identifikasi protein spesifik biofilm candida albicans sebagai target

Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
IDENTIFIKASI PROTEIN SPESIFIK BIOFILM CANDIDA ALBICANS
SEBAGAI TARGET PENENTUAN PROTEIN SPESIFIK ANTIGENIK
IDENTIFICATION BIOFILM SPESIFIC PROTEIN OF CANDIDA ALBICANS
AS A TARGET TO DETERMINE ANTIGENIK SPESIFIC PROTEIN
Mirwa Adiprahara Anggarani1), Afaf Baktir2), Sri Puji Astuti Wahyuningsih3)
1)
Jurusan Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Negeri Surabaya
Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga
3)
Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga
2)
e-mail: [email protected]
Candida albicans adalah flora normal dan berpotensi patogen yang dapat membentuk
biofilm pada permukaan inang dan peralatan medis. Profil protein biofilm fungi belum banyak
dijelaskan secara detail, namun demikian diketahui bahwa pembentukan biofilm memberikan
peranan penting terhadap sifat patogen C. albicans. Dalam penilitian ini, digunakan teknik
elektroforesis gel yaitu Sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
untuk mengidentifikasi protein spesifik biofilm C. albicans. Hasilnya, teridentifikasi protein spesifik
biofilm C. albicans, meliputi protein dengan berat molekul 84,4; 69,5; 67,1; 62,5 kD. Profil
protein spesifik biofilm ini dapat digunakan sebagai kandidat untuk mengidentifikasi protein
antigenik spesific C. albicans.
Kata kunci: Candida albicans, biofilm, SDS-PAGE, protein spesifik biofilm
Abstract
Candida albicans is a human commensal and opportunistic pathogen that participates in
biofilm formation on host surface and also on medical devices. Protein profiles of fungal biofilm
have not investigated in details, although such profile are believed to play critical roles in fungal
biofilm formation that can be caused its pathogenic. We used Sodium dodecyl sulfate –
polyacrilamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to identification biofilm specific protein of C.
albicans. The result, we identify biofilm specific protein profile of C. albicans includes proteins
with molecular weight 84,4; 69,5; 67,1; 62,5 kD. This biofilm specific protein profile is a candidate
to identification antigenic biofilm specific protein of C. albicans.
Keyword: Candida albicans, biofilm, SDS-PAGE, biofilm specific protein
biofilm (Mitchell et al., 2005). Biofilm
merupakan alat perlindungan bagi mikroba
terhadap respon imun sel inang dan zat
antimikroba. Virulensi dan resistensi
sebagian besar mikroorganisme patogen,
termasuk
Candida,
ditentukan
oleh
kemampuannya
membentuk
biofilm.
Komunitas biofilm memiliki karakter yang
spesifik dan sifat fenotip yang unik. Dengan
demikian, biofilm adalah bentuk patogen dari
PENDAHULUAN
Candida merupakan fungi dimorfik
dan secara normal dapat berkolonisasi pada
kulit dan membran mukosa pada individu
sehat. Dengan demikian secara umum dapat
ditemukan pada saluran pencernaan, mulut
rahim dan vagina. Komunitas Candida dapat
membentuk asosiasi koloni yang disebut
B - 49
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
Candida. Candida dapat pula berada dalam
bentuk lain yang tidak patogen, yaitu bentuk
bebas yang dinamakan bentuk planktonik
(Naglik et al., 2003).
Disamping
faktor
morfologi,
patogenitas C. albicans juga berkaitan
dengan metabolit yang dihasilkan. Metabolit
tersebut diantaranya adalah asetaldehid
(Mravec dan Epp, 2006), arabinosa dan
asam-asam organik seperti asam tartrat
(Clack, 2009). Metabolit C. albicans di
dalam tubuh dapat memicu terjadinya mutasi
DNA inang yang dapat menghasilkan protein
misfolding dan atau secara langsung
mendenaturasi protein inang. Kelainan
struktur protein inang akan menyebabkan
timbulnya kelainan fungsi metabolisme
maupun struktur organ inang, hingga terjadi
kelainan atau penurunan fungsi organ inang
(Alvarado, 2008). Organ yang telah
dilaporkan mengalami penurunan fungsi
karena infeksi oleh C. albicans antara lain
adalah hati, jantung, ginjal, paru-paru,
pencernaan, dan otak (Lakkawar et al.,
2003). Metabolit toksik tersebut menjadi
penyebab timbulnya kerusakan jaringan atau
organ hingga timbul penyakit tertentu.
Penyakit yang disebabkan oleh infeksi C.
albicans yang berkaitan dengan metabolit
yang dihasilkan antara lain adalah parkinson
(Mravec dan Epp, 2006), schizophrenia
(Truss, 1981), autis atau Autistic Spectrum
Disorder (Clack, 2009), dan alzheimer (Tanzi
et al., 2010). Kandidiasis atau infeksi
Candida terjadi sebagai hasil gangguan
keseimbangan antara imunitas inang dan
penyerangan patogen (Kuleta et al., 2009).
Beberapa infeksi Candida menyebabkan
masalah yang serius khususnya pada individu
dengan mekanisme sistem imun yang lemah
(Kuleta et al., 2009). Faktor yang
mempengaruhi peningkatan populasi (over
growth) C. albicans di saluran pencernaan
adalah terapi imunosupresif, terapi antibiotik,
infeksi HIV, diabetes, dan penuaan (Ribot et
al., 2001).
Dinding sel C. albicans memiliki
struktur yang kuat dan liat. Struktur liat
tersebut meningkat jauh lebih kuat pada
bentuk biofilm yang disebabkan oleh
keberadaan matrik ekstraseluler pada biofilm
(Rashki, 2009). Chaffin dan Casanova (1991)
melakukan penelitian untuk mengisolasi
ekstrak protein dinding sel planktonik C.
albicans. Ekstrak protein dinding sel
planktonik diperoleh melalui gabungan
metode ekstraksi kimia dan reaksi enzimatik.
Penelitian tersebut hanya mengisolasi ekstrak
protein dinding sel planktonik C. albicans,
sedangkan dalam penelitian ini akan
dilakukan isolasi ekstrak protein matrik
biofilm C. albicans menggunakan metode
yang sama.
Berdasarkan fakta yang telah
diuraikan tentang patogenitas biofilm
C. albicans yang dapat menimbulkan
berbagai penyakit serius, maka perlu
dilakukan pengembangan strategi deteksi
biofilm C. albicans. Dengan demikian, pada
penelitian ini akan diidentifikasi protein
spesifik biofilm C. albicans melalui
pendekatan proteomik. Target protein
spesifik biofilm ini selanjutnya dapat
dikembangkan
untuk
mengidentifikasi
protein antigenik spesifik biofilm C. albicans
yang dapat dijadikan sebagai kandidat
terhadap biomarker kandidiasis.
BAHAN DAN METODE
Alat
Beberapa alat yang digunakan antara
lain: autoklaf (OSK 6508 Steam pressure
apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), sentrifuga
Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik
(Ohaus), pH meter (Metrohm 744), oven
(Memmert, Jerman), lemari pendingin -20°C
(Royal Chest Freezer BD195), pipet mikro
(Eppendorf), waterbath (sansat tipe SYK382-M),
spektrofotometer
UV-VIS
(Shimadzu 1700 Pharma), piranti SDSPAGE (Biorad), penggoyang (Heidolph
Polymax 1040), shaker incubator (Heidolph
Unimax 1010), dan alat gelas yang lazim
digunakan di laboratorium.
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara
lain: media YPD (yeast extract, pepton,
dextrosa), media Sabouraud Dextose Agar /
SDA (dextrosa, pepton, agar), 50 mM PBS,
0,6M KCl, larutan 1% β-merkaptoetanol
dalam (NH4)2CO3, Zymolyase, aseton, buffer
SDS
(Tris-HCl,
gliserol,
SDS,
βmercaptoetanol), 10% SDS-gel poliakrilamid.
Prosedur Penelitian.
Kultivasi C. albicans
B - 50
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
Dibuat media padat Sabouraud
dextrose agar (SDA) sebanyak 20 mL dengan
perbandingan pepton : dextrosa : agar = 1 : 4
: 2. Selanjutnya ditempeli dengan 8 buah
membran filter selulosa nitrat berdiameter 25
mm dan ukuran pori 0,2 µm yang telah
disterilkan menggunakan radiasi UV selama
15 menit dan ditetesi dengan 50 µL suspensi
pelet C. albicans hasil yang didapat dari
sentrifugasi dan pencucian. Kemudian
dibiarkan sampai cairan terserap ke dalam
membran dan diletakkan secara terbalik.
Setiap 24 jam membran filter selulosa nitrat
dipindahkan ke media padat SDA yang baru.
Berikutnya berulang hingga 48 jam dilakukan
pemanenan biofilm. Untuk keperluan
prosedur preparasi ekstrak protein biofilm C.
albicans dilakukan resuspensi biofilm ke
dalam 10 mL PBS 50 mM.
Pembiakan isolat C. albicans dalam media
cair
Media cair yang digunakan adalah
media ekstrak ragi, pepton dan dextrosa
(YPD). Dibuat media cair YPD dengan
perbandingan yeast : peptone : agar = 1 : 2 :
2. Selanjutnya sebanyak isolat C. albicans
dimasukkan ke dalam media cair YPD.
Kemudian diinkubasi pada suhu 37 ˚C
dengan kecepatan pengocokan 155 rpm
selama 1 hari.
Pembuatan kultur C. albicans pada media
padat
Media padat yang digunakan adalah
media ekstrak ragi, pepton dan dextrosa
(YPD). Dibuat media cair YPD dengan
perbandingan yeast : peptone : agar = 1 : 2 :
2. Dilakukan penumbuhan starin C. albicans
pada media padat. Sedikit isolat C. albicans
dari biakan cair digoreskan ke media padat
dan disimpan di dalam inkubator pada suhu
37 ˚C selama 1 hari
Analisis biofilm C. albicans menggunakan
SEM
Biofilm
C.
albicans
yang
ditumbuhkan pada media biofilm selama 48
jam, diamati morfologi permukaannya
menggunakan Scanning Electron Microscope
(SEM). Biofilm yang akan dianalisis
dikeringkan semalam pada suhu 37 ˚C dan
dilakukan dehidrasi melalui pencucian etanol
bertingkat (70 % selama 10 menit, 95 %
selama 10 menit dan 100 % selama 20
menit). Biofilm yang telah dikeringkan
dilakukan proses coating menggunakan
emas/palladium dan diamati morfologi
permukaannya
menggunakan
Scanning
Electron Microscope (SEM).
Pembuatan inokulum C. albicans
Media cair yang digunakan adalah
media YPD. Dibuat media cair YPD dengan
perbandingan yeast : peptone : agar = 1 : 2 :
2. Sedikit koloni tunggal C. albicans dari
media padat disuspensikan ke dalam 20 mL
media cair YPD. Kemudian diinkubasi
selama 24 jam pada suhu 37 ˚C dan aerasi
dengan kecepatan pengocokan 155 rpm.
Inokulum yang terbentuk diukur densitas
optiknya
(OD)
menggunakan
spektrofotometer UV-VIS pada λ 600 nm.
Pembuatan dan analisis biofilm C. albicans
Pembuatan biofilm C. albicans
Koloni
tunggal
C.
albicans
diinokulasi ke dalam 20 mL media cair YPD
dan diinkubasi pada suhu suhu kamar dengan
kecepatan pengocokan 160 rpm selama 1 hari
sesuai dengan metode Hetrick et al. (2009).
Selanjutnya biakan sel dipanen dengan cara
sentrifugasi pada 10.000 rpm dan suhu 4 ˚C
selama 15 menit. Pelet yang didapat dicuci
dengan 0,1 M buffer fosfat salin (PBS) steril.
Proses pencucian ini dilakukan dua kali.
Selanjutnya endapan sel
C. albicans
disuspensi dengan PBS hingga mencapai OD
0,5 pada λ 600 nm menggunakan
Spektrofotometer UV-VIS.
Preparasi ekstrak protein planktonik dan
biofilm C. albicans
Preparasi ekstrak protein planktonik C.
albicans
Dilakukan sentrifugasi terhadap
inokulum selama 15 menit pada suhu 22˚C
dengan kecepatan 200 rpm. Pelet sel
diresuspensi menggunakan 165 mL larutan
kerja (1% β-merkaptoetanol dalam 1,89 gr/L
(NH4)2CO3 pH 8,64) kemudian diinkubasi
pada suhu 37˚C
selama 30 menit.
Selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit
pada suhu 22˚C dengan kecepatan 1500xg.
Supernatan yang didapatkan di freeze dry dan
hasilnya mengandung protein dinding sel C.
albicans (ekstrak A). Sedangkan pelet sel
dicuci dengan air dingin dan dilanjutkan
B - 51
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
pencucian
menggunakan
0,6M
KCl.
Kemudian diresuspensi ke dalam 100 mL 0,6
KCl yang mengandung 0,5 mg/mL
zymolyase dan diinkubasi pada suhu 28˚C
selama 2 jam dengan pengocokan lemah.
Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 3500 rpm dan dipisahkan
antara supernatan dan pelet. Supernatan yang
diperoleh disentrifugasi selama 30 menit
dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian
larutan yang jernih di freeze dry dan hasilnya
mengandung protein dinding sel C. albicans
(ekstrak B), sedangkan peletnya merupakan
protoplas (PY). Untuk analisis selanjutnya
ekstrak A digabung dengan ekstrak B.
0,1 mL larutan kalium persulfat 10 %, 0,01
mL larutan TEMED dan 3,4 mL H2O.
Campuran
komponen
gel
separating
dimasukkan ke dalam sepasang pelat kaca
dan ditunggu hingga gel terpolarisasi dan
mengeras. Gel stacking dibuat dengan
komposisi sebagai berikut: 0,67 mL larutan
akrilamid-bisakrilamid, 1,25 mL larutan trisHCl 1M pH 6,8, 0,25 mL larutan SDS 10 %,
0,05 mL larutan kalium persulfat 10 %, 0,01
mL larutan TEMED dan 3,075 mL H2O.
Campuran
komponen
gel
stacking
dimasukkan
diatas
gel
separating.
Selanjutnya sisir dipasang untuk membuat
sumuran tempat memasukkan sampel protein.
Setelah gel stacking terpolarisasi dan
mengeras plat kaca yang telah berisi gel
dilepas
dari
cetakannya
selanjutnya
dirangkaikan pada apparatus elektroforesis
dan dituangi buffer separating. Selanjutnya
sebanyak 10 µL masing sampel protein
dicampur dengan 2 µL sampel buffer. Marker
protein dibuat dari campuran 10 µL
fermentas dicampur dengan 2 µL. Sampel
protein dan marker protein dimasukkan
dalam sumuran pada gel. Kemudian buffer
elektroforesis dituang hingga memenuhi bak.
Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100
volt, 200 mA selama ± 1 jam. Untuk
menampilkan
pita-pita
protein
hasil
pemisahan
dilakukan
pewarnaan
menggunakan Coomassie Briliant Blue.
Preparasi ekstrak protein biofilm C.
albicans
Biofilm dicuci dalam larutan PBS
dan
disentrifugasi,
kemudian
pelet
diresuspensi menggunakan 165 mL larutan
kerja (1% β-merkaptoetanol dalam 1,89 gr/L
(NH4)2CO3 pH 8,64) kemudian diinkubasi
pada suhu 37˚C
selama 30 menit.
Selanjutnya disentrifugasi selama 15 menit
pada suhu 22˚C dengan kecepatan 1500xg.
Supernatan yang didapatkan dilakukan
freeze dry dan hasilnya mengandung protein
biofilm C. albicans (ekstrak C). Sedangkan
pelet sel dicuci dengan air dingin dan
dilanjutkan pencucian menggunakan 0,6M
KCl. Kemudian diresuspensi ke dalam 100
mL 0,6 KCl yang mengandung 0,5 mg/mL
zymolyase dan diinkubasi pada suhu 28˚C
selama 2 jam dengan pengocokan lemah.
Selanjutnya disentrifugasi selama 10 menit
dengan kecepatan 3500 rpm dan dipisahkan
antara supernatan dan pelet. Supernatan yang
diperoleh disentrifugasi selama 30 menit
dengan kecepatan 10.000 rpm, kemudian
larutan yang jernih di freeze dry dan hasilnya
mengandung protein biofilm C. albicans
(ekstrak D), sedangkan peletnya merupakan
PB. Untuk analisis selanjutnya ekstrak C
digabung dengan ekstrak D.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Penentuan Protein Spesifik Biofilm C.
albicans
Penentuan protein spesifik biofilm C.
albicans dilakukan dengan memisahkan
protein hasil preparasi ekstrak protein
planktonik dan biofilm
C. albicans
berdasarkan berat molekulnya melalui
metode SDS-PAGE.
Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel
electrophoresis (SDS-PAGE)
Melalui SDS-PAGE, komponen
protein dalam ekstrak protein planktonik dan
biofilm C.
albicans
akan terpisah
berdasarkan berat molekulnya. Penggunaan
SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) berfungsi
untuk mengikat gugus hidrofobik protein,
yang menyebabkan pelepasan struktur lipat
(folding) protein. Dengan demikian protein
Penentuan protein spesifik biofilm C.
albicans
SDS-PAGE
Ekstrak protein dipisahkan melalui
SDS-PAGE. Gel separating dibuat dengan
komposisi sebagai berikut: 4 mL larutan
akrilamid-bisakrilamid, 2,5 mL larutan trisHCl 2M pH 8,8, 0,05 mL larutan SDS 10 %,
B - 52
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
akan tetap stabil di dalam larutan dalam
bentuk konformasi linier. Oleh karena itu,
ukuran kompleks SDS-protein proporsional
dengan berat molekul protein. Dimana
protein dengan berat molekul tinggi akan
bergerak lebih lambat, sehingga terfraksinasi
lebih dahulu dan protein dengan berat
molekul rendah akan bergerak lebih cepat,
sehingga terfraksinasi kemudian.
Elektroforesis
terhadap
ekstrak
protein planktonik dan biofilm C. albicans
dilakukan menggunakan gel diskontinyu
yang terdiri dari gel penumpuk (stacking gel)
dan gel pemisah (separating gel).
Elektroforesis untuk memisahkan ekstrak
protein planktonik dan biofilm
C. albicans
pada penelitian ini dilakukan pada tegangan
konstan 100V. Melalui SDS-PAGE ekstrak
protein baik planktonik maupun biofilm akan
terpisah menjadi pita-pita protein tergantung
pada berat molekulnya. Standar berat
molekul marker berada pada kisaran 4 kDa
sampai dengan 250 kDa. Komposisi marker
prestained meliputi: insulin, B chain (4 kDa),
aprotinin (6 kDa), lisosim (16 kDa),
myoglobin red (22 kDa), karbonat anhidrat
(36 kDa), alkohol dehidrogenase (50 kDa),
glutamat dehidrogenase (64 kDa), BSA (98
kDa), fosforilase (148 kDa), dan myosin (250
kDa). Tabel 5.1 memaparkan Rf dan berat
molekul masing-masing komponen marker.
Tabel 1.
Data hasil perhitungan Rf dan
berat molekul komponen marker
(SeeBlue®Plus2
Prestained
Standard)
Komponen
marker
Myosin
Fosforilase
BSA
Glutamat
dehidrogenase
Alkohol
dehidrogenase
Karbonat
anhidrat
Myoglobin red
Lisosim
Rf
0.015385
0.061538
0.123077
Berat
Molekul
(kDa)
250
148
98
0.215385
64
0.307692
50
0.661538
0.907692
1
36
22
16
Berdasarkan berat molekul dan jarak
migrasi (Rf) komponen marker yang tampak
sebagai pita-pita protein, dapat dibuat
persamaan regresi hubungan antara berat
molekul dan Rf, seperti pada Tabel 1.
Persamaaan regresi berat molekul marker
terhadap Rf adalah y = -75,22x + 87,97.
Gambar 1 merupakan kurva standar
hubungan antara berat molekul marker dan
Rf.
Gambar 1. Kurva standar hubungan antara berat molekul dan Rf protein marker
Berdasarkan persamaan regresi pada
Gambar 1 ditentukan berat molekul protein
dalam sampel, yang telah terfraksinasi berupa
dengan Rf tertentu. Gambar 2 merupakan
elektrogram hasil pemisahan ekstrak protein
ekstrasel planktonik (PEP), ekstrak protein
matrik biofilm (PMB), protein intrasel
biofilm (PIB), dan protein intrasel planktonik
(PIP) C. albicans serta enzim zymolyase.
B - 53
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
Gambar 2.
Elektroforegram protein planktonik dan biofilm C. albicans dengan metode SDSPAGE. Berturut-turut baris pertama hingga sembilan dari kiri ke kanan adalah:
marker prestained, protein intrasel planktonik I dan II (PIP II dan PIP I), protein
intrasel biofilm I dan II (PIB II dan PIB I), protein matrik biofilm (PMB), protein
ekstrasel planktonik (PEP), dan enzim zymolyase.
Keberadaan protein dalam protoplas
planktonik (PIP) maupun biofilm (PIB)
menunjukkan bahwa protein tersebut
merupakan protein intrasel, dengan asumsi
prosedur preparasi ekstrak protein planktonik
dan biofilm dapat melepas seluruh protein
dinding sel dan matrik biofilm C. albicans.
Dengan demikian pita-pita protein dari
pemisahan sampel protoplas planktonik dan
biofilm C. albicans yang diperoleh pada
penelitian ini merupakan pita protein intrasel
C. albicans. Namun apabila prosedur
preparasi ekstrak protein planktonik dan
biofilm kurang sempurna dalam melepas
seluruh protein dinding sel dan matrik
biofilm C. albicans, maka residu protoplas
tersebut dimungkinkan masih mengandung
komponen dinding sel dan matrik biofilm C.
albicans. Hal ini disebabkan dinding sel C.
albicans sangat kompak dan liat, terlebih lagi
matrik biofilm C. albicans. Berdasarkan
kekuatan dinding sel dan matrik ekstrasel
biofilm tersebut sehingga dinding sel dan
matrik ekstrasel biofilm sulit untuk dipecah
guna mendapatkan protein dinding sel dan
protein matrik biofilm C. albicans.
PIB merupakan sampel protoplas
biofilm yang mengandung protein intrasel
biofilm, sedangkan PIP merupakan protoplas
planktonik yang mengandung protein intrasel
planktonik. PMB merupakan sampel yang
mengandung protein matrik biofilm. PEP
merupakan sampel yang mengandung protein
ekstrasel planktonik. Pada Gambar 2, PIB II
dan PIP II merupakan sampel protoplas
biofilm dan protoplas planktonik yang
mengandung protein intrasel yang dianalisis
melalui SDS-PAGE tanpa melalui proses
pemisahan massa kental yang terdapat dalam
sampel melalui sentrifugasi. Sehingga sampel
yang dianalisis SDS-PAGE merupakan
sampel yang pekat. Sedangkan PIB I dan PIP
I merupakan sampel protoplas biofilm dan
protoplas sel planktonik yang merupakan
cairan bening, dari sampel yang sama dengan
terlebih
dahulu
disentrifugasi
untuk
menghilangkan massa kental. Penggunaan 2
jenis sampel yaitu PIP I dan PIP II maupun
PIB I dan PIB II bertujuan untuk
mendapatkan keseluruhan (total) pita protein
hasil pemisahan. Dimana salah satu sampel
menggunakan cairan supernatan hasil
sentrifugasi dan sampel yang lainnya
merupakan sampel induk. PMB merupakan
ekstrak protein matrik biofilm gabungan
antara isolat hasil perlakuan biofilm
B - 54
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
menggunakan β-merkaptoetanol dan isolat
hasil perlakuan biofilm menggunakan
zymolyase. PEP merupakan ekstrak protein
ekstrasel planktonik gabungan antara isolat
hasil perlakuan sel planktonik menggunakan
β-merkaptoetanol dan isolat hasil perlakuan
sel planktonik menggunakan zymolyase.
Enzim zymolyase juga dielektroforesis
sebagai kontrol untuk membedakan antara
pita protein sampel pita protein komponen
enzim. Dari hasil pemisahan sampel PIP,
PIB, PEP, dan PMB, maka protein terpisah
berdasarkan berat molekulnya yang tampak
sebagai pita-pita protein.
Sebagaimana pada Gambar 2,
tampak
adanya
pengganggu
dalam
elektroforesis sampel PIP II yang lebih besar
dibandingkan PIP I. Hal ini terlihat dimana
gel hasil SDS-PAGE dengan pewarnaan
Coomasie Briliant Blue tampak lebih pekat
dibanding sampel yang lain. Sampel PIP II
menunjukkan kekentalan yang sangat tinggi
karena mengandung polimer glukan dan
kitin. Polimer glukan dan kitin tersebut
merupakan hasil degradasi dan pembentukan
gel dari komponen dinding sel pada proses
preparasi
ekstrak
protein
ekstrasel
planktonik. Pembentukan gel dari polimer
glukan dan kitin yang terikut pada sampel
protoplas
planktonik,
mengakibatkan
kentalnya protoplas planktonik. Polimer
Tabel 2.
glukan dan kitin sebagai pengganggu dalam
proses elektroforesis dapat diselesaikan
melalui sentrifugasi sehingga kandungan
glukan dan kitin telah dipisahkan dan
hasilnya adalah sampel PIP I. Melalui
sentrifugasi, glukan dan kitin akan
mengendap sebagai pelet. Adapun pada
sampel PIB, keberadaan pengganggu yang
berasal polimer glukan dan kitin tidak
tampak. Hal ini disebabkan oleh proses
degradasi matrik biofilm yang tidak
sempurna, dikarenakan matrik biofilm lebih
kuat dan liat dibandingkan dinding sel.
Sehingga diperlukan perlakuan yang lebih
kuat dibanding perlakuan terhadap dinding
sel agar matrik biofilm dapat terurai lebih
sempurna.
Dari hasil SDS-PAGE tampak
beberapa pita protein yang menunjukkan
protein komponen masing-masing sampel
PIP, PIB, PMB, PEP dan enzim zymolyase.
Berdasarkan data Rf sampel yang
dimasukkan ke dalam persamaan regresi
berat molekul marker terhadap Rf yaitu y = 75,22x + 87,97, maka ditentukan estimasi
berat molekul komponen protein dalam
sampel PIP, PIB, PMB, dan PEB. Tabel 2
memaparkan komponen protein masingmasing sampel PIP, PIB, PMB, PEP dan
enzim zymolyase.
Data hasil perhitungan Rf dan berat molekul (BM) pita elektrogram sampel PIP, PIB,
PMB, PEP pada Gambar 2.
Rf
PIP II
PIP I
PIB II
PIB I
PEM
PEP
Zymolyase
0.046
-
-
84,4 kDa
-
-
-
-
0.153
76,4 kDa
76,4 kDa
76,4 kDa
76,4 kDa
-
-
-
0.230
70,6 kDa
70,6 kDa
70,6 kDa
70,6 kDa
-
-
-
0.246
-
-
-
69,5 kDa
-
-
-
0.276
-
-
-
67,1 kDa
-
-
-
0.307
64,8 kDa
64,8 kDa
64,8 kDa
64,8 kDa
-
-
64,8 kDa
0.338
-
-
-
62,5 kDa
-
-
-
0.423
56,1 kDa
56,1 kDa
56,1 kDa
56,1 kDa
-
-
-
0.476
52,1 kDa
52,1 kDa
52,1 kDa
52,1 kDa
-
-
-
0.538
47,4 kDa
-
-
-
-
-
-
0.553
46,3 kDa
-
-
-
-
-
-
0.630
40,5 kDa
40,5 kDa
-
-
-
-
-
B - 55
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
0.707
34,7 kDa
34,7 kDa
-
-
-
-
-
0.923
18,5 kDa
18,5 kDa
18,5 kDa
18,5 kDa
18,5 kDa
Berdasarkan data pada Tabel 2, tidak
Pembahasan
tampak pita protein hasil pemisahan ekstrak
Preparasi Ekstrak Protein Planktonik dan
protein ekstrasel planktonik (PEP) dan
Biofilm C. Albicans
ekstrak protein matrik biofilm (PMB). Hal ini
mengindikasikan bahwa dalam sampel PEP
Dinding sel C. albicans tersusun atas
dan PMB tidak mengandung protein ekstrasel
komplek protein (mannoprotein dan sejumlah
planktonik dan protein matrik biofilm C.
kecil protein lain) dengan polisakarida (βalbicans, atau pewarnaan menggunakan
1,3-glukan, β-1,6-glukan, kitin, mannan dan
Coomassie Briliant Blue yang kurang peka.
glycosyl phosphatidylinositol (GPI)) (Kuleta
Batas deteksi pewarnaan menggunakan
et al., 2009). Komponen penyusun dinding
Coomasie Briliant Blue adalah 0,1 µg untuk
sel ini membentuk asosiasi liat, berupa
sebuah pita protein.
lapisan bilayer yang diselimuti protein
Dari Tabel 2, dapat diketahui pitaeksternal. Komponen utama protein eksternal
pita protein sampel PIP dan PIB.
adalah protein glycosyl phosphatidylinositol
Keseluruhan pita protein sampel PIP meliputi
(GPI). Glukan memiliki ikatan yang sangat
pita yang menunjukkan berat molekul: 76,4;
kuat dan tidak larut dalam air. Kekuatan
70,6; 64,8; 56,1; 52,1; 47,4; 46,3; 40,5; 34,7;
struktur ini juga didukung oleh adanya
18,5 kDa. Sedangkan keseluruhan pita
jembatan disulfida (Klis et al., 2009).
protein sampel PIB meliputi pita yang
Struktur liat pada sel planktonik C.
menunjukkan berat molekul: 84,4; 76,4; 70,6;
albicans meningkat jauh lebih kuat pada
69,5; 67,1; 64,8; 62,5; 56,1; 52,1; 18,5 kDa.
bentuk biofilmnya. Hasil penelitian yang
Pita protein 64,8 kDa dan 18,5 kDa terdapat
dilakukan oleh Andes dan Nett (2006)
pada sampel protoplas planktonik dan
menyatakan bahwa kandungan β-1,3 glukan
protoplas biofilm serta enzim zymolyase.
pada
bentuk
biofilm
lebih
tinggi
Dengan demikian dimungkinkan pita tersebut
dibandingkan
bentuk
planktonik.
adalah pita protein komponen enzim
Berdasarkan analisis TEM ketebalan dinding
zymolyase yang terikut pada sampel PIP dan
sel bentuk biofilm dua kali lebih besar
PIB. Hal ini terjadi karena sampel yang
daripada bentuk planktonik. Ketebalan
dipisahkan dengan SDS-PAGE merupakan
dinding sel bentuk planktonik sekitar 120 nm,
sampel hasil perlakuan menggunakan enzim
sedangkan ketebalan dinding sel bentuk
zymolyase.
biofilm sekitar 260 nm. Bentuk planktonik
Pita protein intrasel planktonik C.
tersusun oleh sel khamir yang dilindungi oleh
albicans meliputi: 76,4; 70,6; 56,1; 52,1;
dinding sel, yang salah satu komponen
47,4; 46,3; 40,5; 34,7 kDa. Sedangkan
dindingnya adalah β-1,3 glukan. Sedangkan
keseluruhan pita protein intrasel biofilm
sel C. albicans dalam bentuk biofilm
C. albicans meliputi: 84,4; 76,4; 70,6; 69,5;
terlindungi oleh dinding sel maupun matrik
67,1; 62,5; 56,1; 52,1 kDa. Diantara pita
biofilm yang menyelimutinya.
protein yang diperoleh terdapat protein
Biofilm C. albicans tersusun atas
spesifik planktonik dan protein spesifik
berbagai morfologi sel C. albicans yang
biofilm C. albicans yang dipaparkan dalam
hidup
secara
bersama-sama
sebagai
Tabel 3.
komunitas, yang tertata dalam struktur tiga
Tabel 3.
Komposisi protein spesifik
dimensi. Komunitas ini, dibungkus oleh
planktonik dan protein spesifik
matrik ekstrasel yang tersusun atas
biofilm
C. albicans
polisakarida, protein dan komponen lain yang
dapat mengikatkan antar sel
C.
Protein
spesifik 47,4 kDa, 46,3 kDa,
albicans dan melekatkan agregat sel pada
planktonik
C. 40,5 kDa, 34,7 kDa
permukaan padatan. Bentuk biofilm lebih
albicans
kuat, rapat dan liat dibandingkan dengan
Protein
spesifik 84,4 kDa, 69,5 kDa,
bentuk planktonik, karena keberadaan matrik
biofilm C. albicans 67,1 kDa, 62,5 kDa
ekstraseluler pada bentuk biofilm (Rashki,
2009).
B - 56
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
Metode preparasi ekstrak planktonik
C. albicans mengacu pada penelitian yang
dilakukan oleh Chaffin dan Casanova (1991).
Metode preparasi ini bertujuan untuk
mengisolasi ekstrak protein ekstrasel
planktonik C. albicans. Ekstrak protein
planktonik C. albicans diperoleh melalui
gabungan metode ekstraksi kimia dan reaksi
enzimatik.
Karena kekuatan dinding sel dan
matrik biofilm C. albicans sebagaimana yang
telah diuraikan, maka pada penelitian ini
digunakan gabungan dua metode, yaitu
ekstraksi kimia dan reaksi enzimatik untuk
mendegradasi dinding sel dan matrik biofilm
C. albicans. Pada ekstraksi kimia digunakan
β-merkaptoetanol, sedangkan pada reaksi
enzimatik digunakan enzim zymolyase untuk
mendegradasi dinding sel dan matrik biofilm
C. albicans untuk memperoleh ekstrak
protein planktonik dan biofilm C. albicans.
β-merkaptoetanol merupakan denaturan
reversibel
yang
diharapkan
dapat
mendenaturasi sebagian protein dinding sel
dan matrik biofilm C. albicans, sehingga
sebagian protein terlepas. β-merkaptoetanol
juga memberi jalan bagi kinerja zymolyase
sebagai pendegradasi struktur dinding sel dan
matrik biofilm selanjutnya, sehingga kerja
enzim ini lebih optimal. Dengan demikian
degradasi dinding sel dan terutama matrik
biofilm yang sangat liat, dapat berlangsung
lebih baik untuk memperoleh ekstrak protein
planktonik dan biofilm
C. albicans.
Sehingga dalam hal ini, kinerja βmerkaptoetanol dan enzim zymolyase saling
mendukung untuk pelepasan protein matrik
maupun dinding sel. Setelah perlakuan
degradasi menggunakan β-merkaptoetanol,
tahap pencucian sangat penting, agar pelet sel
bebas dari β-merkaptoetanol, sehingga
zymolyase tidak terdenaturasi.
Mukherjee et al. (2008) melakukan
penelitian untuk mengidentifikasi protein
dinding sel biofilm dan protein matrik
biofilm C. albicans. Mula-mula dilakukan
isolasi matrik biofilm C. albicans melalui
lima tahapan yaitu sentrifugasi, perlakuan
menggunakan
EDTA,
ultrasonikasi,
kombinasi ultrasonikasi dengan metode
vortex, dan metode vortex. Supernatan yang
dihasilkan mengandung matrik biofilm
C. albicans. Pada isolasi dinding sel biofilm,
dinding sel diisolasi dari biofilm
C.
albicans,
selanjutnya
protein
yang
terkandung di dalamnya diperlakukan
menggunakan SDS untuk memisahkan
protein yang larut dan tidak larut. Selanjutnya
sel planktonik dan biofilm dihomogenkan
dengan menggunakan glass beads, dan
dilakukan
sentrifugasi
untuk
untuk
memisahkan material sitoplasma. Pelet yang
dihasilkan diperlakukan menggunakan TrisCl, SDS, EDTA dan β-merkaptoetanol dan
dilakukan sentrifugasi untuk memperoleh
supernatan yang mengandung dinding sel
biofilm C. albicans. Namun penelitian
tersebut tidak mengidentifikasi protein matrik
maupun dinding sel biofilm C. albicans yang
bersifat antigenik. Selain itu, dalam asosiasi
biofilm yang terbentuk tidak terdapat hifa,
yang merupakan salah satu komponen
penyusun biofilm yang berperan dalam
proses invasi. Biofilm merupakan asosiasi sel
C. albicans dalam berbagai morfologi yang
diselimuti oleh matrik ekstrasel. Jadi, biofilm
tersusun oleh sel-sel yang saling berikatan,
dan kemudian sel-sel yang saling berikatan
tersebut melekatkan pada suatu padatan
pendukung. Protein matrik biofilm adalah
kandungan protein di dalam matrik ekstrasel
biofilm. Sedangkan protein dinding sel
biofilm adalah protein penyusun dinding dari
suatu sel C. albicans yang menjadi
komponen asosiasi biofilm.
Kesempurnaan ekstraksi protein
penyusun dinding sel planktonik dan matrik
biofilm tergantung pada keterampilan dalam
perlakuan β-merkaptoetanol dan zymolyase.
Pada ekstraksi protein biofilm C. albicans,
dibutuhkan perlakuan
yang berbeda.
Pengocokan harus dilakukan lebih kuat
karena matrik biofilm lebih kompak
dibanding dinding sel.
Menurut Nett et al. (2007) biofilm
merupakan kumpulan sel yang terikat secara
kuat pada suatu permukaan dan menjadi
tertanam di dalam matrik dari polimer
ekstraseluler yang dihasilkan selnya. Pada
penelitian
ini
biofilm
C.
albicans
ditumbuhkan pada padatan pendukung
berupa membran filter selulosa nitrat diatas
media padat pertumbuhan biofilm. Sumber
nutrisi bagi pertumbuhan biofilm
C.
albicans diperoleh dari media pertumbuhan
SDA yang dipisahkan dari suspensi pelet C.
albicans oleh membran. Dengan demikian
dalam penelitian ini, adanya padatan
B - 57
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
pendukung berupa membran filter selulosa
nitrat menjadi sarana dalam pembentukan
biofilm. Disamping itu, pembentukan biofilm
juga dipicu oleh suatu kondisi yang minim
nutrisi. Dimana, di dalam suspensi pelet C.
albicans yang terletak di atas membran tidak
terdapat nutrisi. Untuk mendapatkan nutrisi,
maka pelet sel planktonik C. albicans harus
mengadakan perubahan bentuk agar dapat
menembus membran. Kondisi yang demikian
akan memicu terbentuknya hifa. Hal ini
terjadi karena sel khamir akan mulai
berkembang menjadi bentuk hifa yang dapat
menembus membran dan memperoleh nutrisi
dari media biofilm yang ada di bawah
membran. Kondisi minimum terjadi karena
suspensi khamir C. albicans yang diteteskan
pada membran merupakan suspensi C.
albicans dalam PBS. Dengan demikian sel
khamir akan berkembang menjadi hifa, yaitu
bentuk vegetatif yang mampu menembus
membran guna mendapatkan nutrisi.
Douglas dan Al-Fattani (2006),
melakukan penelitian untuk mengetahui
komposisi matrik biofilm dengan cara
mengisolasi dan menganalisis materi matrik
biofilm C. albicans. Dari penelitian tersebut
diketahui bahwa komposisi matrik biofilm
diantaranya adalah karbohidrat, glukosa,
protein, heksosamin, fosfor, dan asam uronat.
Mengacu pada metode penelitian
yang dilakukan oleh Douglas dan Al-Fattani
(2006), biofilm C. albicans matang dengan
pertumbuhan maksimal memerlukan waktu
inkubasi 48 jam. Dari hasil penelitian ini,
diperoleh hasil yang sama, dimana dalam
waktu inkubasi 48 jam, pertumbuhan biofilm
mencapai fase puncak. Setelah inkubasi
selama 48 jam biofilm yang dihasilkan
diamati
bentuk
pertumbuhannya
menggunakan SEM. Dari hasil pengamatan
menggunakan SEM dapat diketahui bahwa
biofilm C. albicans hasil inkubasi selama 48
jam mengandung berbagai bentuk morfologi.
Bentuk yang tampak pada penelitian ini
(Gambar 3) adalah bentuk khamir (sel bebas),
hifa, dan budding-yeast, yang dilingkupi
matrik ekstrasel. Hal ini menunjukkan bahwa
biofilm dapat tumbuh dengan baik pada
padatan membran filter selulosa nitrat dengan
lama waktu inkubasi 48 jam. Gambaran
biofilm C. albicans yang dihasilkan dari
penelitian ini dan dibandingkan dengan
penelitian lain (Douglas, 2002) ditunjukkan
dalam Gambar 3.
Penelitian ini lebih ditekankan pada
protein penyusun biofilm dan atau protein
yang berperan dalam pembentukan biofilm.
Hal ini dikarenakan biofilm merupakan
faktor patogenitas utama C. albicans. Biofilm
menjadi alat tipu daya bagi C. albicans
untuk terhindar dari respon inang.
(a)
(b)
Gambar biofilm C. albicans melalui pengamatan menggunakan SEM. (a).
Penampang melintang biofilm C. albicans. Sel khamir dan hifa tampak melekat
pada material matrik (Douglas, 2002). (b). Penampang biofilm yang dihasilkan
dari penelitian ini
dilapisi membran plasma, dan cairan
Dalam penelitian ini dilakukan
supernatan yang mengandung komponendigesti enzimatik menggunakan enzim
komponen
dinding
sel
yang
telah
zymolyase
yang
menyebabkan
terdegradasi. Menurut Gill et al. (2006)
terdegradasinya dinding sel planktonik C.
komponen dinding sel yang terlepas
albicans sehingga terbentuk protoplas. Proses
mengandung protein ekstraseluler dan
degradasi ini akan memisahkan antara
komponen dinding sel berupa komplek
protoplas sebagai pelet sel yang hanya
mannoprotein dan polisakarida (β-1,3Gambar 3.
B - 58
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
glukan, β-1,6-glukan, kitin, mannan dan
glycosyl
phosphatidylinositol
(GPI)).
Berdasarkan teori tersebut supernatan hasil
preparasi
ekstrak
protein
planktonik
mengandung sejumlah protein ekstrasel dan
komponen
dinding
sel
yang
telah
terdegradasi. Sedangkan pelet sel berupa
protoplas yang merupakan sel yang
diselimuti
oleh
membran
plasma,
mengandung protein penyusun membran
plasma dan sitoplasma. Membran plasma
mengandung protein membran plasma serta
ergosterol dan fosfolipid. Sedangkan
sitoplasma mengandung protein intrasel.
dalam menentukan protein spesifik biofilm
C. albicans, yang dapat dijadikan sebagai
kandidat biomarker kandidiasis.
DAFTAR PUSTAKA
Alvarado, M. R. 2008. Principles of Protein
Misfolding, vol. 84. Elsevier Scientific
Publishing Company. Minnesota
Chaffin, W. L. dan M. Cassanova. 1991. Cell
wall glycoprotein of Candida albicans as
released by different methods. Journal of
General Microbiology, 137: 1045-1051
Clack, S. Candidiasis and Dysbiosis in
children with Autistic Spectrum
Disorders. 2009. IHP. New York
Douglas, L. J. 2002. Medical importance of
biofilms in Candida infections. Rev
Iberoam Micol. Glasgow
Kuleta, J. K., M. R. Kozik dan A. Kozik.
2009. Fungi patogenic to humans:
molecular bases of virulence of Candida
albicans, Cryptococcus neoformans and
Aspergillus fumigates, vol.56: 211-224.
Acta Biochimica Polonica. Krakaw
Lakkawar, A., S. Chattopadhyay, R.
Somvanshi, dan A. Sikdar. 2003.
Experimental Candidiasis in Rabbit
Inoculated with a Fowl Isolat of Candida
Albicans – a Clinical and Pathological
Study. Slov Vet Res. India
Mravec, B. dan L. M. Epp. 2006. Chronic
polysistemic candidiasis as a possible
contributor to onset of idiopathic
Parkinson’s disease. Britisl Lek Listy.
Slovakia
Mitchell, A. P., M. L. Richard, C. L. Nabile,
dan V. M. Bruno. 2005. Candida albicans
Biofilm-Defective Mutants, vol. 4.
American Society for Microbiology. New
York
Mukherjee, P. K., S. Mohamed, J. Chandra,
D. Kuhn, S. Liu, R, Mitchell, D. Andes,
dan M. A, Ghannoum. 2008. Proteomic
and Pathway Mapping Analyses Reveal
Phase-Dependent Over-Expression of
Protein Associated with Carbohydrate
Metabolic Pathway in Candida albicans
Biofilm. The Open Proteomics Journal, 1:
5-26
Naglik, J. R., S. J. Challacombe, dan B.
Hube. 2003. Candida albicans Secreted
Aspartyl Proteinases in Virulence and
Patogenesis, vol. 67. American Society
for Microbiology. Berlin
Identifikasi Protein Antigenik Spesifik
Biofilm C. albicans
Ekstrak protein planktonik dan
biofilm C. albicans mengandung sejumlah
protein dengan berat molekul tertentu.
Protein-protein sel planktonik dan biofilm
C. albicans selanjutnya dipisahkan melalui
SDS-PAGE. Untuk penelitian selanjutnya,
hasil identifikasi protein spesifik biofilm C.
albicans dapat dijadikan sebagai target dalam
menentukan protein spesifik biofilm C.
albicans, yang dapat dijadikan sebagai
kandidat biomarker kandidiasis.
Pada penelitian ini diperoleh pita
protein sampel protoplas planktonik dan
biofilm C. albicans yang mengandung
protein intrasel planktonik dan biofilm
C. albicans. Keseluruhan pita protein intrasel
planktonik C. albicans meliputi: 76,4; 70,6;
56,1; 52,1; 47,4; 46,3; 40,3; 34,7 kDa.
Sedangkan keseluruhan pita protein intrasel
biofilm C. albicans meliputi: 84,5; 76,4;
70,6; 69,5; 67,1; 62,5; 56,1; 52,1 kDa.
Diantara pita protein yang diperoleh terdapat
protein spesifik planktonik dan protein
spesifik biofilm C. albicans. Protein spesifik
planktonik meliputi protein dengan berat
molekul 47,4 kDa, 46,3 kDa, 40,3 kDa, 34,7
kDa. Protein spesifik biofilm meliputi protein
dengan berat molekul 84,5 kDa, 69,5 kDa,
67,1 kDa, 62,5 kDa.
KESIMPULAN
Berdasarkan data penelitian dan analisisnya,
dapat disimpulkan bahwa terdapat protein
spesifik biofilm C. albicans, meliputi protein
dengan berat molekul 84,4; 69,5; 67,1; 62,5
kD. Hasil identifikasi protein spesifik biofilm
C. albicans dapat dijadikan sebagai target
B - 59
Prosiding Seminar Nasional Kimia, ISBN : 978-602-0951-00-3
Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Surabaya, 20 September 2014
Rashki, A. 2009. Transcriptional analysis of
the histone acetylation and deacetylation
in Candida albicans. Thesis, University of
Salamanca. Spanyol
Ribot, J. P., G. Ramage, K. V. Walle, dan B.
L. Wiskes. 2001. Characteristics of
biofilm formation by Candida albicans.
Rev Iberoam Micol. Texas
B - 60