Microbiological Procedures

Prosedur Pengujian Mikrobiologi
untuk Identifikasi Agen Penyebab
Mastitis Subklinis pada Sapi Perah
Alpha-Beta hemolytic Staphylococcus aureus
Daftar Isi
Pendahuluan
Bab 1
Cara Penanganan dan Pengambilan contoh
1. Bahan pengambilan contoh
Bab 2
2. Teknik pengambilan contoh
3. Penanganan dan penyimpanan contoh
Bahan dan Alat Diagnostik
1. Pendahuluan dan informasi umum
2. Peralatan yang dibutuhkan
1
2
2
3
4
5
5
5
3. Lembar kerja (format isian)
Prosedur Pengujian
1. Pewarnaan Gram
2. Uji Katalase
6
10
10
12
3. Uji KOH
4. Uji CAMP-Esculin
5. Uji Coagulase
Prosedur Diagnostik
1. Inokulasi contoh susu
13
14
15
16
16
2. Prinsip kerja
3. Contoh yang terkontaminasi
Identifikasi Penyebab Mastitis Subklinis
1. Proses identifikasi
19
2. Prosedur Identifikasi Penyebab mastitis Subklinis
18
18
19
Bab 6
Streptococci
1. Pola Hemolysis
2. Identifikasi Streptococcus
3. Streptococcus canis (SC)
21
21
21
22
Bab 7
Staphylococci
1. Pola Hemolysis
Coliforms (CO)
Corynebacterium bovis (CB)
23
23
24
25
Bab 3
Bab 4
Bab 5
Bab 8
Bab 9
20
Bab 10
Bab 11
Bab 12
Uji Sensitivitas Antibiotik (dimodifikasi)
26
1. Tujuan
2. Uji Disk diffusion susceptibility
3. Catatan
Kultur biakan dari Bulk Tank (TPS)
1. Prosedur kultur biakan Bulk Tank
26
26
26
27
27
2. Hasil kultur biakan Bulk Tank
3. Hal yang perlu diperhatikan
Klasifikasi dan Karakter Mikroba Penyebab
Mastitis Subklinis
1. Klasifikasi
27
28
29
2. Karaktaeristik dan pengendalian
3. Mikroba Penyebab Mastitis yang infeksius
4. Penyebab Mastitis dari Lingkungan
29
30
35
29
Daftar Singkatan
Staphylococci
Streptococci
Staphylococcus aureus
SA
Coagulase Negative Staphylococci
CNS
Streptococcus agalactiae
SAG
Streptococcus canis
SC
Other Streptococci (Environmental Streptococci)
OS
Coliforms
CO
Corynebacterium bovis
CB
Others (mikroba lainnya)
OTH
Sumber Tulisan; LABORATORY HANDBOOK ON BOVINE MASTITIS (NMC)
Microbiological Procedures for Use in the Diagnosis of
Bovine Mastitis (NMC)
Pendahuluan
Mastitis merupakan masalah yang sering ditemui diseluruh dunia. Kondisi
mastitis berbeda-beda tergantung pada daerah/ Negara, tapi metode yang
digunakan untuk pengendalian mastitis pada dasarnya sama.
Penyebab utama mastitis adalah mikroorganisme, oleh karena itu sangat
penting untuk melakukan proses identifikasi mikroba dari susu dan sapi yang
terkena mastitis sehingga pada akhirnya bisa dibuat satu program untuk
pengendalian mastitis tersebut. Jika anda ingin melaksanakan program
pengendalian mastitis, pengujian bakteriologis susu santa penting dilakukan
karena mastitis merupakan penyakit yang infeksius (menular).
Contoh susu dari seluruh sapi dari satu kelompok ternak yang bermasalah harus
diambil dan kemudian dibiakan di laboratorium. Dan perlu juga ditambahkan
dalam mengidentifikasi mikroba penyebab mastitis di suatu kelompok ternak
maka perlu juga dilakukan pengujian sensitivitas antibiotika untuk menentukan
jenis antibiotika mana yang ampuh dan efektif dalam pengobatan mastitis nanti.
Selain itu tujuan lain dari pengujian bakteriologis ini adalah untuk mengetahui
ternak mana saja yang menghasilkan prognosis mastitis yang jelek, sehingga
bisa diambil langkah selanjutnya pada ternak sakit tersebut.
Pengujian untuk identifikasi mikroba penyebab mastitis yang cepat dan murah
sangat penting sekali dilakukan. Dalam buku petunjuk ini terdapat metode
identifikasi dan pengujian mikroba penyebab mastitis yang murah, mudah dan
cepat yang bisa dilakukan oleh para praktisi.
Juli 2009
JICA Short-term Expert
ANRI Akira, DVM, PhD
JICA Counterpart
Drh. Yoni Darmawan Sugiri
1
2
Bab 1 Penanganan dan Pengambilan Contoh Susu
Pengambilan contoh harus dilakukan se-aseptik mungkin. Kualitas contoh
sangat penting dalam prsedur diagnostic.
1. Bahan dan Alat Pengambilan Contoh
Sterile tubes
Kapasitas 5-15ml
Glove
Mencegah kontaminasi dari tangan
Kapas steril
Direndam dalam alcohol 70%
Ice
Pendinginan contoh
Rak
Menyimpan contoh
Teat dip
Desinfeksi putting setelah pemerahan
Lap bersih
Mengeringkan
pemerahan
Spidol marker
Identifikasi sampel
Syringe 5-10 ml
Pengambilan sampel air atau lainnya
CMT paddle
CMT reagent
3
putting
sebelum
2. Teknik Pengambilan contoh
Sangat direkomendasikan untuk mengikuti prosedur di bawah ini ketika
mengambil contoh susu untuk dibiakkan di laboratorium.
(1) Ambil sampel susu pada pemerahan terakhir.
(2) lap/ bersihkan seluruh putting menggunakan kertas tisu, dimulai dari putting
yang terjauh dari pengambil sampel.
(3) Gosok lubang putting menggunakan kapas beralkohol dimulai dari putting
terjauh dari pengambil sampel.
(4) jika sampel yang diambil adalah sampel quarter (jumlah ternak sedikit), ambil
sekitar 2,5 ml setiap putting, jika mengambil sampel komposit (jumlah ternak
banyak) ambil jumlah yang sama dari setiap putting dimulai dari putting yang
terdekat dengan pengambil sampel. Usahakan tabung sampel dengan posisi
miring 45-60 derajat dan tidak menyentuh permukaan putting atau tangan
pengambil sampel.
(5) celup putting dengan desinfektan setelah pengambilan sampel selesai.
Sangat penting untuk menyiapkan putting yang kering dan bersih sebelum
pengambilan sampel serta cara pengambilan sampel yang benar untuk
mencegah terjadinya kontaminasi sampel, karena jika terjadi kontaminasi akan
menyebabkan hasil yang diharapkan menjadi bias. Ikuti cara pengambilan
sampel seperti yang tercantum di atas.
4
3. Penanganan dan Penyimpanan Contoh
Setelah pengambilan sampel, tempatkan tabung sampel pada rak didalam
coolbox yang diisi dengan es. Secepat mungkin kirim sampel ke lab dalam suhu
5 C.
5
Bab 2 Bahan dan Alat Diagnostik
1. Pendahuluan dan Informasi Umum
Peralatan yang dibutuhkan untuk identifikasi dan diferensiasi kuman penyebab
mastitis tergantung pada kebutuhan dan tingkatan/ kemampuan pengujian yang
akan dilakukan. Peralatan yang canggih/ kompleks tidak diperlukan untuk
pengujian rutin mastitis pada sapi perah. Namun sekarang sudah banyak
media-media diagnostic yang khusus untuk identifikasi kuman penyebab
mastitis. Staphylococci, Streptococci, CO dan CB dapat tubuh pada 5% sheep
blood agar.
2. Peralatan yang diperlukan:
(1) incubator (37 C), Refrigerator, Microscope, Autoclave
(2) Peralatan lain yang dibutuhkan (optional):
Ose (10 dan 1 micro litter), Cotton swab, tabung untuk coagulase test,
Microscope slides, Spreader (batang penyebar), pinset, Bunsen burner (Alcohol
bunsen), CMT paddle, gelas Beaker, Pipette, sterilized tips, Syringe dengan
jarum 18G , kaca pembesar
(3) Media agar:
5% sheep blood agar, Muller-Hinton agar
(4) Reagent:
CMT reagent, Rabbit plasma, Esculin discs#, Antibiotic sensitivity discs,
Aquadest sterile, ethanol murni/ alcohol 96%, alcohol 70%
(5) Others:
Biakan S. aureus dengan beta hemolysin dan Strep. Agalactiae (untuk CAMP
test)
# Prosedur pembuatan esculin discs
1. Sterilisasi cakram kertas (diameter 6mm) yang dibungkus dengan
alumunium foil (1 bungkus 50 cakram) menggunakan autoclave (121 C,
15 menit)…… (1)
2. Menyiapkan larutan Pepton (100 ml) : aquadest 100 ml+ Pepton 1 gr +
Garam 0,5 gr …….. (2)
3. (2) + esculine 0,1 gr + Ferric Citrate 0,05 gr kemudian larutkan dengan
cara dididihkan …….. (3)
4. Sterilsasi (3) dengan autoclave (121 C, 15 menit)…(4)
5. Simpan (1) dalam petri dish steril
6
6. Tuangkan (4) ke (5) dan sisa laturan dibuang.
7. Keringkan menggunakan sterilisasi panas (55 C selama 2 hari)… (6)
8. Setelah kering kemudian disimpan dalam lemari pendingin.
3. Lembar Kerja / Format isian
Ada tiga jenis lembar kerja (contoh kuartir , contoh komposist, dan contoh bulk
tank).
7
Work Sheet for the Identification of Mastitis Causative Pathogens (Quarter milk samples)
Owner:
Cow ID
Q
Strep.
No. CAMP Esc.
/　/
Culture:
Staph.
No. Coag.
SA
Mastitis Causative Pathogen
CNS SAG OS CO CB
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
A
B
C
D
8
No.
A:LF B:LR C:RF D:RR
OTH
P
Antibiotic Sensitivity
DX
E
K
T
CZ
Remark
Work Sheet for the Identification of Mastitis Causative Pathogens (Composite milk samples)
Owner：
No. Farm
Culture：　/　/　/
No.
Strep.
Staph.
Mastitis Causative Pathogen
Antibiotic Sensitivity
Remark
No. CAMP Esc. No. Coag. SA CNS SAG OS CO CB OTH P DX E K T CZ
9
Work Sheet for the Identification of Mastitis Causative Pathogens (Bulk milk samples)
Culture：　/　/　/
No. Farm
Rank
No.
Strep.
Staph.
Mastitis Causative Pathogen
Antibiotic Sensitivity
No. CAMP Esc. No. Coag. SA CNS SAG OS CO CB OTH P DX E K T CZ
10
Bab 3 Prosedur Pengujian
1. Pewarnaan Gram
Buat/ siapkan preparat ulas yang sudah dikeringkan:
(1) Buat preparat ulas dari biakan murni dengan cara mencampur biakan
dengan 2-3 mata ose aquades steril.
(2) Tandai preparat ulas dengan pensil.
(3) Kering udarakan dan kemudian difiksasi dengan cara melewatkan pada api.
Prosedur:
(1) Teteskan crystal violet pada preparat ulas selama 60 detik.
(2) Cuci dengan air mengalir
(3) Teteskan Gram’s iodine dua kali selama 60 detik. Keringkan jangan dicuci.
(4) Lakukan proses pemucatan 95% alcohol sampai warna menjadi pucat.
(5) bilas dengan air mengalir.
(6) Teteskan larutan safranin (fuchsin) dan diamkan selama 30 detik.
(7) Bilas dengan air mengalir.
(8) Keringkan dengan kertas saring kemudian amati di bawah mikroskop.
11
CONTOH TEMUAN MIKROSKOPIK BAKTERI SUSU
Gram positive cocci (Staphylococci)
Sama seperti gambaran histologis paru-paru atau kelenjar ambing
Gram positive cocci (Streptococci)
Cocci atau ovoid
Gram negative batang (Escherichia coli)
Batang pendek
Gram positive batang (Corynebacterium bovis)
Berbentuk club
12
2. Catalase test
Prosedur:
(1) Satu tetes larutan 3% hydrogen peroxide (Oxydol) pada microscope slide.
(2) ambil satu koloni kuman dengan larutan hydrogen peroxide tersebut.
Negative
Positive
Interpretasi:
+
Staphylococci, CB
-
Streptococci
+: terbentuk gelembung gas
- : tidak ada reaksi
Perhatian:
Sel darah merah menghasilkan katalase. Hindari mengambil agar darah dengan
koloni kuman, karena akan memberikan reaksi positif palsu.
13
3. KOH test
Metode yang sederhana dan efektif untuk melanjutkan proses pewarnaan Gram
adalah Uji KOH. Bahan yang digunakan hanya KOH 3% dan biasanya hasilnya
sangat berhubungan erat sekali dengan hasil pewarnaan Gram.
KOH 3% dalam jumlah yang sedikit diteteskan pada slide glass. Satu mata ose
koloni kuman dicampurkan dengan larutan KOH tersebut. Jika menghasilkan
larutan yang kental dalam waktu 5 – 30 detik, dan jika ose diangkat
menghasilkan seperti benang maka bakteri yang diperiksa adalah Coliform. Jika
tidak maka adalah bakteri gram positif.
Positive
Negative
+
Gram Negative (CO)
-
Gram Positive (Staphylococci)
+: campuran menjadi kental dan seperti gel
- : campuran tetap cair
14
4. CAMP-Esculin test
Untuk identifikasi Streptococus, lakukan uji CAMP pada seluruh koloni yang
diduga koloni Strep. S. Aureus yang beta hemolysis di goreskan pada bagian
tengah plate agar darah domba 5%. Satu atau dua koloni dari suspek strep di
goreskan tegak lurus terhadap gorean SA tadi dengan jarak 5 mm dari tengah ke
pinggir., sebagai control positif maka lakukan goresan SAG murni pada agar
tersebut dengan cara yang sama dengan suspek.
Jika hasil uji CAMP positif, lanjutkan uji eskulin pada koloni yang positif dengan
cara menempelkan cakram eskulin pada koloni tadi (tengah-tengah goresan). 30
menit kemudian diamati hasilnya. Jika warna cakram berubah dari putih menjadi
coklat atau hitam berarti ujinya positif. Jika CAMP positif dan eskulin negative
maka
koloni suspek adalah koloni Strep. Agalactiae.
CAMP positive
Esculin positive
CAMP
Esculin hydrolysis
Species
+
+
OS
+
-
SAG
-
+
OS
-
-
OS
CAMP+: bentuk mata panah dengan hemolisis komplit pada
daerah hemolisis beta SA
CAMP- : tidak ada reaksi
Esculin hydrolysis+: berubah warna dari putih jadi coklat/hitam
Esculin hydrolysis-: tidak ada reaksi (putih)
15
5. Coagulase test
Uji Koagulase untuk membedakan antara SA dengan CNS (koagulase negative
Staph)
prosedur:
Inokulasi 0.5 ml coagulase rabbit plasma dengan inokulum Staphylococci dari
plate biakan kuman.
Inkubasikan 37 C selama 1-2 hari.
Hasil:
Hasil positif (terjadi koagulase) dapat terlihat dalam 2-4 jam atau sampai dengan
24 jam.
Negative
Positive
+
SA
-
CNS
Coagulase+: terjadi koagulasi
Coagulase-: tetap cair setelah 24 jam
16
Chapter 4
Prosedur Diagnosa
1. Inokulasi Contoh Susu
(1) Penyebaran Inokulum
Sampel susu kuartir : satu plate agar darah 5% untuk satu sapi
Teteskan 0,01 ml susu dengan menggunakan ose, kemudian susu digoreskan di
tiap kuadran plate agar darah 5%
Sampel susu komposit : satu plate agar darah 5% untuk dua sapi.
Teteskan 0,05 ml dengan pipet steril dan kemudian disebarkan menggunakan
batang penyebar ke setengah permukaan agar dengan perbandingan yang
sama.
Quarter Milk Sample
Composite Milk Sample
Cow ID
Cow ID
C
D
A
B
Cow ID
A:LF, B:LR, C:RF, D:RR
Contoh susu Kuartir
Contoh susu komposit
17
(2) Inkubasi Biakan
Suhu yang digunakan untuk inkubasi biakan adalah 37 C. Biakan diamati
setelah 20 jam untuk koloni Streptokokki, Staphylokokki, Koliform dan kemudian
diinkubasikan lagi selama 24 jam untuk mendeteksi adanya Corynebacterium
bovis.
Mikroorganisme
Masa Inkubasi
Staphylococci
Streptococci
20 jam
Coliforms
Corynebacterium bovis
18
1.5 hari
2. Prinsip-Prinsip
Banyak bakteri penyebab mastitis bisa diisolasi dari lingkungan sekitar sapi.
Bakteri bakteri tersebut jika jumlah koloniyang tumbuh di atas 5 koloni dengan
ukuran dan warna yang sama, hasil diagnosanya signifikan. Pada kasus
Staphylococcus aureus , jika hanya satu koloni yang tumbuh ini merupakan hasil
yang signifikan.
Infeksi campuran biasanya jarang terjadi (di bawah 5%). Jika hasil dari
pembiakan sering ditemukan dua atau lebih jenis bakteri dari sampel susu
kuartir, mungkin hal ini disebabkan adanya kontaminasi atau cara pengambilan
sampel yang salah (tidak hygiene).
Setelah 20 jam amati hasil dari pembiakan. Pada waktu itu, hampir semua
bakteri yang terdeteksi adalam gram positif kokus. Jadi sangat penting untuk
dilakukan klasifikasi antara Staphylokoki dengan Streptokoki berdasarkan
ukuran dan bentuk koloni.
Kolofirm (CO) jarang terdeteksi pada saat ini. Jika CO menginvasi alveoli, akan
berkembang dengan cepat dan menghasilkan gejala klinis.
CB tidak biai terdeteksi dalam 20 jam pembiakan. Untuk mendeteksi CB
diperlukan waktu inkubasi di atas 36 jam.
3. Sampel Yang Terkontaminasi
Contoh susu yang tidak terkontaminasi dari sapi yang sehat, ambing yang sehat
biasanya tidak mengandung bakteri.
Pada saat ditemukan jenis bakteri lebih dari tiga yang berasal dari susu kuartir,
hal ini kemungkinan disebabkan adanya kontaminasi dan contoh tidak bisa diuji
karena terkontaminasi.
19
BAB
5
Proses Identifikasi agen Penyebab Mastitis Sub
Klinis
1. Proses Identifikasi
Gambar di bawah ini sangat bermanfaat dalam mengidentifikasi agen penyebab
mastitis subklinis, dengan menggunakan bahan sederhana, cepat dan murah.
Hal yang paling dasar dalam identifikasi agen penyebab mastitis subklinis
adalah karakteristik koloni (ukuran, warna, pola hemolisis).
Karakteristik Koloni
Species
Warna
Warna
Staphylococci
Kecil- sedang
Putih atau kuning
Streptococci
kecil
Tidak berwarna
tembus pandang)
(basah,
cembung,
Catalase Test
＋
ー
Staphylococci
Streptococci
KOH Test
＋
ー
CO
CNS
Jika tidak bisa membedakan antara Staphylokokus dengan Streptokokus
berdasarkan koloni, maka dilanjutkan pengujian Katalase (pengujiannya sangat
mudah) dan selanjutnya untuk membedakan antara Koliform dengan
Staphylokoki dengan menggunakan uji KOH.
20