BAB 3. ELEKTROFORESIS 3-1 TEORI UMUM

BAB 3. ELEKTROFORESIS
3-1 TEORI UMUM ELEKTROFORESIS
lstilah elektroforesis untuk pertama kalinya dikemukakan oleh Michaelis pada
tahun 1909 yang digunakan untuk mendeskripsikan perpindahan tempat
(migrasi) zat-zat koloidal pada suatu medan listrik. Ada juga yang menyebutnya
dengan istilah ionoforesis yang artinya kurang lebih juga sama dengan
elektroforesis, yaitu perindahan tempat ion-ion yang relatif kecil karena pengaruh
suatu medan listrik. Meski pun istilah ionoforesis sebenarnya lebih tepat
digunakan sebagai dasar pemisahan senyawa-senyawa bahan, tetapi istilah
tersebut kurang populer sehingga sampai kini istilah elektroforesis lebih banyak
digunakan.
Prinsip dasar elektroforesis hampir sama dengan sedimentasi. Perbedaannya,
pada sedimentasi perpindahan tempat didasarkan atas molar dan massa padat,
sedangkan pada elektroforesis perpindahan tempat didasarkan pada muatan
listrik yang dibawa oleh senyawa. Contoh jika ke dalam larutan garam (NaCl)
dimasukkan dua elektroda yang berlawanan (positif dan negatif) dengan suatu
perbedaan potensial, maka ion-ion yang bermuatan positif (Naj akan bergerak ke
arah kutub negatif (katoda) dan ion-ion yang bermuatan negatif (Cl) akan
bergerak ke arah kutub positif (anoda). Meski pun dalam larutan garam tersebut
terdapat air, dan ion-ion H dan OH- yang ada juga bergerak masing-masing ke
arah kutub negatif dan kutub positif, tetapi konsentrasi kedua ion tersebut sangat
kecil dn konduktivitas air lebih kecil daripada konduktivitas garam sehingga
gerakannya umumnya diabaikan.
Molekul-molekul dapat bermuatan positif atau pun negatif misalnya protein dan
turunannya atau bahkan tidak bermuatan misalnya lemak dan karbohidrat. Dalam
hal ini molekul-molekul yang bermuatan juga akan bergerak ke arah kutubkutubnya. Ion-ion dan molekul-molekul bergerak ke arah kutub-kutubnya dengan
kecepatan tertentu yang dapat berbeda-beda. Faktor-faktor yang mempengaruhi
kecepatan gerakan ion dan molekul adalah besarnya tegangan medan listrik dan
jumlah muatan yang dibawa oleh ion. Besarnya kecepatan juga dipengaruhi oleh
besarnya koefisien friksional (gesekan), dan viskositas larutan. Masih ada
beberapa faktor lain yang berpengaruh pada kecepatan gerak ion antara lain
ukuran (berat dan besar) ion. Sering kali ukuran ion atau molekul dikaitkan
dengan massanya. Jumlah muatan dan besarnya massa saling mempengaruhi
Universitas Gadjah Mada
kecepatan bergerak molekul dan dinyatakan sebagai faktor rasio jurnlah massa
dengan muatan atau “c-rn ratio” atau dinarnakan pula faktor densitas muatan
(charge density). Makin besar c-rn ratio suatu ion atau molekul maka akan rnakin
cepat ion atau rnolekul tersebut bergerak. Itulah sebabnya ion-ion dengan
perbedaan ukuran akan bergerak di dalarn medan listrik dengan kecepatan yang
berbeda. Ion-ion dan juga rnolekulmolekul yang kecil tetapi mernpunyai muatan
yang banyak akan bergerak lebih cepat daripada ion-ion atau molekul-molekul
yang besar tetapi rnuatannya sedikit.
Muatan yang dibawa oleh ion atau molekul sangat tergantung pada
lingkungannya. Pada keadaan netral, ion dan molekul boleh dikatakan tidak
bermuatan, tetapi pada keadaan asam, ion dan molekul akan lebih banyak
bermuatan positif, oleh karena itu jika dilektroforesis akan bergerak ke arah kutub
negatif. Sebaliknya pada lingkungan basis, ion dan molekul akan lebih banyak
bermuatan negatif dan jika dilektroforesis akan bergerak ke arah kutub positif.
Elektroforesis ion dan molekul pada keadaan netral tidak akan rnenyebabkan
mobilitas apa-apa. Oleh karena itu penggunaan larutan penyangga (buffer)
sangat menentukan mobilitas ion dan molekul selarna proses elektroforesis.
Dengan demikian pemilihan larutan penyangga yang cocok menjadi persyaratan
utama sebelurn mengerjakan elektroforesis. Juga harus diperhatikan pada
pemilihan larutan penyangga ialah jangan sampai larutan penyangga tersebut
dapat mengadakan reaksi dengan komponen-komponen yang akan dipisahkan.
Sebagai contoh larutan penyangga borat kurang balk untuk digunakan
memisahkan komponen-komponen karbohidrat karena borat dapat membentuk
senyawa komplek dengan karbohidrat. Seperti telah disinggung bahwa besarnya
konduktivitas akan mempengaruhi mobilitas ion dan molekul. Di dalam hal
pemilihan larutan penyangga untuk elektroforesis, konsentrasi yang tinggi
konduktivitasnya juga tinggi. Secara umum jika molaritas larutan penyangga
tinggi akan menghasilkan pemisahan yang balk, yaitu pita-pita yang sempit,
tetapi memerlukan waktu lebth lama danpada memakai larutan penyangga
dengan molaritas rendah. Di dalam praktek sering digunakan molaritas larutan
penyangga antara 0,05-0, 10M.
Faktor yang juga berpengaruh pada kecepatan gerak ion dan molekul adalah
besarnya voltase dan aliran listrik atau besarnya tegangan medan listrik yang
digunakan untuk elektroforesis. Makin tinggi voltase dan aliran listrik maka akan
Universitas Gadjah Mada
makin cepat terjadinya mobilitas. Meski pun demikian voltase dan aliran listrik
yang tinggi dapat menyebabkan timbulnya panas.
3-2 METODA PADA ELEKTROFORESIS
Metoda pada elektroforesis dapat digolongan berdasarkan beberapa hal, yaitu
atas dasar media yang digunakan, sistem, konsentrasi media padat, arah
pemisahan, dan penggunaannya.
Penggolongan Atas Dasar Media Yang Digunakan
Atas dasar media yang digunakan, secara umum elektroforesis digolongan
dalam dua metoda, yaitu elektroforesis yang menggunakan media cair (larutan;
moving boundary electrophoresis), elektroforesis yang menggunakan media
padat, dan elektroforesis yang menggunakan media semi padat. Kedua metoda
yang terakhir dikatagorikan sebagai elektroforesis zona.
Elektroforesis pada media larutan.- Pada metoda ini hanya digunakan larutan
sebagai media pemisahan komponen tanpa menggunakan media penyangga
padat. Larutan yang sering digunakan adalah larutan penyangga yang
ditempatkan pada tabung berbentuk huruf U. Elektroda-elektrodanya, yaitu kutub
positif dan kutub negatif, dimasukkan pada masing-masing mulut tabung
sementara contoh (sampel) ditempatkan pada dasar tabung. Jika aliran listrik
dihidupkan melalui elektroda positif maka molekul-molekul akan bergerak menuju
kutubnya masing-masing. Molekul yang bermuatan postif akan bergerak ke arah
katoda dan gerakan mi dinamakan descending boundary. Molekul yang
bermuatan negatif akan bergerak ke arah anoda dan gerakan mi dinamakan
ascending boundary. Dalam hal ini mobilitas molekul dipengaruhi oleh besarnya
densitas massa dan pH larutan penyangga yang digunakan. Moteda ini
merupakan metoda yang paling sederhana, tetapi tidak populer oleh karena sulit
untuk mengambil hasilnya. Dengan demikian metoda ini lebih sesuai untuk
keperluan analisis daripada untuk keperluan preparatif (produksi).
Elektroforesis pada media padat. - Metoda ini menghasilkan pemisahan yang
lebih balk serta lebih reproduktif daripada elektroforesis yang menggunakan
media cair. Media yang dapat digunakan untuk keperluan ini adalah kertas saring
seperti yang banyak digunakan pada kromatografi kertas, lapis tipis selulosa
asetat, atau lapis tipis yang sering digunakan pada kromatografi lapis tipis. Dasar
Universitas Gadjah Mada
pemisahannya tidak berbeda dengan elektroforesis pada media cair, yaitu
tergantung pada densitas muatan dan lingkungannya. Metoda ini kini banyak
sekali digunakan untuk keperluan analisis atau untuk keperluan produksi
(preparatif).
Elektroforesis pada kertas merupakan metoda elektroforesis yang paling
sederhana. Kelemahan metoda mi ialah adanya sifat adsorpsi kertas saring
sehingga beberapa komponen yang dielektoforesiskan sering tidak muncul meski
pun sebenarnya terjadi juga pemisahan. Kelemahan pada elektroforesis kertas
dapat diatasi dengan menggunakan lapis tipis misalnya selulosa asetat yang
dilapiskan pada lembaran aluminium atau kaca. Sifat adsorpsi selulosa asetat
sifat rendah sehingga setelah visualisasi dengan pengecatan akan menjadi lebih
baik daripada menggunakan kertas saring. Demikian pula dengan resolusi yang
dihasilkan lebih tegas dan pemisahannya berlangsung cepat. Metoda ini banyak
digunakan untuk pemisahan protein dalam bentuk serum. Lapis tipis yang
banyak digunakan pada kromatografi lapis tipis juga dapat digunakan untuk
keperluan elektroforesis. Penggunaan lapis tipis ini mempunyai banyak
keuntungan, antara lain sederhana, cepat dan menghasilkan resolusi yang baik,
sensitif, dan dapat memanipulasi media penyangga dengan berbagai variasi.
Meski pun demikian terdapat pula kelemahannya, yaltu selama proses
elektroforesis akan timbul panas yang dapat menyebabkan pengeringan pada
lapis tipis.
Elektroforesis dapat menggunakan media semi padat. Sebagai bahan semi padat
umumnya berupa jeli (gel) seperti misalnya jeli tepung, jeli agar, dan jell
poliakrilamida. Salah satu sebab jeli dapat digunakan untuk memisahkan
komponen-komponen oleh karena jeli mempunyai struktur jaringan tiga demensi
yang poreous. Molekul-molekul yang mempunyai ukuran kecil akan mudah
melalui lubang pori-pori, sedangkan molekul-molekul yang besar akan tertahan.
Besarnya pori-pori jeli dapat diatur dengan mengatur besarnya konsentrasi
bahan yang digunakan untuk membuat jeli. Pada metoda ini mobilitas molekul
juga tergantung pada densitas muatannya.
Keuntungan elektroforesis dengan media jeli tepung adalah karena media ini
dapat digunakan untuk memisahkan dalam jumlah banyak. Akan tetapi
kelemahannya adalah komponen-komponen yang sudah terpisahkan sering kaii
tercemar oleh konstituen karbohidrat yang berasal dan tepung. Keuntungan
lainnya, metoda ini sederhana dan mudah dikerjakan, resolusinya berupa pita-
Universitas Gadjah Mada
pita sederhana terutama jika protein yang dipisahkan. Untuk keperluan preparatif,
metoda mi kurang baik.
Untuk keperluan elektroforesis dengan jeli agar, hasilnya lebih baik daripada
menggunakan kertas tetapi tidak sebaik jika menggunakan jeli tepung atau
poliakrialimida. Jeli agar juga mempunyai tegangan mekanik yang baik, poriporinya besar sehingga dapat digunakan untuk memisahkan komponenkomponen lipoprotein, protein membran, dan asam nukleat yang ukuran
molekulnya besar. Secara kimiawi, agar adalah suatu polisakharida yang
diperoleh dan ganggang. Ada dua macam agar, yaitu agarosa umumnya bersifat
netral dan agaropektin yang mempunyai gugus-gugus bermuatan negatif yang
dapat menyebabkan gerakan elektroendosmotik pada kebanyakan larutan
penyangga alkali dan kadang-kadang dapat menyerap protein. Agarosa dapat
dibuat dan agar dengan mengendapkan agaropektin yang ada dengan setil
pirisidium klorida.
Media semi padat yang paling banyak dan populer digunakan adalah jeli
akrilamida karena kelebihan-kelebihannya yang tak tertandingi. Kelebihankelebihan yang dimaksud antara lain:
a.
Resolusi yang dihasilkan sangat baik
b.
Sangat sesuai untuk memisahkan komponen-komponen yang mempunyai
interval berat molekul besar
c.
Jika digunakan larutan penyangga, maka jeli akrilamida dapat digunakan
untuk pemisahan komponen pada keadaan asam, netral, atau pun basis.
d.
Jeli poliakrilamida bersifat tembus cahaya sehingga mudah dilakukan
pemotretan hasil, fotokopi atau pengukuran dengan spektrofotometri/
densitometri atau radiografimetri
e.
Mudah
memanipulasi
polaritasnya
dengan
mengatur
konsentrasi
poliakrilamida.
f.
Jeli poliakrilamida tidak larut pada kebanyakan pelarut.
g.
Metoda ini masih termasuk sederhana untuk dikerjakan.
Jeli poliakrilamida terbentuk oleh karena proses polimerisasi antara dua
komponen
monomer,
bisakrilamida
yaitu
akrilamida
(CH2=CHCONH2)
(CH2=CHCONHCH2NHCOCH=CH2)
yang
dan
sering
metilenadisebut
akrilamida. Derajad polimerisasinya sangat tergantung pada terjadinya ikatan
silang antara dua komponen tersebut. Pori-pori yang dihasilkan oleh jeli
poliakrilamida dipengaruhi oleh konsentrasi akrilamida dan bisakrilamida, yang
Universitas Gadjah Mada
menentukan sifat fisik jeli yang meliputi elstisitas, tegangan mekanis, viskositas,
dan densitasnya. Polimerisasi terjadi karena adanya komponen-komponen
radikal
bebas
misalnya
ion-ion
persulfat
atau
ion-ion
riboflavin
yang
terdekomposisi oleh cahaya. Jeli akrilamida sangat populer digunakan untuk
memisahkan komponen protein, peptida, atau enzim.
Penggolongan Atas Dasar Konsentrasi Media Yang Digunakan
Suatu material (sampel) yang akan dipisahkan dengan elektroforesis umumnya
terdiri atas komponen-komponen atau molekul-molekul yang ukurannya berbedabeda. Dengan menggunakan elektroforesis jeli, molekul-molekul yang lebih kecil
atau yang ukurannya sesuai dengan pori-pori jeli saja yang dapat melaluinya.
Kelemahan
penggunaan
jeli
dengan
konsentrasi
tertentu
tidak
dapat
menghasilkan pemisahan yang sempurna karena molekul-molekul yang tertahan
atau yang lobs poripori belum tentu mempunyai ukuran yang sama. Dengan
menggunakan konsentrasi jeli
yang
dibuat bertingkat
dapat mengatasi
kelemahan tersebut. Umumnya konsentrasi awalnya adalah rendah sedangkan
konsentrasi akhirnya tinggi. Dengan demikian molekulmolekul yang besar akan
tertahan lebih dahuk, sedangkan molekulmolekul yang lebih kecil akan tertahan
kemudian. Masing-masing molekul akan berhenti bergerak pada tempat-tempat
pada saat poripori jeli sudah tidak memungkinkan untuk dilaluinya karena ukuran
molekul lebih besar daripada lubang porinya. Dengan demikian jeli bertindak
semacam penyaring bertingkat, dan pemisahan molekulmolekul akan menjadi
lebih sempurna. Elektroforesis berlangsung
sampai sistem mencapai keseimbangan dan semua molekul berhenti bergerak.
Hasil yang diperoleh merupakan pita-pita yang tipis. Perlu ditekankan bahwa
mobilitas molekul-molekul lebih banyak disebabkan oleh karena ukurannya.
Molekul yang kecil dengan muatan sedikit dapat bergerak mendahului molekul
yang besar meski pun muatannya banyak. Metoda ini baik digunakan untuk
memisahkan protein asli (native, bukan turunan) dan dalam hal ini penambahan
SDS (sodium dodecyl sulphate) boleh ditiadakan.
Penggolongan Atas Dasar Sistem Elekttroforesis
Sistem kontinyu dan diskontinyu.- Larutan penyangga adalah suatu yang
sangat penting pada elektroforesis jeli, baik untuk membuat jelinya sendiri mau
Universitas Gadjah Mada
pun untuk preparasi sampel atau untuk membuat medan listrik. Jika semua
larutan penyangga yang digunakan mempunyai pH yang sama dan tidak
mengalami
perubahan
selama
elektroforesis,
metoda
ini
dinamakan
elektroforesis sistem kontinyu. Sebaliknya jika larutan penyangga yang
digunakan untuk membuat jeli dan medan histrik berbeda dengan larutan
penyangga yang digunakan untuk preparasi sampel, maka elektroforesis
demikian dinamakan elektroforesis sistem diskontinyu. Preparasi elektroforesis
kontinyu dalam praktek tidak menimbulkan kesulitan, tetapi pada elktroforesis
diskontinyu diperlukan tambahan jeli (stacking gel) yang diletakkan di atas jeli
pemisah. Pada umumnya pada elektroforesis diskontinyu yang berbeda bukan
hanya pH larutan penyangga saja tetapi juga komposisi bahan penyangga yang
digunakan juga berbeda. Kelebihan elektroforesis sistem diskontinyu adalah
jumlah sampel yang diaplikasikan dapat lebih banyak dengan hasil resolusi tetap
baik.
Sistem desosiasi dan nondesosiasi. - Molekul-molekul tertentu mempunyai
struktur yang komplek yang mengandung berbagai ikatan. Contohnya protein
mengandung ikatan-ikatan hidrogen, disulfida, hidrofobik, ikatan ionik, dan
sebagainya. Sering kali untuk memperoleh hasil pemisahan yang balk, ikatanikatan tersebut perlu diputus.
Elektroforesisi yang dikerjakan dengan memutuskan ikatan-ikatan tersebut
dinamakan elektroforesis sistem desosiasi, dan sebaliknya jika ikatan-ikatan
tersebut
tidak
diputuskan
maka
dinamakan
elektroforesis
nondesosiasi.
Pemutusan ikatan dapat dilakukan dengan menggunakan kebanyakan deterjen,
misalnya sosium dodesil sulfat (SDS), urea, senyawa tiol, merkaptoetanol, dll.
Sodium dodesil sulfat berperan memecah ikatan nonkovalen, urea dan tiol
berfungsi sebagai denaturan protein, dan merkaptoetanol memutus ikatan
disulfida.
Isoelectric
focusing.-
Elektroforesis
zona
dengan
densitas
bertingkat
dimaksudkan untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya.
Isoelectric focusing dimaksudkan untuk memisahkan molekul-molekul (terutama
protein) berdasarkan titik isoelektriknya. Metoda ini sering disebut sebagai
electrofocusing saja.
Seperti telah dibahas sebelumnya, mobilitas molekul-molekul tergantung pada
jumlah muatan yang dibawa. Jika muatannya banyak maka mobilitasnya cepat.
Mobilitas menjadi nol (berhenti) jika molekul tidak mempunyai muatan. Protein
Universitas Gadjah Mada
adalah suatu senyawa organik yang bersifat amfolit, artinya mengandung gugusgugus yang bermuatan positif dan bermuatan negatif. Muatan yang menentukan
sifat amfolit protein sangat tergantung pada lingkungannya, yaitu pH. Protein
akan bermuatan positif jika pH lingkungannya rendah dan akan bermuatan
negatif jika pH lingkungannya tinggi. Pada pH tertentu protein tidak bermuatan
dan ini dinamakan titik isoelektrik. Pada titik isoelektrik semua amfolit tidak akan
bergerak pada medan listrik. Jika protein dielektroforesiskan dengan metoda ini
maka molekul protein akan bergerak menuju titik isoelektriknya dan sesudah
mencapai tempat tersebut akan berhenti, sementara protein-protein lainnya tetap
akan bergerak menuju titik isoelektriknya masing-masing. Pemisahan protein
berdasarkan titik isoelektriknya hanya mungkin dikerjakan jika media yang
digunakan mempunyai pH bertingkat. Untuk membuat tingkatan pH dengan dua
campuran larutan penyangga sangat sulit, karena meski pun hal
ini
memungkinkan tetapi pada saat elektroforesis berlangsung ion-ion larutan
penyangga juga akan bergerak, sehingga akan merusak sifat larutan penyangga
tersebut. Sementara itu gerakan molekul-molekul lebih lambat daripada
kecepatan kerusakan larutan penyangga itu sendiri. Untuk mengatasi hal
tersebut digunakan poliamfolit yang pada umumnya merupakan campuran
polimer aminoalifatik dengan asam karboksilat atau asam sulfonat. Dalam
perdagangan, poliamfolit banyak diberi nama sebagai ampholin, pharmalyte, dan
bilyte.
Sistem dua demenst- Operasi elektroforesis biasanya dilakukan hanya searah
(satu demensi). Elektroforesis dua demensi, adalah pemisahan molekul-molekul
berdasarkan mobilitas dua arah. Prinsip kerjanya seperti pada kromatografi
kertas atau lapis tipis dua arah. Elektroforesis konveksi, merupakan kombinasi
antara elektroforesis dengan difusi panas. Mobilitas molekul terjadi dua arah,
yaitu arah horizontal mengikuti proses elektroforesis dan arah vertikal mengikuti
tingkatan panas.
3-3 APLIKASI ELEKTROFORESIS LAINNYA
Teknik-teknik elektroforesis lainnya antara lain:
a.
Imonoelektroforesis, ialah teknik elektroforesis yang digunakan untuk
mendeterminasi konsentrasi antigen.
Universitas Gadjah Mada
b.
Isatochophoresis, ialah teknik elektroforesis yang dimaksudkan untuk
memisahkan molekul-molekul hanya berdasarkan jumlah muatannya dan
bukan berdasarkan ukuran molekul.
c.
Elektrodentasi.
Semula
metoda
ini
dinamakan
elektrodialisis
yang
dimaksudkan untuk memurnikan koloida. Prinsipnya adalah jika larutan
koloidal dialiri arus listrik, maka akan terjadi pemisahan menjadi dua bagian
satu diantaranya koloida. Dua lapisan yang dapat terpisah dapat dibedakan
dari warnanya atau dan refraksi indeknya. Cara ini banyak digunakan untuk
memurnikan hemoglobin dan serum albumin.
3-4 PERALATAN ELEKTROFORESIS
Elektroforesis kertas dan lapis tipis.- Peralatannya adalah sebuah tangki yang
mempunyai tiga bagian. Kedua bagian di tepi diisi dengan larutan penyangga
sedangkan bagian tengahnya diisi dengan air untuk menjaga kelembaban. Satu
lembar kertas saring diletakkan pada dudukan yang terdapat di dalam tangki
tersebut. Tepi yang satu dimasukkan ke dalam salah satu larutan penyangga dan
tepi lain yang berlawanan dimasukkan ke dalam larutan penyangga yang lain. Ke
dalam masing-masing larutan penyangga dimasukkan anoda dan katoda.
Sampel dimuatkan pada tengah kertas berupa garis memanjang atau noda. Alat
kemudian ditutup untuk menghindari penguapan larutan penyangga, dan arus
listrik dialirkan. Pemisahan akan terjadi, molekul yang bermuatan positif akan
bergerak ke arah katoda dan molekul yang bermuatan negatif akan bergerak ke
arah anoda, sedangkan molekul yang bermuatan netral tidak akan bergerak atau
tetap tinggal di tengah-tengah kertas. Molekul yang bermuatan banyak akan
bergerak lebih cepat daripada yang bermuatan sedikit. Hasil elektroforesis dapat
diketahui dengan visualisasi yang dapat dikerjakan dengan pengecatan atau
dengan metoda lainnya (penyinaran, pemanasan, dll).
Universitas Gadjah Mada
Peralatan elektroforesis kertas atau lapis tipis
Elektroforesis dengan media jeli. - Ada dua macam peralatan yang dapat
digunakan untuk melakukan elektroforesis dengan media semipadat. Yang
pertama berbentuk tabung yang ujung-ujungnya terbuka. Kedalam tabung di
masukkan jeli sedangkan masing-masing ujung tabung dihubungkan dengan
larutan penyangga yang diberi katoda dan anoda. Tipe yang kedua dengan
menggunakan dua pelat yang di antaranya dimasukkan jeli sehingga jeli
berbentuk lembaran (slab). Dua tepi yang berlawanan (biasanya tepi atas dan
tepi bawah) dihubungkan dengan larutan penyangga yang diberi katoda dan
anoda.
A
B
C
D
Peralatan elektroforesis dengan media jeli.
A dan C masing-masing elektroforesis tabung dan lembaran (slab)
sistem kontinyu. B dan D masing-masing elektroforesis tabung dan
lembaran (slab) sistem diskontinyu
Universitas Gadjah Mada
3-5 OPERASIONAL ELEKTROFORESIS DENGAN MEDIA SEMI PADAT
Persiapan Larutan Penyangga
Larutan penyangga terutama digunakan untuk membuat medan listrik. Larutan
penyangga untuk membuat medan listrik lebih populer dinamakan sebagai
larutan penyangga reservoir.
Larutan penyangga yang digunakan dalam elektroforesis kertas atau lapis tipis
tergantung pada komponen yang akan dipisahkan. Untuk pemisahan molekulmolekul protein dapat digunakan berbagai larutan penyangga, antara lain larutan
penyangga barbiton pH 8,6, larutan penyangga Na-tetraborat pH 8,6, larutan
penyangga Na-fosfat pH pH 7,4 atau pH 6,0, larutan penyangga asam format pH
1,9, larutan penyangga ftalat pH 4,0, larutan penyangga borat pH 10,0, larutan
penyangga Na-karbonat pH 11,5, dan larutan penyangga piridin asetat, pH3,5—
pH6,5.
Pada elektroforesis jeli, larutan penyangga selain digunakan untuk membuat
medan listrik juga untuk membuat jelinya sendiri. Tergantung pada sistem
elektroforesis yang digunakan, larutan penyangga untuk peparasi jeli dan untuk
membuat medan listrik dapat sama atau dapat berbeda baik pHnya mau pun
komposisi bahannya. Pemiihan larutan penyangga pada elektroforesis dengan
media jeli harus dilakukan dengan cermat sesuai dengan komponen yang akan
dipisahkan. Selain tergantung pada jeli yang digunakan juga harus diperhatikan
komponen yang akan dipisahkan. Berbagai larutan penyangga yang digunakan
pada elektroforesis dengan media jeli untuk pemisahan protein:
a.
Elektroforesis dengan media jeli tepung antara lain larutan penyangga fosfat
pH 7,4, larutan penyangga antrium asetat pH 5,5, larutan penyangga antrium
asetat pH 5,5, larutan penyangga tris-EDTA pH 8,6, larutan penyangga
asam borat NaOH pH 8,5, larutan penyangga asam format NaOH pH 3,1,
dan larutan penyangga tris-asam sitrat pH 8,6.
b.
Elektroforesis dengan media jeli agar antara lain larutan penyangga asam
asetat 0, 1M pH 4,0, larutan penyangga asetat-EDTA 0, 1M pH 4,5, larutan
penyangga barbiton-asetat D, 1 M pH 8,6, larutan penyangga barbitonkalsium laktat pH 8,6, larutan penyangga tris-EDTA borat pH 9,0, dan larutan
penyangga glisin 0,1M pH 9,0.
c.
Elektroforesis dengan media jeli poliakrilamida antara lain larutan penyangga
tris pH 6,8, 7,5, 8,06, 8,15, 8,4, larutan penyangga fosfat pH 2,15 7,2 atau
Universitas Gadjah Mada
12,43, larutan penyangga citrat pH 3,06 atau pH 4,76, larutan penyangga
asetat pH 5,23 atau pH 5,40, dan larutan penyangga format pH 3,75.
Persiapan Jeli
Jeli tepung umumnya dipreparasi dan tepung kentang. Meski pun demikian
berbagai tepung yang lain seperti tepung kasava (ketela pohung) dan tepung
ketela rambat juga sering digunakan. Tepung dicampur dengan larutan
penyangga yang akan digunakan pada konsentrasi tertentu. Setelah terjadi
suspensi yang homogen kemudian tepung dipanaskan sampai terjadi jeli.
Larutan jeli yang masih dalam keadaan panas kemudian dimasukkan ke dalam
tabung atau kompartemen pelat yang akan digunakan untuk elektroforesis dan
ditunggu sampai memadat dan dingin (biasanya memerukan waktu 2-3 jam). Jika
tidak segera digunakan sebaiknya disimpan dahulu pada yang dingin bersuhu
rendah (± 2°C) selama semalam.
Media agar dipreparasi dengan cara mencampur agar dengan larutan penyangga
kemudian dipanaskan sampai teijadi jeli yang transparan. Jumlah agar yang
digunakan tergantung konsentrasi yang dikehendaki. Dapat ditambahkan zat
penghambat bakteri jika diperlukan seperti natrium azida (0,1%) atau mertiolat
(0,01%). Jeli agar hangat (±50°C) kemudian dituangkan ke dalam tabung atau
kompartemen pelat yang akan digunakan untuk elektroforesis dan ditunggu
sampai memadat dan dingin. Sebelum digunakan sebaiknya disimpan dahulu
pada suhu rendah (4°C) selama 24 jam.
Elektroforesis dengan media poliakrilamida pada umumnya dilakukan dengan
berbagai sistem tergantung pada penggunaannya. Oleh karena itu preparasi jeli
poliakrilamida sedikit lebih komplek. Komposisi bahan yang digunakan untuk
membuat jeli yang dipersiapkan untuk elektroforesis sistem kontinyu, diskontinyu,
desosiasi atau nondesosiasi masing-masing berbeda. Berikut disampaikan
beberapa resepnya.
Universitas Gadjah Mada
Tabel 4.
Resep untuk membuat jeli poliakrilamida untuk elektroforesis system kontinyu
nondesosiasi
Tabel 5.
Resep untuk membuat jell poliakrilamida untuk elektroforesis sistem
diskontinyu nondesosiasi
Tabel 6.
Resep untuk membuat jell poliakrilamida untuk elektroforesis sistem
kontinyu desosiasi
Universitas Gadjah Mada
Tabel 7.
Resep untuk membuat jeli poliakrilamida untuk elektroforesis sistem diskontinyu
desosiasi
Aplikasi Sampel
Sampel protein dan turunannya.- Protein murni pada umumnya mudah
dilarutkan dalam larutan penyangga, tetapi yang terpenting protein harus dalam
keadaan denaturasi sempurna dan tereduksi ikatan disulfidanya. Supaya protein
dalam kondisi seperti itu, maka larutan protein dapat dipanaskan dan ke
dalamnya
ditambahkan
merkaptoetanol,
denaturan
guanidin
seperti
hidrokiorida,
dll.
urea,
sodium
Proses
dodesil
pemanasan
sulfat,
protein
mempunyai keuntungan lain ialah jika protein merupakan enzim, maka
pemanasan akan menghentikan aktivitasnya. Konsentrasi protein dibuat antara
0,05- 1 ,Omg/ ml, sedangkan jumlahnya pada imumnya berkisar antara 20200µ1.
Sampel nonprotein. - Preparasi sampel nukleotida atau turunannya dan
karbohidrat cukup dengan dilarutkan dalam larutan penyangga yang sesuai.
Yang terpenting adalah pada waktu ekstraksi komponen tersebut harus diyakini
dalam keadaan murni.
Operasi Elektroforesis
Besarnya kekuatan tegangan dan arus listrik dapat divariasi sesuai dengan
kebutuhan. Makin tinggi tegangan listrik dan arus listrik, makin cepat proses
elektroforesis, tetapi akan timbul panas. Dengan tegangan listrik 100V dan arus
Universitas Gadjah Mada
listrik 3mA elektroforesis pada media agar memerlukan waktu kurang Iebih 6 jam
untuk memisahkan komponen protein. Elektroforesis pada media tepung
umumnya dioperasikan pada 100 V dengan arus listrik 5mA dan memerlukan
waktu 17-19 jam untuk memisahkan protein atau dengan 220V 5mA dengan
waktu 7-9 jam. Elektroforesis pada media poliakrilamida memerlukan kekuatan
tegangan listrik 200 V dan arus listrik 30mA untuk memisahkan komponen
protein selama 6 jam. Meski pun demikian, kondisi operasi elektroforesis dapat
divariasi sesuai dengan kebutuhan. Akan tetapi perlu diingat bahwa makin tinggi
kekuatan tegangan dan arus listrik dapat menimbulkan timbulnya panas yang
dapat berakibat pada penguapan larutan penyangga, kerusakan jeli, perubahan
sifat komponen, dan lain sebagainya. Sebaliknya penggunaan tegangan dan
arus listrik yang rendah, meski pun hasilnya dapat baik tetapi mobilitas
komponen yang memisah akan sangat lambat sehingga elektroforesis menjadi
lama.
Visualisasi Hasil
Setelah elektroforesis dilakukan selesai, hasilnya harus divisualisasi untuk
mengetahui resolusinya. Visualisasi umumnya dikerjakan dengan pengecatan.
Berbagai macam cat yang banyak digunakan misalnya bromofenol biru,
naftalena hitam 12B, sudan hitam B, coomassie biru R250, reagen asam schiff
periodat, reagen ninhidrin, dan lain sebagainya tergantung pada jenis komponen
yang dipisahkan. Jeli direndam dalam larutan cat selama beberapa waktu
sehingga cat akan bereaksi dengan komponen memberikan warna yang dapat
diamati. Kelebihan cat dihilangkan dengan pencucian dengan larutan tertentu,
misalnya asam asetat, sampai jeli yang tidak mengandung komponen (latar
belakang) menjadi terang (transparan).
Identifikasi dan Interpretasi
Untuk mengetahui jenis komponen yang ada perlu dicocokan dengan standar
yang dielektroforesiskan dengan cara yang sama. Masing-masing, komponen
dan standar, dihitung faktor retardasinya dan jika keduanya mempunyai nilai
yang sama, maka jenis komponen yang memisah dapat diketahui.
Hasil akhir elektroforesis akan lebih akurat jika identifikasi dilakukan juga dengan
menggunakan teknik densitometri. Prinsipnya mirip dengan peneraan dengan
menggunakan spektrofotometer. Peneraan dilakukan dengan proses “scanning”.
Universitas Gadjah Mada
Teknik lainnya yang dapat digunakan adalah dengan penggunaan metoda
otoradiografimetri.
3-6 LATIHAN PEMAHAMAN MATERI
1.
Terangkan dengan jelas prinsip kerja elektroforesis!
2.
Pada proses hidrolisis protein akan dihasilkan peptida-peptida yang
mempunyai polaritas berbeda-beda. Diskusikan peptida yang mana akan
memisah terlebih dahulu dan yang terakhir!
3.
Berikan alasan dengan penjelasan mengapa pemilihan larutan penyangga
menjadi penting pada elektroforesis!
4.
andaikata anda diminta memilih metoda elektroforesis untuk memisahkan
protein yang terdapat pada daging ikan, metoda mana yang anda gunakan ?
5.
Rancang suatu elektroforesis untuk memisahkan jenis-jenis enzim yang ada
dalam sel bakteri!
6.
Komponen-komponen karbohidrat dan lipida dalam keadaan “native” pada
umumnya tidak bermuatan. Bagaimana penjelasan yang anda berikan untuk
melakukan pemisahan dengan elektroforesis komponen-komponen tersebut!
Universitas Gadjah Mada