Ekstraksi DNA
advertisement
Ekstraksi DNA Blender eksplan tanaman Detergen (SDS) memecah membran sel • Untuk mendapatkan DNA maka sel harus dipecah dan dibuka membrannya • Membran inti juga harus dibuka Detergen: • Memecah membran dg terikat ke lipid dan protein membran Sel dan membran inti yg telah dipecah terpisah, juga semua membran organel,, termasuk membran mitokondria dan kloroplas. Apa yg tersisa? • Protein • karbohidratdrat (gula) • DNA DNA inti dikelilingi oleh protein EKSTRAKSI DNA Protocol 7 • Protocol extraksi DNA dari daun tanaman sereal • Protocol ini akan menghasilkan DNA yg bisa untuk didigesti lebih lanjut dg restriction enzyme • RNA yg terkandung dapat dihilangkan dg RNAse 8 Ekstraksi DNA • Bahan tanaman segar dikumpulkan • Bahan tanaman dicampur dg buffer pengekstraksi dan digerus dg mortar • Cairan hasil disentrifuge utk memisahkan padatan bahan tanaman dari supernatan buffer. • Hilangkan potein • Supernatan dicampur dg etanol utk mengendapkan DNA dg membentuk pelet pada tabung. • Supernatan dipisahkan diendapkan • DNA pelet dibersikan dari RNA dan protein • DNA pelet dikeringkan dan dilarutkan lagi dg buffer 9 Urutan Pemisahan DNA Penghancuran dinding sel dan membran dg buffer pengekstraksi Centrifuge Pengendapan DNA dg isopropanol Fase berair (DNA) Larut kan pelet DNA Cuci DNA pelet dg Ethanol + am asetat dan etanol Inkubasi dan sentrifuge Fase CIAA (protein) + CIAA DNA Resuspensi pelet dan tambah RNAse , inkubasi 37⁰C 30’ Centrifuge utk memisahkan DNA dari garam terlarut dan gula Catatan • Larutan DNA yg dihasilkan sudah siap digunakan. • Untuk menjaga kestabilan larutan DNA , simpan dalam kulkas jangka pendek dan dalam freezer jangka panjang • Setelah ini, sebaiknya DNA di run pada gel agarosa untuk check integritas dan kualitasnya. Campur 10 µL DNA dg 10 µL loading buffer • Masukkan campuran ini ke dalam 1% gel agarosa gel 11 Pengujan Kualitas DNA hasil pemisahan Produk ekstraksi DNA, kualitas rendah tidak akan berhasil dalam PCR misalnya, atau sulit dipotong dengan enzim endonuklease restriksi. Ladder A B C D E Catat bahwa DNA genom mempunyai jumlah bp sangat besar, sehingga ada band di atas(dekat sumur) jika ekstraksinya bagus. Barley(A), jagung (B), Oat (C), dan beras (D) sudah bagus Wheat (E) perlu ekstraksi ulang 12 Jika DNA diekstraksi di laboratorium secara profesional, akan menghasilkan band jernih di dalam gel elektroforesis Catat bagaimana band DNA genom DNA dibedakan dan ditemukan di dalam range bp tinggi Ladders Cereal Genomic DNA 13