Teknik RFLP - E-learning UPN JATIM

Fragmen DNA target dan DNA vector
dicampur /disambung dg ensim ligase.
Terjadi 3 kemungkinan hasil:
a. fragmen DNA target menyambung
sendiri & tidak tersambung dg
vector
b. DNA vector menyambung kembali
tanpa tersisip DNA target
c. DNA vector tersisip DNA target
DNA rekombinan
TRANSFORMASI
DNA rekombinan diintroduksi/dimasukkan dlm
sel inang (biasanya E. coli)
SEL KOMPETEN
Vector membelah / memperbanyak diri
sel inang juga membelah shg vector dan DNA
rekombinan semakin banyak
klon DNA REKOMBINAN
IDENTIFIKASI
Untuk membedakan/ menyeleksi hanya plasmid
yang membawa DNA rekombinan, perlu
dilakukan REPLICA PLATING, yaitu :
Menguji bakteri pada media agar-agar yang
diberi antibiotik ampicilin & tetrasiklin .
E. coli yang tidak dimasuki plasmid akan mati
karena tdk punya gen ketahanan amp R & tetr
DNA rekombinan tidak tahan thd antibiotik
tetrasiklin karena DNA target memotong sekuen
gen ketahan tetr R, tp DNA non rekombinan
tahan, krn tetr R tidak terpotong.
R
PLASMID pBR 322
Tc R
terpotong
REPLICA PLATING
 Bakteri ditumbuhkan pada media
ampicilin, yg tumbuh dipindah ke media
tetrasiklin, yg tidak tumbuh berarti
mengandung DNA REKOMBINAN
 Dg membandingkan kedua media , dpt
diketahui koloni mana yg mengandung
DNA rekombinan, lalu dibuat MASTER
PLATE
 Menumbuhkan koloni DNA rekombinan
pd media agar yg baru
REPLICA PLATING
MASTER PLATE
HIBRIDISASI KOLONI
Dilakukan utk membedakan DNA gen target dg yg
bukan, krn diantara DNA rekombinan tdk semua
membawa DNA gen target.
Cara :
 Diatas media master plate diletakkan membran
nitroselulose , tjd Difusi larutan agar2 ke membran
shg bakteri tumbuh pd membran.
 Melalui bbrp proses DNA bakteri pd membran
dicuci & didenaturasi shg menjadi utas tunggal
(single strand).
 Hibridisasi DNA bakteri dg probe (pelacak) yg tlh
terlabel, maka DNA yg terhibridisasi merupakan
DNA REKOMBINAN GEN TARGET
HIBRIDISASI KOLONI