Document

Dr. Pradipto Subiyantoro, drg., Sp., BM
NIP 195706291984031003
Sebagai Staf Pengajar pada Fakultas Kedokteran
Lahir di Malang, 29 Juni 1957
FK
8
Riwayat Pendidikan:
 S-1. Universitas Airlangga, 1982
Bidang Ilmu: Ilmu Kedokteran Gigi
 S-2/Sp. Universitas Gadjah Mada, 1995
Bidang Ilmu: Sp. Bedah Mulut
 S-3. Universitas Airlangga, 2010
Bidang Ilmu: Ilmu Kedokteran
Judul Disertasi
DETECTION OF GENE P14ARF METHYLATION IN ORAL SQUAMOUS CELL
CARCINOMA IN PATIENTS AT DR MUWARDI HOSPITAL, SURAKARTA
DETEKSI METILASI GEN P14ARF KARSINOMA SEL SKUAMOSA RONGGA
MULUT PADA PENDERITA DI RS DR MUWARDI SURAKARTA
Oral squamous cell carcinoma is the sixth
cancer disease in the world. It presents as a
genetic
and
epigenetic
accumulation
commonly occurs in cigarette smokers. The
gene p14ARF is a tumor suppressor gene that is
able to bind MDM protein whose function is
to
destroy
the
protein
p53.
The
hypermethylation of exon 1
inactivation of the gene, as had been reported
in several cancers, including oral cancer.
However, up to the moment the role of gene
methylation in the carcinogenesis of oral
squamous cell carcinoma remains unclear.
This was a laboratory explorative
study with a general objective to disclose the
carcinogenesis of oral squamous cell
carcinoma by detecting the occurrence of
p14ARF gene methylation in oral squamous cell
carcinoma in patients of Dr Muwardi
Hospital, Surakarta.
Samples were fresh tissues from
patients diagnosed with oral squamous cell
carcinoma in Dr Muwardi Hospital,
Surakarta, with age characteristics between 33
and 70 years, 2 males and 2 females with
tumor site on the tongue, and with cancer type
of squamous cell carcinoma. The samples of
oral squamous cell carcinoma from the
operation were divided into two parts. One
Karsinoma sel skuamosa rongga mulut
adalah penyakit kanker ke enam di dunia yang
merupakan akumulasi genetik dan epigenetik
yang biasanya terjadi pada perokok. Gen p14ARF
adalah tumor supressor gene yang dapat
mengikat
protein
MDM
yang
berfungsi
menghancurkan protein p53. Hipermetilasi exon
1β dari p14ARF menghasilkan inaktifasi gen
tersebut, seperti yang telah dilaporkan pada
beberapa kanker termasuk kanker rongga mulut,
tetapi sampai saat ini peranan metilasi gen
dalam karsinogenesis karsinoma sel skuamosa
rongga mulut masih belum jelas.
Penelitian
ini
adalah
penelitian
eksploratif labolatorik yang secara umum
bertujuan menjelaskan karsinogenesis karsinoma
sel skuamosa rongga mulut dengan cara
mendeteksi kejadian metilasi gen p14ARF pada
karsinoma sel skuamosa rongga mulut pada
penderita di Rumah Sakit Dr Muwardi Surakarta.
Sampel penelitian adalah jaringan segar
dari pasien dengan diagnosis karsinoma sel
skuamosa rongga mulut di Rumah Sakit Dr
Muwardi Surakarta dengan karakteristik umur
antara 33-70 tahun, 2 wanita 2 pria dengan
lokasi tumor pada lidah, dengan tipe kanker
karsinoma sel skuamosa. Sampel karsinoma sel
skuamosa rongga mulut hasil operasi dibagi
was delivered to Department of Anatomic
Pathology, and the other was kept within
freezer in -80oC until being used. In addition,
blood sample was also taken from healthy
non-cancer patients.
The identification of p14ARF gene was
performed from oral squamous cell carcinoma
tissue, which was including DNA extraction,
DNA level, PCR, and electrophoresis. DNA
extraction was performed using Genomic
DNA Purification Kit (Fermentas). p14ARF
gene was identified with p14ARF forward and
p14ARF reverse primers from Sato (2002). The
analysis of p14ARF gene was performed with
bisulfite modification using Methylcode
Bisulfite Conversion Kit (Invitrogen) and
analyzed with specific methylated PCR (MSP)
method using published primer (Sato, 2002)
with fully methylated positive control using
CpG methyl transferase sss I (New England
Biolab) from blood samples of healthy
individuals. MSP was performed with
annealing, as that of Sato (2002), which was
in 58oC. However, the produced bands were
not clear in methylated and unmethylated
primers. By increasing the annealing
temperature to 65oC, clear band was obtained
in methylated primer, while there was no
band in unmethylated primer.
Results revealed that methylation
occurred in 4 samples. Results of interview
revealed that there were no cigarette smokers
among the patients, either passively or
actively. All patients were Javanese, and
commonly lived in rural area with averagely
less satisfactory oral hygiene. In such
condition, oral cancer methylation was not
caused by cigarette, as that found in other
studies in other countries. Less adequate
knowledge on nutrition and presence of
numerous congenital abnormalities in rural
children allow the occurrence of oral cancer,
which is caused by the insufficiency of folic
acid. The role of folic acid is in the formation
of pyrimidine. Pyrimidine is a component of
DNA that produces protein, so the proteincontaining cell can perform its function.
When the folic acid is insufficient, there is an
increasing risk of no formation of pyrimidine,
allowing the breaking of DNA strands. The
result of this damage in DNA may affect SAdenosyl
methionine
production
and
hypomethylation will occur in the oncogene.
When hypermethylation also occurs in p14ARF
gene, the gene will not be able to trigger
apoptosis in the mutated DNA. Therefore, this
study will address the following questions: 1.
menjadi dua bagian yang dikirim ke Bagian
Patologi Anatomi dan bagian lainnya disimpan di
dalam freezer –800C sampai akan digunakan,
selain itu juga diambil sampel darah dari
penderita sehat non kanker.
Identifikasi gen p14ARF dilakukan dari
jaringan karsinoma sel skuamosa rongga mulut
yang meliputi ekstraksi DNA, pengukuran kadar
DNA, PCR dan elektroforesis. Ekstraksi DNA
dilakukan dengan menggunakan Genomic DNA
Purification Kit (Fermentas). Gen p14ARF
diidentifikasi dengan menggunakan primer
p14ARF forward dan p14ARF reverse yang diambil
dari Sato (2002).
Analisis metilasi gen p14ARF dilakukan
dengan
modifikasi
bisulfit
menggunakan
Methylcode Bisulfite Conversion Kit (Invitrogen)
dan dianalisa dengan metoda spesifik metilated
PCR (MSP) dengan menggunakan primer yang
telah dipublikasikan (Sato, 2002) dengan control
positive
yang
fully
metilated
dengan
menggunakan CpG methyl transferase sss I
(New England Biolab) dari sampel darah orang
sehat. MSP dilakukan dengan annealing yang
telah dilakukan Sato, 2002 yaitu 58 0C
menghasilkan band yang kurang jelas pada
primer methylated dan unmethylated. Dengan
menaikkan suhu annealing menjadi 650C
didapatkan band yang jelas pada methylated dan
tidak timbul band pada primmer unmethylated.
Hasil menunjukkan terjadi metilasi pada
4 sampel tersebut. Hasil interview dengan pasien
tidak ada pasien yang merokok baik aktif
maupun pasif, pasien semua dari ras jawa dan
umumnya hidup di pedesaan dengan kondisi
kebersihan mulut yang rata-rata kurang baik.
Pada keadaan ini metilasi kanker rongga mulut
tidak
disebabkan
oleh
karena
rokok
sebagaimana beberapa penelitian lain didunia.
Pengetahuan gizi yang kurang dan masih
banyaknya cacat bawaan pada anak-anak
dipedesaan memungkinkan terjadi kanker rongga
mulut disebabkan oleh karena kekurangan asam
folat. Peranan asam folat adalah pembentukan
pirimidin yang merupakan komponen dari DNA
yang menghasilkan protein sehingga sel yang
mengandung protein tersebut berfungsi. Apabila
terjadi kekurangan asam folat maka akan
meningkatkan resiko tidak terbentuknya pirimidin
sehingga dapat memungkinkan DNA strands
break. Akibat DNA damage yang terjadi maka
akan mempengaruhi produksi S Adenosine
methionin dan terjadi hipometilasi pada onkogen.
Apabila juga terjadi hipermetilasi pada gen
What is the correlation between folic acid
level in the body and the occurrence of oral
cancer? 2. Is there any difference in folic acid
level between oral cancer patients and
normal? 3. Is there any correlation between
folic acid level and the type of DNA damage?
The results of this study lead to
conclusions that: 1) Methylation in p14ARF
gene has a role and it is one of many processes
in oral carcinogenesis, particularly the
squamous cell carcinoma. 2) Optimum
condition to detect methylation with MSP in
this study was in annealing temperature of
65oC. 3) A different finding was found in this
study. Methylation in p14ARF gene was found
in all oral squamous cell carcinoma patients
participating in this study, while these
patients were not cigarette smokers. Whereas,
studies in other countries revealed that
majority of p14ARF gene methylation occurred
in cigarette smokers. Therefore, factors other
than being a cigarette smoker should be
considered as the cause of squamous cell
carcinoma.
p14ARF maka gen tersebut tidak dapat memicu
terjadinya apoptosis terhadap DNA yang
mengalami mutasi tersebut, sehingga dalam
penelitian ini timbul pertanyaan 1. Bagaimana
kaitan kadar asam folat tubuh dengan terjadinya
kanker rongga mulut? 2. Apakah ada perbedaan
kadar asam folat penderita kanker rongga mulut
dan normal? 3. Apakah ada kaitan antara kadar
asam folat dengan jenis DNA damage ?
Berdasarkan hasil penelitian ini dapat
disimpulkan bahwa: 1) Metilasi pada gen p14ARF
mempunyai peranan dan merupakan salah satu
dari banyak proses dalam karsinogenesisrongga
mulut terutama untuk karsinoma sel skuamusa.
2) Kondisi optimum untuk mendeteksi metilasi
dengan MSP pada penelitian ini yaitu pada suhu
annealing 650C. 3) Hasil yang berbeda dari
penelitian ini yaitu metilasi pada gen p14ARF
terjadi pada semua penderita karsinoma sel
skuamusa rongga mulut peserta penelitian ini
dan semua penderita tersebut bukan perokok,
sedangkan hasil penelitian di negara lain
menunjukkan bahwa mayoritas metilasi pada
gen p14ARF terjadi pada perokok sehingga perlu
dipertimbangkan faktor lain selain perokok
sebagai penyebab karsinoma sel skuamosa.