enzim endonuklease restriksi kul 3

Enzim
Endonuklease Restiksi
Enzim Endonuklease Restriksi
Ditemukan tahun 1962 di dalam bakteri
Bakteri E. coli memiliki sistem kekebalan enzimatik yang
dapat mengenal dan menghancurkan DNA asing
3,000 telah diidentifikasi, ratusan telah dikomersialkan
Enzim endonuklease yang bersifat
khas ini mempuinyai kekhususan
karena hanya memotong DNA untai
ganda yang mempunyai urutan
nukleotida tertentu. Enzim
endonuklease restriksi dibedakan
menjadi tiga tipe, yaitu tipe I, tipe
II,dan tipe III.
Enzim Endonuklease Restriksi Tipe I
Enzim endonuklease restriksi tipe I
merupakan enzim nuclease yang
kompleks, misalnya enzim yang ada pada
E. coli B (disebut enzim EcoB), dan E.
coli K12 (disebut EcoK). Enzim ini
mempunyai aktivitas endonuklease
sekaligus metilase dan memerlukan ATP,
Mg2+, dan S-adenosil metionin sebagai
kofaktor.
Enzim Endonuklease Restriksi Tipe I
Enzim ini mengenali urutan nukleotida
tertentu (recognition site) yang berupa
urutan pasangan basa sebagai berikut:
EcoK, mengenali urutan
5’AACNNNNNNGTGC-3’, sedangkan
EcoB mengenali urutan
5’-TGANNNNNNNNTGCT-3’. Huruf N
menyatakan basa nukleotida apa saja
(tidak spesifik).
Enzim Endonuklease Restriksi Tipe I
Tidak digunakan dalam rekayasa
genetik
Meskipun enzim ini secara spesifik
mengenali daerah tertentu, tetapi
enzim ini memotong DNA pada
daerah yang berlainan dengan
daerah pengenalannya sehingga
pemotongannya tidak spesifik.
Enzim Endonuklease Restriksi Tipe II
enzim tipe II mempunyai spesifitas.
Daerah yang dikenali maupun daerah
yang dipotong enzim tersebut bersifat
spesifik dan terletak pada bagian yang
sama. Enzim ini sangat stabil dan
hanya memerlukan Mg2+ sebagai
kofaktor.
Enzim Endonuklease Restriksi Tipe II
Enzim endonuklease restriksi
tipe II dapat dibedakan atas
urutan nukleotida yang dikenali
yang dapat berupa urutan
empat, lima, atau enam basa
spesifik.
Enzim Endonuklease Restriksi Tipe II
Contohnya enzim EcoRI yang
diisolasi dari bakteri Escherichia coli
mempunyai daerah pengenalan dan
pemotongan DNA berupa urutan
5’-GAATTC-3’
Endonuklease restriksi tipe III
Endonuklease restriksi tipe III
juga memotong DNA pada bagian
yang spesifik tetapi pada daerah
yang berdekatan dengan daerah
pengenalannya. Juga tidak
digunakan dalam rekayasa genetik
Tata Nama
Dinamai dari genus, species, strain, dan tipe
Contoh : EcoR1
Genus: Escherichia
Species: coli
Strain: R
urutan penemuan: 1
Recognition Site= Sisi pengenalan
Mempunyai simetri (palindromic)
5’-GGATCC-3’
Bam H1 site:
3’-CCTAGG-5’
Sticky ends and blunt ends
Ujung lancip dan ujung tumpul
Enzim mengenal urutan spesifik 4-8 bp
Beberpa enzim memotong dg pola - “sticky ends”
EcoRI
5’…GAATTC…3’
3’…CTTAAG…5’
Beberpa enzim memotong dg pola – “blunt ends”
PvuII
5’…CAGCTG…3’
3’…GTCGAC…5’
Penggunaan dalam rekayasa genetik
Human DNA cleaved with EcoRI
5’-C-G-G-T-A-C-T-A-OH
3’-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-PO4
Corn DNA cleaved with EcoRI
+
PO4-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
HO-T-C-G-A-T-G-C-5’
Complementary base pairing
5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G T-C-G-A-T-G-C-5’
+ DNA Ligase, + ATP
5’-A-C-G-G-T-A-C-T-A-G-A-A-T-T-C-A-G-C-T-A-C-G-3’
3’-T-G-C-C-A-T-G-A-T-C-T-T-A-A-G-T-C-G-A-T-G-C-5’
recombinant DNA molecule