prosedur isolasi dna
advertisement
PROSEDUR ISOLASI DNA Isolat bakteri di tanam di media kultur shaker kecepatan 140 – 160 rpm / organ dibedah dan digerus Setrifuse kecepatan 12000 rpm selama 1 menit Supernatan di buang Diulangi sampai 3 kali ulangan Natan dikeringkan dengan membalik diatas tisyu Ditambahkan 500 πl 1 X TE Buffer resuspensi Sentrifuse 12000 rpm Supernatan dibuang Pellet diresuspensikan 1 X TE Buffer 500 πl Ditambahkan 100 πl Lyzozym Inkubasi pada suhu 37 0C selama 1 jam, setiap 15 menit dibolak-balik 10% SDS 100 µl K-proteinase 10 µl Inkubasi 1 jam pada suhu 37 0C Ditambahkan 100 µl NaCl 5M dibolak-balik pelan-pelan 100 µl CTAB yang sudah diinkubasi suhu 65 0C dan dibiarkan suhu ruang Vortex, inkubasi 65 0C 20 menit Dibiarkan suhu ruang Ditambahkan 500 µl Phenol:Chloroform:Isoamyl alkohol Vortex 30 detik Sentrifuse 10.000 rpm 5 menit Supernatan diambil dan dipindahkan effendorf steril yang berisi 600 µl isopropanol / ethanol absolut dingin (-20 0C) dan dibolak-balik hingga timbul benang-benang DNA Sentrifuse 13.000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang DNA Pellet dicuci dengan 1 ml Ethanol 70% dingin (-20 0C) divortex Sentrifuse 13.000 rpm selam 10 menit Dikering udarakan 4 – 24 jam untuk menguapkan Ethanol yang tersisa Penambahan 1X TE-Buffer 20 – 30 µl Template DNA disimpan -20 0C