IĸB dengan NFĸB sehingga NFĸB lepas dan menjadi faktor transkripsi dan masuk
kedalam nukleus sehingga terjadi proliferasi sel (Siddiqa et al., 2008).
18
Gambar 3. Jalur Sinyal MAP Kinase pada HER-2. Aktivasi HER-2 melalui dimerisasi
(heterodimer atau homodimer) akan mengaktivasi protein downstream sehingga mempengaruhi
proliferasi (Kruser and Wheeler, 2010)
Katalisis transfer fosfat dari ATP ke gugus –OH tirosis pada reseptor
target merupakan mekanisme kerja dari anggota reseptor kinase, yaitu suatu
reseptor transmembran. Aktivasi reseptor tirosin kinase (RTK) terjadi jika berada
dalam
konformasi
dimer.
Dimerisasi
RTK
menyebabkan
terjadinya
autofosforilisasi pada residu asam amino. Proses automerisasi dapat memicu
aktivasi jalur RAS/RAF/MAPK (Konkimalla et al., 2009). Jalur MAP kinase
mampu memfosforilasi IĸB sehingga kompleks IĸB dengan NFĸB menjadi
terlepas dan NFĸB sebagai faktor transkripsi menjadi aktif masuk ke dalam
nukleus dan proliferasi sel terjadi. NFĸB juga mempengaruhi peningkatan
ekspresi Bcl-2 dan survivin suatu reseptor antiapoptosis. Jalur PI3K/Akt mampu
mengaktivasi IKK. IKK akan mendegradasi IĸB, sehingga faktor transkripsi
NFĸB bebas dan terjadi proses seperti sebelumnya sehingga sel akan terus
membelah dan dibutuhkan konsentrasi agen kemoterapi yang lebih tinggi untuk
19
dapat menghambat proliferasi sel (Siddiqa et al., 2008). Oleh karena itu,
penghambatan aktivasi HER-2 pada ATP binding site menjadi target
pengembangan dalam penemuan obat yang bertarget molekuler pada sel kanker
payudara (Vora et al., 2009).
Beberapa contoh obat yang memiliki aktivitas penghambatan tertarget
pada reseptor HER-2 yaitu lapatinib. Lapatinib merupakan suatu small molecule,
yang memiliki BM 581,06 dengan rumus molekul C29H26ClFN4O4S. Lapatinib
bertindak sebagai inhibitor tyrosine kinase (TKI) pada HER1 (EGFR) dan HER-2.
Lapatinib beraksi pada ATP binding site HER1 (EGFR) dan HER-2, sehingga
menghambat terjadinya proses fosforilisasi dan jalur downstream yang mengatur
proliferasi sel seperti ERK1-2 dan PI3K-AKT (Medina and Goodin, 2008).
Namun yang menjadi kendala saat ini, pengobatan kanker payudara HER-2 positif
menggunakan Lapatinib telah mengalami resitensi. Beberapa mekanisme yang
menyebabkan terjadinya resistensi yaitu karena inaktivasi obat oleh enzim
pemetabolisme, pengeluaran obat oleh Pgp, adanya mutasi target obat, serta
adanya ekspresi berlebih reseptor HER-2 (Davis et al., 2003). Oleh karena itu,
dibutuhkan suatu alternatif dalam pengobatan kanker payudara HER-2 positif.
F. Landasan Teori
Berdasarkan penelitian terdahulu dilaporkan bahwa ekstrak etanolik kayu
secang memiliki kandungan senyawa flavanoid seperti brazilein. Brazilein
dilaporkan memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker liver HepG2, dan Hep3B,
sel kanker paru-paru A549, sel kanker gingival CA9-22 dan sel kanker leukemia
20
K562, serta pada sel kanker payudara MCF-7 dan MDA-MB-231. Oleh karena
itu, berdasarkan data-data tersebut maka esktrak etanolik kayu secang memiliki
aktivitas sitotoksik pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2.
Berdasarkan penelitian terdahulu penghambatan aktivasi reseptor HER-2
pada ATP binding site menjadi target molekuler pada pengembangan obat pada sel
kanker payudara HER-2 positif. HER-2 memiliki potensi dalam peningkatan
reseptor antiapoptosis Bcl-2 dan survivin melalui aktivasi jalur MAP kinase dan
PI3K-Akt. Jalur MAP kinase memiliki kemampuan dalam memfosforilisasi IĸB
sehingga terbentuk kompleks IĸB dengan NFĸB sehingga NFĸB lepas dan
menjadi faktor transkripsi dan masuk kedalam nukleus sehingga terjadi proliferasi
sel. Penelitian terdahulu melaporkan bahwa brazilein memiliki potensi dalam
inaktivasi jalur PI3K/Akt dan p38 MAPK sehingga menghambat aktivasi NFκB.
Oleh karena itu, berdasarkan data-data ini ekstrak etanolik kayu secang mampu
menghambat ekspresi reseptor HER-2 pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2.
G. Hipotesis
1. Ekstrak etanolik kayu secang bersifat sitotoksik terhadap sel kanker payudara
MCF-7/HER-2.
2. Ekstrak etanolik kayu secang mampu menghambat ekspresi reseptor HER-2
pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2.
BAB II
METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
1. Identifikasi Variabel Penelitian
Penelitian dilakukan menggunakan rancangan eksperimental murni post
test only control group design dengan variabel-variabel sebagai berikut :
a. Variabel bebas
: seri konsentrasi EEKS
b. Variabel tergantung
: viabilitas sel, ekspresi reseptor HER-2
c. Variabel terkendali
: kondisi penelitian seperti suhu dan tekanan
inkubator, lama waktu inkubasi, serta jumlah sel
MCF-7/HER-2 tiap sumuran.
2. Definisi Variabel Operasional
a. Ekstrak etanolik kayu secang diperoleh melalui maserasi menggunakan
etanol 70% kemudian dipekatkan dengan vacuum rotary evaporator.
b. Seri konsentrasi ekstrak etanolik kayu secang yang digunakan pada
perlakuan tunggal selama 24 jam pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2
yaitu 1, 2, 5, 10, 20, 50 µg/mL.
c. Konsentrasi ekstrak etanolik kayu secang yang digunakan pada perlakuan
tunggal selama 24 jam untuk pengamatan eskpresi reseptor HER-2 yaitu ½
IC50 (12,5 µg/mL).
21
22
d. Viabilitas sel adalah parameter uji sitotoksik yang menunjukkan
kemampuan suatu sel untuk bertahan hidup dan mengeskpresikan potensi
diri.
e. Intensitas pendaran fluoresence pada membran sel kanker payudara MCF7/HER-2 adalah parameter terhadap ekspresi reseptor HER-2.
f. Kondisi penelitian adalah kondisi optimal yang dibutuhkan dalam
pelaksanaan uji in vitro diantaranya suhu dan aliran CO2 inkubator adalah
370C dan 5%, inkubasi dilakukan selama 24 jam.
3. Tahapan Penelitian yang Dilakukan
a. Ekstraksi serbuk kayu secang menggunakan metode maserasi.
b. Uji kandungan senyawa brazilein dalam EEKS dengan metode
Kromatografi Lapis Tipis (KLT).
c. Uji sitotoksik tunggal menggunakan MTT assay.
d. Pengamatan ekspresi reseptor HER-2 menggunakan Immunofluoresence
assay.
e. Analisis data.
B. Bahan Penelitian
1. Bahan Uji
EEKS didapatkan dari ekstraksi serbuk kayu secang (Caesalpinia sappan L.)
yang diperoleh dari B2P2TOOT Tawangmangu, Jawa Tengah. Ekstraksi
dilakukan dengan menggunakan metode maserasi dengan etanol 70%.
Perbandingan serbuk kayu secang dan etanol 70% yang digunakan dalam
maserasi sebesar 1:10, serta dilakukan maserasi selama 5 hari dan dilanjutkan
23
remaserasi selama 3 hari. Filtrat disaring dan diuapkan dengan vacuum rotary
evaporator dan penguapan lebih lanjut menggunakan waterbath hingga
diperoleh ekstrak kental.
2. Bahan untuk Uji Kandungan Senyawa Kimia Brazilein dalam EEKS
dengan Kromatografi Lapis Tipis
Sistem kromatografi meliputi fase diam silika gel 60 F254 dengan sistem fase
gerak menggunakan etil asetat, toluen, dan asam asetat glasial. Pembanding
brazilein yang digunakan diperoleh dari hasil isolasi Lakmiani (2013) yang
telah diuji kemurniannya menggunakan beberapa metode, seperti KLT,
diperoleh 1 spot dengan nilai hRf 87,5 dan metode densitomtri diperoleh
nilai yang sama antara panjang gelombang puncak dominan pada
kromatogram dengan panjang gelombang maksimal isolat yakni 329 nm.
3. Bahan untuk Uji Penghambatan Pertumbuhan Sel dengan MTT assay
dan
Penghambatan
Ekspresi
Reseptor
HER-2
Menggunakan
Immunofluoresence assay
a. Sel kanker. Sel kanker payudara yang digunakan merupakan cell line
kanker payudara MCF-7 HER-2 positif (MCF-7/HER-2) yang merupakan
koleksi CCRC, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada dari Prof.
Inouye melalui Prof. Kawaichi, Nara Institute of Science and Technology
(NAIST) Jepang.
b. Medium. Sel MCF-7/HER-2 ditumbuhkan pada media penumbuh lengkap
yang mengandung Dulbeco Modified Eagle Media (DMEM) (Gibco),
Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (FBS Qualified, Gibco, Invitrogen
24
USA), penisilin-streptomisin 1.5% (v/v) (Gibco Invitrogen, USA),
fungizone (Gibco Invitrogen, USA), (tripsin-EDTA 0,25% (Gibco,
Invitrogen, Canada), Hygromicin 100 µg/mL.
c. DMSO (Merck) digunakan untuk melarutkan stok ekstrak uji.
d. Tripsin-EDTA 0,25% untuk membantu melepas sel yang melekat pada
flask maupun dish.
e. Phosphate Buffer Saline (PBS) sebagai larutan pencuci.
f. Reagen MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida]
(Sigma) 5mg/mL dalam medium DMEM.
g. Reagen stopper sodium dodecyl sulphate (SDS)-HCl 0.05%.
h. Pengecatan DAPI.
i. Antibodi primer anti-HER-2.
j. Antibodi sekunder Alexa 488 anti-mouse.
k. Fluoromount.
C. Alat Penelitian
Pada uji in vitro, digunakan oven, autoclave (Hirayama), Laminar Air
Flow Hood (Labconco), inkubator CO2 (Heraeus), inverted microscope (Zeiss
MC 80), Elisa reader (SLT 240 ATC), hemocytometer (Neubauer), cell
counter, penangas air, neraca analitik (Sartorius), mikropipet (Gilson),
sentrifuge (Sorvall), yellow dan blue tip, tissue culture dish (nunclon), tabung
conical (Nunclon), 96-well plate (Iwaki), 6-well plate (Iwaki), shaker (MRKRETAC), vortex, eppendorf steril (plasti brand), kamera digital (Canon, Japan),
25
dan PC. Pada pembuatan ekstrak kental menggunakan vacuum rotary
evaporator dan waterbath.
D. Prosedur Penelitian
1. Ekstraksi Kayu Secang
Serbuk serutan kayu secang diperoleh dari Balai Besar Penelitian dan
Pengembangan
Tanaman
Obat
Obat
Tradisional
(B2P2TOOT)
Tawangmangu, Jawa Tengah kemudian dideterminasi di Laboratorium
Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Serbuk
dimaserasi menggunakan etanol 70% dengan perbandingan 1:10 selama 3
hari dan dilanjutkan remaserasi selama 2 hari. Filtrat disaring dan diuapkan
dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak etanolik kental kayu
secang (EEKS) (Anonim, 2010).
2. Uji Kandungan Senyawa Kimia Brazilein dalam EEKS dengan
Kromatografi Lapis Tipis
Pengujian kandungan senyawa kimia EEKS dilakukan menggunakan
kromatografi lapis tipis (KLT). Sistem fase diam digunakan plat silika gel 60
GF254 dan fase gerak etil asetat : toluen : dan asam asetat glasial dengan
perbandingan 7:3:1. Penentuan jenis kandungan senyawa kimia yang dimiliki
ditentukan berdasarkan nilai hRf dan warna spot yang terlihat pada profil
kromatogram sampel dan senyawa pembanding (Chang et al., 2013).
26
3. Sterilisasi Alat
Seluruh alat yang akan digunakan terlebih dahulu dicuci dengan
sabun, dikeringkan, disterilisasi dengan autoklaf selama 20 menit pada suhu
121oC, dan dikeringkan dalam oven. Pengerjaan uji in vitro dilakukan secara
aseptis dalam LAF yang telah disterilisasi dengan sinar UV selama 30 menit
dan disemprot etanol 70% (Rutala et al., 2008).
4. Pembuatan Medium Kultur DMEM High Glucose
Pembuatan media stok dilakukan dengan cara melarutkan DMEM
dalam aquades. Larutan distirer kemudian dibuffer dengan HCL encer 1 N
hingga pH 7,2-7,4. Selanjutnya larutan disaring dengan filter polietilensulfon
steril 0,2 µm secara aseptis di dalam LAF. Media komplit dibuat dengan
mencampurkan 10 mL FBS 10% (Gibco), 1,5 mL penisilin-streptomisin 1,5%
(Gibco), 0,5 mL fungizone 0,5% (Gibco), Hygromicin 100 µg/mL dan
DMEM Hi Glucose 1640 (Gibco) (De Angelis, 2006).
5. Propagasi, Kultur, dan Pemanenan Sel MCF-7/HER-2
Medium kultur DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) Hi
disiapkan dan dibuat alikuot 3 mL dalam conical tube steril. Sel diambil dari
tangki nitrogen cair, dicairkan pada suhu kamar hingga tepat mencair.
Suspensi sel segera diambil dengan mikropipet 1 mL dan dimasukkan ke
dalam medium kultur yang telah disiapkan tetes demi tetes. Conical tube
ditutup rapat lalu disentrifugasi pada 1000 rpm selama 1 menit. Supernatan
dibuang, pelet ditambah 5 mL medium, disuspensikan perlahan hingga
homogen, kemudian sel dihitung menggunakan hemocytometer. Sel ditransfer
27
ke dalam 2 buah tissue culture dish masing-masing sebanyak 1x106 dan
ditambah medium kultur hingga volume 8 mL. Kondisi sel diamati di bawah
mikroskop lalu diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37oC dengan aliran 5%
CO2. Setelah kondisi sel diperkirakan akan melekat pada bagian dasar tissue
culture dish yang ditunjukkan dengan adanya perbesaran sitoplasma sel maka
antibiotik hygromicin segerah ditambahkan kedalam media dengan
konsentrasi akhir 100 µg/mL dalam tissue culture dish.
Dilakukan penggantian medium kultur, dilanjutkan dengan subkultur
sel sebanyak 2-3 kali hingga kemudian dapat digunakan untuk tahap
penelitian selanjutnya. Panen sel dilakukan setelah 80% sel konfluen. Sel
diambil dari inkubator CO2 dan diamati di bawah mikroskop. Medium
dibuang dan sel dicuci 2 kali menggunakan PBS. Sel dilepaskan dari dinding
dish dengan menambahkan tripsin-EDTA 0,25% sebanyak 500 µL kemudian
dinkubasi pada suhu ruang selama 30 detik. Diakhir inkubasi, sel ditambah
medium kultur untuk menginaktifkan tripsin-EDTA dan diresuspensi. Setelah
itu, dilakukan pengamatan di bawah mikroskop untuk memastikan sel telah
terlepas dan tidak menggerombol (terlepas satu-satu). Sel yang telah terlepas
satu-satu di pindah ke tabung conical steril baru dan ditambah 2-3 mL
medium kultur dan diresuspensi kembali. Sebanyak 10 µL sel diambil dan
ditransfel ke dalam hemacytometer dan sel dihitung di bawah mikroskop.
Sejumlah sel yang diperlukan ditransfer ke dalam conical steril yang lain dan
ditambah medium kultur sesuai dengan kepadatan yang dikehendaki. Uji
sitotoksisitas dengan MTT assay digunakan konsentrasi 1x104 sel/sumuran
28
dan untuk uji siklus sel dengan flowcytometry digunakan konsentrasi 2x105
sel/sumuran (Mosmann, 1983).
6. Pembuatan Larutan Uji
Ekstrak etanolik kayu secang yang telah dilarutkan dalam DMSO
dibuat stok dengan kadar 50 mg/mL dan stok selalu dibuat baru. Stok larutan
uji yang digunakan kemudian diberikan ke sel dalam seri konsentrasi 1-200
µg/mL. Semua larutan dibuat dalam media kultur. Preparasi larutan uji
dilakukan secara aseptis di dalam LAF.
7. Uji Sitotoksik Tunggal
Uji sitotoksik dilakukan dengan menggunakan MTT assay seperti
yang dikemukakan oleh Mosmann pada tahun 1983 yang didasarkan pada
kemampuan enzim dehidrogenase mitokondria pada sel yang hidup untuk
memecah cincin tetrazolium dari MTT yang berwarna kuning pucat menjadi
kristal formazan yang berwarna ungu.
Jumlah sel dihitung dan dibuat pengenceran dengan media kultur
(MK) sesuai dengan kebutuhan. Sel kemudian ditransfer ke dalam sumuran,
masing-masing 100 µL lalu diinkubasi semalam. Media dibuang dan sel
dicuci dengan PBS lalu ditambahkan 100 µL media baru ke dalam sumuran
yang berisi seri kadar larutan uji dan diinkubasi 24 jam. Setelah diinkubasi,
media dibuang dan sel dicuci dengan PBS lalu ditambahkan reagen MTT
dalam MK (5 mg/10 mL) sebanyak 100 µL/sumuran dan diinkubasi 3 jam.
Setelah itu, ditambahkan stopper SDS 10% dalam 0,01 N HCl kemudian
dibaca dengan ELISA reader λ 595 nm dan diperoleh serapan yang
29
menyatakan absorbansi sel MCF-7/HER-2 yang hidup. Persentase sel hidup
dihitung dengan membuat kurva antara persentase sel hidup vs log kadar
sehingga diperoleh harga IC50 senyawa uji terhadap sel MCF-7/HER-2
(Mosmann, 1983).
8.
Pengamatan Ekspresi Reseptor HER-2 dengan Immunofluoresence assay
Pengamatan ekspresi reseptor HER-2 dengan immunofluoresence
assay. Sel MCF-7/HER-2 yang telah konfluen dipanen dengan tripsin dan
didistribusikan dengan konsentrasi 5 x 104 sel/sumuran ke dalam 24 well
plate dan diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C dan konsentrasi CO2
5% untuk beradaptasi dan menempel di sumuran. Sel MCF-7/HER-2 diberi
perlakuan larutan uji dan diinkubasi kembali selama 15 jam pada suhu 37°C 5
% CO2. Inkubasi dengan 50 µL blocking serum (1% BSA in PBS) selama 30
menit pada suhu kamar. Cuci PBS 3 kali masing-masing selama 5 menit.
Inkubasi dengan 50 µL antibodi monoklonal primer untuk antigen yang ingin
diamati (HER-2) overnight di tempat gelap pada suhu 40C. Dicuci PBS 3 kali
masing-masing 5 menit. Inkubasi 50 µL dengan antibodi sekunder Alexa 488
anti-mouse selama 1 jam pada suhu kamar di tembat gelap. Cuci PBS 3 kali
masing-masing selama 15 menit. Inkubasi di tempat gelap dengan 50 µL
DAPI selama 10 menit. Cuci ditempat gelap dengan PBS sebanyak 3 kali.
Ditetesi 10 µL mounting solution (fluoromount) pada slide glass dan
dilekatkan cover glass di atasnya secara terbalik. Disimpan di tempat gelap
pada suhu 40C. Dibaca menggunakan mikroskop fluorecens untuk
30
(λeks=494nm,
FITC/Alexa
λem=518nm)
dan
DAPI
(λeks=341nm,
λem=452nm).
E. Analisis Data
1. Karakterisasi Profil Kromatogram
Analisis bercak hasil elusi EEKS dengan pembanding senyawa
brazilein murni. Nilai homologous Retention factor (hRf) ditentukan dengan
rumus: hRf =
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘𝑏𝑒𝑟𝑐𝑎𝑘 ℎ𝑎𝑠𝑖𝑙𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖 (𝑐𝑚 )
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘𝑒𝑙𝑢𝑠𝑖 (𝑐𝑚 )
𝑥 100
2. Uji Sitotoksik Tunggal
Data yang diperoleh berupa absorbansi masing-masing sumuran
dikonversi ke dalam persen sel hidup dan dianalisis dengan statistik
menggunakan metode uji korelasi yang diikuti dengan uji signifikansi persen
sel hidup dihitung menggunakan rumus:
% sel hidup =
𝑎𝑏𝑠 .𝑠𝑒𝑙𝑑𝑒𝑛𝑔𝑎𝑛𝑝𝑒𝑟𝑙𝑎𝑘𝑢𝑎𝑛
−𝑎𝑏𝑠 .𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
𝑎𝑏𝑠 .𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑠𝑒𝑙 −𝑎𝑏𝑠 .𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
𝑥 100%
Kemudian dihitung konsentrasi IC50 dengan menggunakan metode log
probit untuk mendapatkan linearitas antara log konsentrasi dengan persen sel
hidup. IC50 adalah konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% populasi sel
sehingga dapat diketahui potensi sitotoksisitasnya.
3. Pengamatan Ekspresi Reseptor HER-2
Ekspresi
reseptor
HER-2
diamati
menggunakan
mikroskop
fluorescence. Sel yang mengekspresikan reseptor HER-2 pada transmembran
sel akan memberikan pendaran warna hijau jika diamati pada λ FITC/Alexa
31
(λeks=494nm, λem=518nm) dan intisel akan terwarnai pendaran biru jika
diamati pada λ DAPI (λeks=341nm, λem=452nm).
F. Skema Penelitian
Gambar 4. Skema penelitian
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil
Tujuan dari penelitian ini untuk mengeskplorasi dan menelusuri potensi
EEKS sebagai agen sitotoksik terhadap sel kanker payudara HER-2 positif (MCF7/HER-2). Penelitian ini meliputi evaluasi aktivitas sitotoksik EEKS pada sel
MCF-7/HER-2 secara kuantitatif berdasarkan nilai IC50 yang diperoleh, serta
dilakukan pengamatan ekspresi reseptor HER-2 sebagai evaluasi dalam
pengamatan lebih lanjut terhadap aktivitas sitotoksik EEKS pada sel kanker
payudara MCF-7/HER-2. Untuk mencapai tujuan penelitian yang diharapkan,
dilakukan identifikasi kandungan senyawa EEKS terlebih dahulu menggunakan
kromatografi lapis tipis (KLT), yang kemudian diikuti dengan uji sitotoksisitas
tunggal EEKS pada sel MCF-7/HER-2 menggunakan MTT assay, dan kemudian
dilanjutkan dengan deteksi ekspresi reseptor HER-2 dengan Immunofluoresence
assay.
1.
Determinasi, Ekstraksi, dan Uji Kandungan Senyawa Kimia Serbuk
Kayu Secang (Caesalpinia sappan L.)
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan identitas simplisia uji
dan menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan simplisia yang akan
digunakan untuk penelitian. Determinasi serbuk batang kayu secang dilakukan di
laboratorium Farmakognosi, Bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM
Yogyakarta.
32
33
Hasil determinasi diketahui bahwa sampel serbuk batang kayu yang digunakan
dalam penelitian ini adalah benar merupakan serbuk Caesalpinia sappan L. atau
secang. Surat keterangan hasil determinasi serbuk secang secara mikroskopik
dapat dilihat pada lampiran 1.
Pembuatan ekstrak etanolik kayu secang (Caesalpinia sappan L.)
dilakukan dengan cara maserasi menggunakan etanol 70%. Maserasi adalah
proses penyarian yang dilakukan dengan merendam simplisia dalam labu alas
bulat menggunakan pelarut yang sesuai. Metode ini tidak melibatkan pemanasan
sehingga tidak berisiko merusak kandungan senyawa aktif yang termolabil dalam
serbuk. Etanol memiliki titik didih 78,4 °C sehingga relatif mudah dalam
pemekatan ekstrak melalui evaporasi. Etanol merupakan pelarut universal yang
memiliki struktur molekul kecil mampu menembus semua jaringan tanaman untuk
menarik senyawa aktif keluar sehingga senyawa aktif dalam kayu secang
khususnya brazilein dapat tersari. Maserasi dilakukan dengan cara merendam 500
gram serbuk batang kayu secang kedalam pelarut etanol 70% sebanyak 5 liter.
Perendaman dilakukan selama 5 hari dan disertai degan penggojogan 2 kali sehari
selama 15 menit. Setelah itu dilakukan remaserasi selama 3 hari dengan kondisi
perlakuan yang sama. Hal ini dimaksudkan agar senyawa yang terkandung dalam
sampel dapat tersari secara maksimal. Filtrat yang diperoleh selanjutnya
dipekatkan melalui penguapan menggunakan vacuum rotary evaporator. Dari 500
gram serbuk simplisia yang diekstraksi didapatkan 115 gram dengan rendemen 23
% b/b ekstrak etanol kental berwarna cokelat pekat. Hasil perhitungan ekstraksi
kayu secang dapat dilihat pada lampiran 2.
34
Uji
kandungan
senyawa
kimia
EEKS
dianalisis
menggunakan
kromatografi lapis tipis (KLT) dengan standar pembanding senyawa brazilein.
EEKS dan brazilein diuji secara kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam
silika gel 60 GF254 dengan fase geraketil asetat : toluen : dan asam asetat glasial =
7:3:1 v/v.
Hasil uji KLT, pengamatan di sinar tampak, UV 254, dan UV 366 terlihat
seperti pada Gambar 5:
hRF
(A)
(B)
(C)
Gambar 5. Profil kromatografi Lapis Tipis EEKS. Hasil Elusi diamati pada (A) sinar tampak,
(B) sinar UV 254 nm, dan (C) sinar UV 366 nm. EEKS dan brazilein dilarutkan dalam etanol 70%
dan dielusi dalam system fase diam silika gel 60 GF254 dan fase gerak etil asetat : toluen : dan
asam asetat glasial = 7:3:1 v/v, dengan jarak elusi 8 cm. Keterangan S adalah Sampel (EEKS) dan
P adalah Pembanding (Brazilein).
35
Tabel I. Keterangan hRf Spot pada Plat KLT
Nomor
Spot
1.
2.
3.
Sampel (EEKS)
Nilai hRf
Warna
60
Cokelat
75
Cokelat
85
Cokelat
Pembanding (Brazilein)
Nilai hRf
Keterangan
75
Cokelat
85
Cokelat
Spot pertama pada EEKS terdapat pada hRf 60 yang berwarna cokelat
dengan intensitas yang rendah. Dilihat dari nilai hRf yang kecil, diduga senyawa
tersebut memiliki polaritas yang sangat tinggi, karena lebih terjerap pada fase
diam silika gel yang cenderung lebih bersifat polar karena adanya kandungan
SiOH, dibanding sifat kepolaran fase gerak yang lebih cenderung bersifat semipolar. Spot selanjutnya terdapat pada nilai hRf 75 dan memiliki spot berwarna
cokelat dengan intesitas yang sedikit lebih tinggi dibanding spot pada hRf 60.
Spot dengan hRf yang lebih tinggi merupakan senyawa dengan kepolaran yang
lebih rendah. Spot pada hRf 75 diduga memiliki tingkat kepolaran yang lebih
rendah dibanding spot hRf 60, tetapi memiliki tingkat kepolaran yang lebih tinggi
dibanding spot ke tiga pada EEKS. Pada spot ke tiga memiliki corak warna yang
sama dengan pembanding yaitu warna cokelat dengan nilai hRf yang sama dengan
pembanding yakni 85. Hal ini menunjukkan bahwa dalam EEKS terdapat senyawa
yang sama dengan pembanding yakni senyawa brazilein. Hal ini dikarenakan
terdapat seyawa yang sama antar kandungan senyawa EEKS dan brazilein, serta
kedua senyawa ini memiliki sifat kepolaran yang sama dengan fase gerak yakni
cenderung bersifat semi-polar sehingga keduanya akan lebih cenderung ikut
terelusi bersama fase gerak.
36
2.
Uji Sitotoksik Tunggal Ekstrak Etanolik Kayu Secang terhadap Sel
MCF-7/HER-2
Uji sitotoksisitas ekstrak etanolik kayu secang (EEKS) terhadap sel
MCF-7/HER-2 dilakukan untuk mengetahui potensi aktivitas sitotoksik EEKS
terhadap sel kanker payudara ekspresi berlebih HER-2 menggunakan MTT assay.
Prinsip dasar MTT assay yaitu adanya kemampuan enzim suksinat dehidrogenase
pada sel normal, dalam mereduksi garam tetrazolium MTT (berwarna kuning)
menjadi garam formazan (berwarna ungu). Banyaknya garam formazan yang
terbentuk menggambarkan banyaknya sel hidup. Namun, pada sel kanker yang
telah diberi perlakuan terjadi penurunan aktivitas enzim suksinat dehidrogenase
sehingga dapat menurunkan viabilitas sel. Berdasarkan prinsip ini, kemudian
dapat diperoleh potensi sitotoksik senyawa uji dengan parameter nilai IC50, yaitu
konsentrasi yang menyebabkan penghambatan pertumbuhan sel sebesar 50%
populasi.
37
Hasil uji sitotoksisitas EEKS pada sel MCF-7/HER-2 dapat dilihat pada
viabilitas sel (%)
Gambar 6.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
60
Konsentrasi (µg/mL)
(D)
Gambar 6. Aktivitas Sitotoksik EEKS pada Sel MCF-7/HER-2. Gambar morfologisel tanpa
dan dengan perlakuan tunggal EEKS yang diinkubasi selama 24 jam. Sel diamati dengan inverted
microscope perbesaran 400x. (A) kontrol sel, (B) EEKS 10 µg/mL, dan (C) EEKS 50 µg/mL.
Grafik hubungan viabilitas sel dan konsentrasi menunjukkan fenomena dose dependent (D). Sel
hidup ditunjukkan dengan tanda panah (
) sedangkan sel yang mengalami perubahan morfologi
dibandingkan sel yang sehat dimungkinkan sel tersebut mengalami kematian, ditunjukkan dengan
tanda panah putus-putus (
).
38
Pada penelitian ini, uji sitotoksik tunggal EEKS dilakukan dengan masa
inkubasi selama 24 jam dan menunjukkan fenomena dose dependent, yaitu terjadi
peningkatan efek sitotoksik seiring dengan peningkatan konsentrasi EEKS yang
digunakan. Perlakuan EEKS tunggal selama 24 jam dengan seri konsentrasi 1, 2,
5, 10, 20, dan 50 μg/mL menunjukkan banyak sel yang yang mengalami
perubahan morfologi. Hal ini dapat ditunjukkan pada Gambar 6A-C.
Fenomena tersebut diperkuat dengan pengamatan morfologi sel. Terjadi
perubahan morfologi sel MCF-7/HER-2 seiring dengan peningkatan dosis
perlakuan EEKS. Sel mengalami perubahan ukuran volume sel, kondisi yang
tidak attach, berbentuk bulat tidak beraturan dan terjadi penipisan sitoplasma
dibandingkan dengan ukuran sel normal yang memiliki bentuk sitoplasma yang
cenderung lebih besar.
Nilai IC50 dari perlakuan tunggal EEKS yang diperoleh pada penelitian
ini sebesar 25 μg/mL (Gambar 6D). Perhitungan nilai IC50 dapat dilihat pada
lampiran 3. Nilai IC50 diperoleh dari hasil regresi linier antara konsentrasi
perlakuan dengan persen viabilitas sel dan terdapat nilai koefisien korelasi r. Nilai
koefisien korelasi r menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi senyawa
dengan aktivitas sitotoksik yang ditimbulkannya. Hasil analisis regresi linier
viabilitas sel dengan konsentrasi perlakuan diperoleh persamaan y=-1,538x+89,08
dengan nilai r2 sebesar 0,938. Terdapat hubungan yang linier antara viabilitas sel
kanker MCF-7/HER-2 dengan berbagai konsentrasi perlakuan EEKS. Oleh karena
itu, dapat dikatakan bahwa EEKS memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker
payudara ekspresi berlebih reseptor HER-2 (MCF-7/HER-2). Pengamatan lebih
39
lanjut mengenai aktivitas sitotoksik EEKS terhadap sel kanker payudara MCF7/HER-2 yang bertarget molekuler pada reseptor HER-2 dapat dilakukan melalui
pengamatan ekspresi reseptor HER-2 akibat perlakuan EEKS.
3. Pengamatan Ekspresi Reseptor HER-2
Pengamatan ekspresi reseptor HER-2 dilakukan untuk menganalisis lebih
lanjut mengenai aktivitas sitotoksik EEKS pada MCF-7/HER-2 yang bertarget
molekuler pada reseptor HER-2. Pengamatan ekspresi reseptor HER-2 dilakukan
menggunakan Immunofluoresence assay. Parameter pengamatan dilakukan secara
kualitatif terhadap perubahan intensitas ekspresi reseptor HER-2 yang terletak
pada transmembran sel. Prinsip metode ini yaitu memanfaatkan interaksi antigen
dan antibodi. Pada pengamatan ekspresi reseptor HER-2 menggunakan
pengecatan DAPI dan Alexa 488 anti-mouse. DAPI berfungsi untuk menunjukkan
letak dan jumlah sel. Mekanisme penandaan sel oleh DAPI yaitu melalui
interkalasi DNA pada inti sel. Pengecatan menggunakan antibodi sekunder Alexa
488 anti-mouse ditujukan untuk pengecatan reseptor HER-2 yang terletak pada
transmembran sel melalui prinsip interaksi antigen-antibodi. HER-2 berperan
sebagai antigen yang akan ditandai oleh antibodi primer anti-HER-2 dan
selanjutnya akan ditandai oleh antibodi sekunder Alexa 488 anti-mouse.
Berdasarkan hasil yang diperoleh, ekspresi reseptor HER-2 pada sel
MCF-7/HER-2 yang diberi perlakuan EEKS ½ IC50 (12,5 µg/mL) mengalami
penurunan ekspresi reseptor HER-2 dibanding kontrol sel yang tidak diberi
perlakuan. Hasil yang diperoleh dapat dilihat pada Gambar 7:
40
(A)
(C)
(B)
(D)
Gambar 7. Hasil Pengamatan Ekspresi Reseptor HER-2 pada Sel MCF-7/HER-2 Setelah
Perlakuan EEKS. Sel sebanyak 5x104/sumuran ditanam dan diinkubasi di atas coverslip dalam 6
well. Perlakuan diberikan setelah 24 jam setelah proses penanaman sel. Konsentrasi EEKS yang
digunakan adalah 12,5 µg/mL. Pengamatan sel menggunakan mikroskop fluorescence dengan
perbesaran 400x. Gambar sel yang ditampilkan merupakan gambar sel pada salah satu sudut
bidang pandang mikroskop fluorescence. Gambar tersebut merupakan hasil screening mengenai
intensitas penghambatan ekspresi HER-2 terhadap beberapa gambar yang diperoleh. Pada gambar
(A) kontrol sel pengecatan DAPI, gambar (B) kontrol sel dengan pengecatan Alexa 488 antimouse, gambar (C) perlakuan EEKS 12,5 µg/mL dengan pengecatan DAPI, dan gambar (D)
perlakuan EEKS 12,5 µg/mL dengan pengecatan Alexa 488 anti-mouse. Perubahan ekspresi
reseptor ditunjukkan dengan panah (
).
Terjadinya penurunan ekspresi reseptor HER-2 dengan adanya perlakuan EEKS
ditunjukkan dengan adanya penurunan intesistas warna hijau pada transmembran
sel. Oleh karena itu, berdasarkan data ini, bahwa EEKS mampu menurunkan
ekspresi reseptor HER-2 pada sel MCF-7/HER-2.
41
B. Pembahasan
Penelitian ini bertujuan untuk mengekplorasi potensi bahan alam kayu
secang (Caesalpinia sappan L.) sebagai agen sitotoksik sel kanker payudara yang
bertarget secara molekuler pada reseptor HER-2 melalui pemodelan sel MCF-7
ekspresi berlebih reseptor HER-2 (MCF-7/HER-2). Ekspresi berlebih reseptor
HER-2 merupakan salah satu faktor yang sangat mempengaruhi proliferasi sel
kanker payudara dan mampu menginduksi terjadinya proses migrasi dan
metastasis sel kanker (Lasen et al., 2004; Johnson et al., 2010). HER-2 merupakan
salah satu upstream dari berbagai downstream sistem regulasi pada sel.
Berdasarkan penelitian terdahulu, dilaporkan bahwa kayu secang baik dalam
bentuk ekstrak maupun kandungan aktifnya yakni brazilin dan brazilein terbukti
memiliki aktivitas sitotoksik pada beberapa sel kanker secara in vitro melalui
beberapa jalur (Hsieh et al., 2013). Target brazilein pada berbagai jalur dapat
dilihat pada gambar 8.
Gambar 8. Target Brazilein pada Berbagai Jalur
Pada jalur MAPK, brazilein mampu menghambat fosforilasi dari p38 mitogenactivated reseptor kinase, sehingga mampu menghambat faktor transkripsi yang
42
terlibat dalam proses prolifersi sel. Pada jalur PI3K/Akt, brazilein dilaporkan
mampu menekan fosforilasi phosphatidylinositide-3-kinase sehingga IKK menjadi
inaktif, dan tidak terjadi degradasi IĸB, maka faktor trankripsi NFĸB menjadi
inaktif sehingga ekspresi protein pada sistem proliferasi sel dapat terhambat
(Konkimalla et al., 2009). Berbagai target penelitian tersebut merupakan
downstream HER-2, sehingga HER-2 menjadi sangat penting untuk diamati. Oleh
karena itu, diperlukan adanya penelitian yang akan mendukung pemanfaatan kayu
secang sebagai substituen ataupun komplemen, pada pengobatan kanker payudara
yang bertarget secara spesifik pada reseptor HER-2.
Pada penelitian ini, dilakukan pengujian aktivitas sitotoksik ekstrak
etanolik kayu secang (EEKS) pada sel kanker payudara ekspresi berlebih reseptor
HER-2 (MCF-7/HER-2) secara in vitro. Selain itu dilakukan penelitian lebih
lanjut mengenai salah satu target sitotoksik EEKS terhadap sel MCF-7/HER-2
yakni melalui penghambatan ekspresi reseptor HER-2. Pada penelitian ini,
brazilein yang merupakan salah satu senyawa aktif dari kayu secang disari dengan
etanol 70% menggunakan metode maserasi. Penyarian menggunakan etanol yang
bersifat polar ditujukan untuk menyari komponen kayu secang, dikarenakan
komponen kayu secang yang mayoritas merupakan senyawa fenolik dan flavanoid
bersifat polar hingga semi-polar. Selanjutnya dilakukan analisis kandungan kimia
dalam ekstrak kayu secang dengan kromatografi lapis tipis. Kandungan senyawa
kimia yang akan diidentifikasi dalam ekstrak etanolik kayu secang adalah
brazilein, sehingga brazilein digunakan sebagai pembanding. Hasil KLT
mengindikasikan adanya senyawa dengan polaritas yang sama antara pembanding
43
brazilein dengan EEKS (Gambar 5). Pada penelitian ini belum dilakukan
standarisasi ekstrak. Akan lebih baik apabila pada penelitian selanjutnya
dilakukan standardisasi ekstrak sehingga reprodusibilitasnya dapat terjaga.
Ekstrak yang sudah didapat kemudian diuji aktivitas sitotoksiknya. Uji
sitotoksik dilakukan selama 24 jam. Hal ini bertujuan mengetahui apakah EEKS
dapat memberikan aktivitas sitotoksik dalam jangka waktu 24 jam terhadap sel
kanker payudara MCF-7/HER-2. Dari hasil regresi linier antara konsentrasi
perlakuan EEKS dengan viabilitas sel diperoleh nilai IC50 sebesar 25 μg/mL
(Gambar 6D). Nilai IC50 yang diperoleh berada di bawah 100 μg/mL, maka dapat
dikatakan bahwa EEKS berpotensi sebagai agen sitotoksik (Teng., 2005). Hal ini
sesuai dengan penelitian sebelumnya yang menyatakan bahwa secang memiliki
aktvitas sitotoksik pada berbagai sel kanker. Berdasarkan penelitian sebelumnya
yang telah dilakukan oleh CCRC, brazilein memiliki aktivitas sitotoksik pada
berbagai sel kanker seperti T47D, MCF-7, dan WiDr dengan nilai IC50 sebesar 55
μg/mL, 37 μg/mL, dan 32 μg/mL (Kristiani, 2013; Khamsita, 2012; Rivanti,
2013). Nilai IC50 yang diperoleh pada penelitian sebelumnya jauh lebih besar
dibanding nilai IC50 EEKS pada sel kanker MCF-7/HER-2, maka dapat dikatakan
EEKS memiliki aktivitas sitotoksik yang baik pada sel kanker payudara ekspresi
berlebih reseptor HER-2. Serta berdasarkan penelitian Khamsita (2012) bahwa
EEKS memiliki aktivitas sitotoksik yang lebih baik pada kombinasi dengan agen
kemoterapi.
Pengamatan ekspresi reseptor HER-2 dilakukan untuk menelusuri
aktivitas sitotoksik EEKS pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2 yang bertarget
44
pada reseptor HER-2. Tahapan ini menjadi sangat penting, karena melihat
pengaruh yang sangat besar akibat ekspresi berlebih reseptor HER-2 terhadap
proliferasi sel kanker payudara hingga mampu menginduksi terjadinya proses
migrasi hingga metastasis. Hal ini menjadi salah satu bagian dari penelitian besar
yang sedang dilaksanakan oleh group CCRC mengenai eksplorasi potensi
brazilein dari kayu secang terhadap penghambatan metastasis sel kanker payudara
MCF-7/HER-2. Serta melihat penggunaan lapatinip yang kini dilaporkan telah
mengalami resistensi dalam penanganan kasus kanker payudara MCF-7 HER-2
positif, maka pengamatan pada ekspresi reseptor HER-2 menjadi sangat penting.
Pada penelitian ini, pengamatan ekspresi reseptor HER-2 dilakukan menggunakan
immunofluoresence assay. Berdasarkan hasil yang diperoleh, dengan adanya
perlakukan EEKS 12,5 µg/mL mampu menurunkan intensitas ekspresi reseptor
HER-2 pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2 dibanding kontrol yang tidak
diberi perlakuan EEKS. Hasil ini sesuai dengan penelitian sebelumnya, yang
menyatakan bahwa brazilein mampu berinteraksi pada reseptor HER-2
menggunakan studi in silico (docking molecular). Hasil analisis docking yang
dilakukan oleh (Laksmiani et al., 2013) antara brazilein dan ATP pada HER-2
(PDB ID 3PP0), dimana brazilein mampu berinteraksi dengan reseptor HER-2
pada ATP binding site. Interaksi yang terjadi melalui ikatan hidrofobik, dan
menggunakan residu asam amino Tyr 91. Sedangkan, ligan native HER-2
berikatan pada reseptor HER-2 melalui ikatan hidrogen dengan residu asam amino
Glu 43, Tyr 91, Thr 94, Ser 44 dan Asn 135. Oleh karena itu, dapat dikatakan
bahwa brazilein dari EEKS mampu berinteraksi pada reseptor HER-2 karena
45
adanya situs ikat yang sama yakni residu asam amino Tyr 91. Kemampuan
brazilein dalam berinteraksi pada reseptor HER-2 menjadi salah satu alasan dalam
mekanisme penghambatan aktivasi downstream HER-2, hal ini diperkirakan
karena adanya penghambatan dimerisasi reseptor HER-2 sehingga tidak terjadi
fosforilasi pada reseptor HER-2, akibatnya terjadi penghambatan proliferasi sel
dan penurunan ekspresi reseptor HER-2. Penurunan ekspresi reseptor HER-2
diperkuat dengan adanya penelitian terdahulu yang menyatakan kemampuan
brazilein dalam menginaktivasi NFĸB, sehingga faktor transkripsi NFĸB dalam
inti sel menjadi inaktif kemudian mengakibatkan ekspresi protein yang berperan
dalam proliferasi sel dan eskpresi reseptor HER-2 menjadi terhambat (Konkimalla
et al., 2009; Hsieh et al., 2013).
Secara keseluruhan dari data-data tersebut, diketahui bahwa EEKS
memiliki aktivitas sitotoksik pada sel kanker payudara MCF-7/HER-2, serta
mampu
menurunkan
ekspresi
reseptor
HER-2
sehingga
EEKS
dapat
dikembangkan sebagai agen sitotoksik pada terapi kanker payudara yang bertarget
pada reseptor HER-2. Pengkajian kombinasi EEKS juga perlu dilakukan karena
melihat penelitian sebelumnya yang menujukkan aktivitas sitotoksik EEKS yang
lebih baik melalui kombinasi dengan agen kemoterapi. Serta penelusuran
mekanisme molekuler lebih lanjut pada pada pathway HER-2 sehingga kasus
kanker payudara HER-2 positif dapat diatasi.