ACARA ELEKTROFORESIS TUJUAN DASAR TEORI Elektroforesis

ACARA ELEKTROFORESIS
I.
II.
TUJUAN
DASAR TEORI
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.
Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan
biokimia dan biologi molekuler (Magdeldin, 2012). Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai
saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik.
Molekul-molekul tersebut akan bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya (Magdeldin, 2012). Molekul-molekul
yang bermuatan negatif (anion) akan bergerak menuju kutub positif (anoda), sedangkan
molekul-molekul yang bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif
(katoda) (Klug and Cummings, 1994). Komponen utamanya meliputi
a. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH
tertentu.
b. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas (selulosa asetat,
selulosa nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar.
c. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.
Menurut Pratiwi (2001), elektroforesis dibedakan menjadi :
1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ionion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang
sistem pemisahan.
2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diam
untuk memisahkan molekul-molekul. Elektroforesis gel memiliki beberapa
komponen yang terdiri dari:
1. Comb: digunakan untuk membentuk well pada gel agarosa.
2. Tray: digunakan untuk sebagai cetakan gel agarosa.
3. Chamber: digunakan sebagai wadah gel agarosa.
4. Sumber listrik: digunakan untuk memberi arus saat proses elektroforesis.
3.
Elektroforesis kapiler ialah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan
resolusi tinggi yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker
berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA
yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan
basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker
yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh
marker DNA adalah lambda HindIII. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA
dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb. Penggunaan DNA marker tersebut dikarenakan
molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110-- 20.000 pb.
(Birren & Lai 1993: 82; Martin 1996: 77).
Bufer (penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat
mempengaruhi kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang
bermuatan. Kekuatan ion yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga
aliran listrik menjadi maksimal. Hal ini dapat mempercepat gerakan molekul protein.
Kekuatan ion rendah dalam bufer akan menurunkan panas sehingga aliran listrik akan
sangat minimal dan migrasi molekul protein sangat lambat (Wolfe 1993: 127; Bowen 2000:
3-4). Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah bahan kimia inert yang bersifat
relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang baik, sebagai migrasi
elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel poliakrilamid. Jika
ukuran pori dari medium kira-kira sama dengan molekul, maka molekul yang lebih kecil
akan berpindah lebih bebas di dalam medan listrik, sedangkan molekul yang lebih besar
akan dibatasi dalam migrasinya. Besarnya pori-pori dapat diatur dengan mengubah
konsentrasi penyusun gel poliakrilamidnya yaitu akrilamid dan bisakrilamid (Martin,
1996).
Dalam elektroforesis juga digunakan bahan-bahan sepert Etidium Bromida yang
bersifat karsinogenik dan Brom Fenol Blue. Hal tersebut karena Etidium Bromida dapat
meningkatkan daya fluoresensi dari DNA sehingga dapat terlihat jelas, sedangkan Brom
Fenol Blue berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel
(Birren & Lai 1993: 79--81).
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi
dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan
untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan
komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu. Aplikasi elektroforesis dapat
digunakan dalam uji paternitas dan identifikasi pelaku kejahatan (DNA fingerprinting).
Elektroforesis juga berperan dalamhuman genome project (Fairbanks & Andersen, 1999).
III.
METODE
a. Alat dan Bahan
Alat – alat yang digunakan dalam percobaan ini meliputi gelas beker sebagai wadah
larutan buffer, labu ukur untuk menghomogenasi larutan, gelas ukur untuk mengambil
larutan dalam volume tertentu. Kemudian Erlenmeyer sebagai wadah pembuatan minigel,
microwave untuk memanaskan dan mengeringkan sampel, glass plate, mikropipet untuk
mengambil larutan dengan volume ml serta lampu UV. Sedangkan bahan yang dibutuhkan
diantaranya larutan tris-borat EDTA (tris-borat dan EDTA), akuades, agarosa 0,8%, larutan
etidium – bromide, dan loading buffer (gliserol 30%, bromphenol biru 0,25%, xylencyanol
dalam akuades).
b. Cara Kerja
IV.
HASIL dan PEMBAHASAN
a. Hasil
b. Pembahasan
Mekanismenya yaitu didasarkan pada pergerakan molekul bermuatan dalam media penyangga
matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa
atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang
berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis
poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Lokasi fragmen DNA yang
terbentuk seperti pita-pita pada elektroforesis dapat diamati secara spesifik dengan menggunakan
pewarna. Pewarna yang digunakan adalah etidium bromida yang dapat menyisip di antara basabasa pada DNA. Gel yang diberi etidium bromida dan disinari dengan UV akan memperlihatkan
lokasi DNA sebagai untai berwarna merah-jingga. Terdapat komponen loading dye yang berfungsi
sebagai pemberat agar tidak keluar dari sumuran dengan komposisi campuran dari larutan gliserol
30%, bromphenol biru 0,25%, dan xylencyanol yang dilarutkan dalam akuades. Larutan ini
memiliki warna biru pekat.
Proses pembuatan gel agarosa dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk agarosa 400mg
dengan larutan 1X TBE larutan buffer sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi
dari fragmen DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik,bubuk dipanaskan,kemudian dinginkan
sampai 50-55oC dan tambahkan etidium bromida, dituangkan ke dalam cetakan yang telah
disiapkan dengan comb-nya yang terpasang secara tegak lurus dan tunggu sampai mengeras.
Penambahan etidium bromida dilakukan dengan tujuan mewarnai asam nukleat. Etidium bromida
adalah mutagen dan harus ditangani dengan hati-hati. Tahap selanjutnya adalah mencampurkan
DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi membantu sampel turun ke dalam well dan
membantu memonitor berapa lama proses elektroforesis telah berlangsung. DNA memiliki muatan
negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju kutub positif.
Dalam mencampurkan sampel dengan loading buffer dilakukan secara Up and Down dengan
menggunakan mikropipet. Hal ini bertujuan agar larutan tersebut dapat tercampur secara merata.
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik.
Gel dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah mengalami perubahan warna dan dilihat dengan
sinar UV.
Hasil dari elektroforesis gel agarosa akan menunjukkan warna biru dari loading dye pada posisi
paling depan kemudian plasmid DNA berwarna orange terang. Berdasarkan pustaka, teknik
elektroforesis pada dasarnya didasarkan pada fakta bahwa DNA cenderung bermuatan negatif pada
pH netral dengan buffer phospat sebagai penyangga pH agar. Saat dilakukan elektroforesis dengan
memberikan daya listrik di kedua kutub maka DNA akan bergerak ke kutub positif dan diperoleh
warna merah – jingga (Deer Lee et al., 2011).
V.
VI.
SIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Birren, B., E. Lai. 1993. Pulsed field gel electrophoresis: a practical guide. Academic
Press, Inc., San Diego.
Der Lee et al., 2011. Automatic DNA Sequencing For Electrophoresis Gel Using Image
Processing Algorithms. J. Biomedical Science and Engineering, 2011, 4, 523-528
Fairbanks, D.J., W.R. Andersen. 1999. Genetics: The continuity of life. Brooks/Cole
Publishing Company, New York.
Klug, W.S., M.R. Cummings. 1994. Concept of genetics 4th ed. Merrill Publishing Co. :
Columbus, Ohio.
Magdeldin, Sameh. 2012. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. InTech Publisher :
Rijeka, Croatia.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd.,
Oxford.
Pratiwi, R. 2001. Mengenal Metode Elektroforesis. Oseana. Volume XXVI. No 1.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing
Company, Belmont: xvii + 820 hlm.