Tugas Dasar Bioteknologi PCR

Dasar Bioteknologi PCR
1.apa kepanjangan dari PCR? Dan jelaskan pengertiannya!
PCR merupakan singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Reaksi Polimerase
Berantai atau dikenal sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR), merupakan suatu proses
sintesis enzimatik untuk melipatgandakan suatu sekuens nukleotida tertentu secara in vitro.
Metode ini dikembangkan pertama kali oleh Kary B. Mulis pada tahun 1985. Metode ini
sekarang telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetic.
2. Apa saja macam-macam PCR? Dan apa perbedaannya!




Real-Time PCR
Real-Time PCR merupakan suatu perangkat platform instrumentasi, yang terdiri atas
satu buah thermal cycler, satu buah komputer, lensa untuk eksitasi fluoresen dan
pengumpul emisi, serta perangkat lunak untuk akuisisi dan analisis data. Prinsip kerja
Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter fluoresen. Sinyal
fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam reaksi.
Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase
eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target.
Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (Rt-Pcr)
RT-PCR merupakan singkatan Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction.
Seperti namanya, proses RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa.
Perbedaanya dengan PCR yang biasa, pada proses ini berlangsung satu siklus
tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA)
dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase. Reverse Transcriptase adalah
suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan
template RNA.
Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan replikasi sampel DNA menggunakan
bantuan enzim DNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen. Pasangan primer yang pertama akan mengamplifikasi
fragmen yang cara kerjanya mirip dengan PCR pada umumnya. Pasangan primer yang
kedua biasanya disebut nested primers ( sepasang primer tersebut terletak di dalam
fragmen pertama) yang berikatan di dalam fragmen produk PCR yang pertama untuk
memungkinkan terjadinya amplifikasi produk PCR yang kedua dimana hasilnya lebih
pendek dari yang pertama.Nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam
melakukan amplifikasi karena jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka
kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang
kedua sangat rendah.
Multiplex PCR
Multiplex PCR digunakan untuk mendeteksi beberapa target DNA sekaligus.
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari
lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak
waktu untuk melakukan. Temperatur Annealing untuk masing-masing set primer
harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran

amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk membentuk
band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel .
ELISA PCR
Teknik PCR-ELOSA adalah suatu metode untuk mendeteksi suatu segmen nukleotida
menggunakan PCR dan ELISA. Amplikon PCR didenaturasi, diimobilisasi pada
microwell plate lalu diidentifikasi secara hibridisasi DNA dan imunologis (ELISA).
Sejumlah istilah telah digunakan untuk teknik tersebut diantaranya PCR and DIGELISA detection, ELISA-based oligonucleotide ligation assay, PCRoligonucleotide
ligation assay, DIAPOPS (Detection of immobilised amplified products in one phase
system)
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat
yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam
sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode
ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk
PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time
PCR. PCR-ELISA telah digunakan sejak akhir 1980-an dan telah berkembang untuk
mendeteksi sequen tertentu dalam produk PCR.
3.Jelaskan prinsip kerja Real Time PCR!
Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter
fluoresen. Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam
reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase
eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target.
4.Jelaskan prinsip kerja Reverse Transkriptase PCR!
proses RT-PCR berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA
menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim Reverse Transkriptase.
Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in
vitro menggunakan template RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini
juga diperlukan DNA Polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR,
template yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat
menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus
dibuang. Untuk proses amplifikasi mRNA yang mempunyai poly(A) tail pada ujung 3′, maka
oligo dT, random heksamer, maupun primer spesifik untuk gen tertentu dapat dimanfaatkan
untuk memulai sintesa cDNA.
5.Jelaskan prinsip kerja ELISA!
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat
yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah
pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan
metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini
lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR. Prinsip kerja ELISA
(Enzime-Linked Immunosorbent Assay) yaitu penempelan antibody primer pada bagian
tertentu dari molekul target, maka molekul itu akan diisolasi menjadi murni. Kemudian
digunakan untuk mendeteksi target itu. Campuran berbagai antibodi yang dihasilkan yang
terdapat pada serum (antiserum) dari hewan yang diinokulasi membuat sejumlah antibodi
yang berbeda-beda yang masing-masing menempel pada bagian tertentu dari molekul target
(epitop)
TEKNIK REKAYASA GENETIKA
1. Jelaskan pengertian mengenai DNA sekuensing!
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan
basa nukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA,
yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung
instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA
dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA
lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah
diketahui. Teknik ini digunakan dalam riset dasar biologi maupun berbagai bidang
terapan seperti kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.
Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi makhluk hidup untuk
melangsungkan hidup dan berkembang biak.
2. Jelaskan pengertian hibridisasi!
hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian
nukleotida yang saling komplementer melalu perpasangan basa N. Hibridisasi dapat
menunjukkan suatu keseragaman sekuens. Pasangan DNA–DNA, DNA–RNA, atau
RNA–RNA dapat terbentuk melalui proses ini.
3. Jelaskan prinsip kerja southern blot!
Southern Blot adalah teknik yang mampu untuk mendeteksi fragmen restriksi
tunggal yang spesifik dalam campuran asam nukleat yang sangat kompleks yang
dihasilkan dari pemotongan genom dengan menggunakan enzim restriksi. Kompleks
dalam campuran tersebut, banyak fragmen yang akan mempunyai panjang yang sama
dengan yang lain dan bermigrasi atau berpindah bersama-sama selama proses
elektroforesis. Meskipun semua fragmen tidak secara sempurna terpisah oleh proses
elektroforesis gel agarose, fragmen tunggal dalam pita hasil elektroforesis dapat
diidentifikasi dengan hibridisasi menggunakan DNA probe yang spesifik. Sehingga
untuk menyelesaikan masalah tersebut, fragmen restriksi yang ada dalam gel
didenaturasi dengan alkali dan ditransfer pada filter nitroselulosa atau membran nilon
dengan teknik blotting
4. Jelaskan prinsip kerja northern blot!
Teknik ini digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi) suatu mRNA pada
organ atau jaringan tertentu. Teknik ini pada dasarnya adalah kombinasi dari
denaturasi RNA elektroforesis gen dan sebuah noda. Dalam proses ini RNA
dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran untuk kemudian
diperiksa dengan pelengkap yang memiliki label berdasar urutan kepentingan.
Hasilnya dapat digambarkan dalam berbagai cara tergantung pada label yang
digunakan.
5. Jelaskan prinsip kerja western blot!
Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke
membran. Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga
protein yang terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun
fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip
imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian
antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau
secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer
dengan antibodi sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan
membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan di kamar gelap.