Tugas Dasar Bioteknologi

NAMA
: LUKAS WAHYU PURWOSASMITO
NIM
: 125100601111020
KELAS
:H
TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI
Tugas sekuensing
1. Jelaskan pengertian DNA Sekuensing
2. Jelaskan pengertian Hibridisasi
3. Jelaskan prinsip kerja Southern Blot, Northern Blot dan Western Blot. Sebutkan persamaan
dan perbedaannya
Jawab :
1. DNA Sekuensing merupakan salah satu proses untuk menentukan urutan basa nukleotida
pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut juga dikenal sebagai informasi yang paling
mendasar pada suatu gen atau genom karena mengandung instruksi yang dibutuhkan
dalam proses pembentukan tubuh makhluk hidup. DNA Sekuensing dapat dimanfaatkan
untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara
membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah diketahui. Teknik
ini banyak digunakan pada riset dasar biologi maupun berbagai bidang terapan seperti
kedokteran, bioteknologi, forensik, dan antropologi.
2. Hibridisasi merupakan suatu proses pengembangbiakkan dua jenis hewan atau tumbuhan
yang berbeda varietas dan memiliki sifat-sifat unggul. Tujuan hibridisasi adalah untuk
memperoleh genotipe baru yang memiliki sifat-sifat unggul secara kuantitatif dan
kualitatif sama seperti induknya. Hibridasi juga bertujuan untuk memperluas keragaman
genotipe dengan cara menggabungkan semua sifat baik ke dalam satu genotipe baru.
3. A. Southern Blotting
Southern Blotting merupakan suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi sekuen DNA
spesifik pada suatu DNA sampel menggunakan probe atau komplementernya. Prinsip kerja dari
Southern Blotting adalah melakukan transfer molekul DNA yang telah dipisahkan
oleh gel elektroforesis ke dalam membran nilon. Membran nilon adalah tempat
hibridisasi antara sekuen DNAspesisfik dengan Probe. Sedangkan, probe adalah DNA
untai tunggal yang merupakan komplemen dari DNA target.
B. Northern Blotting
Northern Blotting digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu
molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang berbeda dari RNA.
Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel, dan
sebuah noda. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian
ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan
kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label
yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili
ukuran RNA terdeteksi dalam sampel.
C. Wesern Blotting
Wesern Blotting adalah metode untuk mengidentifikasi antibodi spesifik pada
suatu protein dengan berat molekul tertentu yang telah diseparasi. Pada awalnya berat
molekul protein diseparasi atau dipisahkan dengan menggunakan SDS-PAGE
elektroforesis kemudian ditransfer ke kertas nitrocellulose (NC) untuk melakukan
western blot.
NAMA
: LUKAS WAHYU PURWOSASMITO
NIM
: 125100601111020
KELAS
:H
TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI
Tugas PCR
1. Apa kepanjangan PCR, jelaskan pengertiannya
2. Apa saja macam2 PCR, apa perbedaannya
3. Jelaskan prinsip kerja real time PCR
4. Jelaskan prinsip kerja reverse transkriptase PCR
5. Jelaskan prinsip kerja ELISA
Jawab :
1. PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu metode untuk amplifikasi potongan
DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106-kali lipat dari
jumlah nanogram dari DNA template. Proses ini mirip dengan proses replikasi DNA
secara in vivo yang bersifat semi konservatif. Polymerase Chain Reaction (PCR) ini
dapat digunakan untuk amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan
nukleotida suatu DNA yang mengalami mutasi, pada bidang kedokteran forensik serta
melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan “finger print”.
2. A. Real-Time PCR
Real-Time PCR (Quantitative Real time Polymerase Chain Reaction atau QPCR) merupakan suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Teknik
ini digunakan untuk memperbanyak sekaligus menghitung jumlah target molekul
DNA hasil memperbanyak tersebut. Real time PCR memungkinkan dilalukan deteksi
dan kuantifikasi sekaligus terhadap sequens spesifik dari sampel DNA yang dianalisis.
B. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kinetic polymerase
chain reaction. RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana yang diamplifikasi
berupa m-RNA. Pada metode PCR biasa sumber sampel yang digunakan adalah DNA
yang diekstrak dari sel atau jaringan. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan
DNA melainkan RNA.
C. Nested PCR
Nested PCR
menggunakan
adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA
bantuan enzim DNA
polymerase
yang
menggunakan
dua
pasang primer untuk mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR,
jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut
diamplifikasi untuk kedua kalinya oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested
PCR adalah PCR yang sangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.
D. Multiplex PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuran PCR tunggal
untuk menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA
yang berbeda. Dengan penargetan gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh
dari lari-tes tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih
banyak waktu untuk melakukan. temperatur Annealing untuk masing-masing set
primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi tunggal, dan
ukuran amplikon.
E. PCR-ELISA
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam
nukleat yang meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana
dalam sebuah pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan
metode ini. Dengan metode inilah dapat dilakukan pengukuran sequen internal pada
produk PCR. Metode ini lebih dipilih karena lebih murah dibandingkan metode Real
Time PCR.
3. Prinsip kerja Real-Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter fluoresen.
Sinyal fluoresen akan meningkat seiring dengan bertambahnya produk PCR dalam
reaksi. Dengan mencatat jumlah emisi fluoresen pada setiap siklus, reaksi selama fase
eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Makin tinggi tingkat
ekspresi gen target maka deteksi emisi fluoresen makin cepat terjadi. Terdapat 2 (dua)
metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :

Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai
ganda (dsDNA) misalnya SyBr Green, dan

Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan
berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya
probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses
PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap
siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA
(DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.
4. RT PCR atau disebut juga Reverse Transcriptase PCR adalah teknik yang digunakan
untuk membuat cDNA (complementary DNA) dengan RNA sebagai template-nya.
Proses ini adalah kebalikan dari transkripsi DNA menjadi RNA yang umum terjadi pada
makhluk hidup, sehingga dinamakan reverse transcription (transkripsi terbalik). Teknik
ini merupakan proses PCR dengan menggunakan enzim reverse transcriptase untuk
membuat DNA dari template RNA. Reverse transcriptase, atau RNA-dependent- DNA
polymerase, merupakan jenis enzim yang biasanya ditemukan pada retrovirus. Enzi mini
mensintesis DNA beruntai tunggal. DNA yang dibuat menggunakan template RNA
disebut cDNA. cDNA kemudian diteruskan menggunakan proses PCR ?normal?, di
bawah kendali DNA polymerase, sehingga dapat mensintesis jutaan molekul DNA untai
ganda yang mewakili urutan RNA asli.
5. Prinsip Kerja Elisa adalah Pertama antibodi yang hendak diuji ditempelkan pada suatu
permukaan yang berupa microtiter. Penempelan tersebut dapat dilakukan melalui dua
cara, yaitu penempelan secara non spesifik dengan adsorbs ke permukaan microtiter, dan
penempelan secara spesifik dengan menggunakan antibody atau antigen lain yang
bersifat spesifik dengan antigen atau antibodi yang diuji. Selanjutnya antibodi atau
antigen spesifik yang telah ditautkan dengan suatu enzim signal (disesuaikan dengan
sampel, bila sampel berupa antigen maka digunakan antibodi spesifik , sedangkan bila
sampel berupa antibodi, maka digunakan antigen spesifik) dicampurkan ke atas
permukaan tersebut, sehingga dapat terjadi interaksi antara antibodi dengan antigen yang
bersesuaian. Kemudian ke atas permukaan tersebut dicampurkan suatau substrat yang
dapat bereaksi dengan enzim signal. Pada saat substrat tersebut dicampurkan ke
permukaan, enzim yang bertaut dengan antibodi atau antigen spesifik yang berinteraksi
dengan antibodi atau antigen sampel akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
suatu signal yang dapat dideteksi. Pada ELISA flourescense misalnya, enzim yang tertaut
dengan antibodi atau antigen spesifik akan bereaksi dengan substrat dan menimbulkan
signal yang berupa pendaran flourescense