Bab I Pendahuluan

Bab I
Pendahuluan
I.1 Deskripsi Topik dan Latar Belakang Penelitian
Selama ini informasi sejumlah unsur runut dalam jaringan mahluk hidup
dinyatakan dalam bentuk jumlah total unsur tersebut. Informasi ini tidak cukup
dan memungkinkan kesalahan interpretasi dalam menjelaskan proses penyerapan,
peranan, metabolisme, ketersediaan, akumulasi, defisiensi dan sifat toksisitas
suatu unsur. Ada kemungkinan suatu unsur dalam organisme hidup terdiri dari
beberapa spesi dengan sifat yang berbeda. Selain itu, evolusi suatu unsur runut
dalam suatu organisme hidup terjadi akibat interaksinya dengan lingkungan
pengkoordinasian yang sangat kompleks. Interaksi tersebut secara kimiawi dapat
digambarkan sebagai ion yang dikelilingi oleh pasangan elektron donor dari ligan
biologis. Contoh yang sangat populer adalah spesi Fe dalam hemoglobin, Co
dalam vitamin B12, Mg dalam klorofil, dan Zn dalam insulin.
Sekelompok logam lain seperti Cd, Hg, Pb dan metaloid As bersifat toksik.
Tingkat toksisitasnya sangat bergantung pada bentuk spesinya dan bukan hanya
berdasarkan jumlah totalnya. Misalnya, logam merkuri dalam bentuk metil
merkuri (Me2Hg) efek toksisitasnya jauh lebih besar dibandingkan dengan bentuk
kation Hg2+ (Cornelis dkk., 2003). Suatu sampel dengan jumlah total merkuri
sangat kecil dapat berefek sangat mematikan, sebaliknya pada sampel lain dapat
bersifat kurang toksik walaupun kadar totalnya lebih tinggi. Pada beberapa kasus,
evolusi unsur runut diikuti dengan sintesis ligan spesifik seperti metallotionein
(Lobinski dkk., 1998) atau pembentukan ikatan metalloid-karbon seperti dalam
kasus seleno asam amino atau senyawa organoarsen (Szpunar dan Lobinski,
2002).
Berdasarkan permasalahan di atas, pengetahuan tentang spesi unsur sangat
penting untuk lebih memahami proses transformasi kimia dan biokimia unsur,
peranan dan ketersediaannya serta untuk memperoleh informasi yang lebih
lengkap tentang esensial dan toksisitasnya.
Spesi kimia didefinisikan sebagai bentuk spesifik suatu unsur dengan struktur
molekular atau kompleks tertentu maupun isotop atau tingkat oksidasi tertentu
(Templeton dkk., 2000). Dengan demikian, spesiasi unsur merupakan distribusi
spesi kimia unsur tersebut dalam suatu sistem.
Elusidasi proses spesiasi memerlukan analisis spesiasi yang didefinisikan sebagai
aktivitas analitik yang mengidentifikasi dan mengukur suatu spesi. Analisis ini
meliputi juga proses pengambilan sampel (sampling), kuantifikasi, dan kontrol
kualitas metode analitik yang digunakan. Analisis ini dibedakan atas karakterisasi
secara operasional dan secara fungsional. Karakterisasi operasional menetapkan
prosedur karakterisasi spesi yang tergantung pada metode analitik yang dipilih,
dalam hal ini identitas spesi tidak dibahas, sedangkan karakterisasi fungsional
memberikan informasi tentang fungsi suatu spesi dalam proses biokimia (Caruso
dkk., 2003).
Analisis spesiasi dapat dilakukan dengan menggunakan metode langsung (direct
speciation methods) (Ortner, 2003) maupun dengan metode gabungan dan
kombinasi (combined and coupled techniques) (Needham dkk., 2005; Caruso dkk,
2003). Beberapa metode spesiasi langsung yang telah digunakan adalah metode
isotop, elektrokimia, difraksi dan absorpsi sinar-X, UV-Vis, Infra Red (IR) dan
Nuclear Magnetic Resonance (NMR). Metode gabungan dan kombinasi
menggabungkan dan mengkombinasikan dua atau lebih metode analisis untuk
elusidasi suatu spesi kimia. Spesi yang diinginkan terlebih dahulu dipisahkan
dengan menggunakan teknik pemisahan tertentu, kemudian dideteksi secara
selektif. Kombinasi teknik yang umum digunakan adalah kromatografi cair (liquid
chromatography, LC), elektroforesis kapiler (capillary electrophoresis, CE), dan
kromatografi gas (gas chromatography, GC) untuk proses pemisahan spesi serta
spektrometri serapan atom (atomic absorption spectrometry, AAS), inductively
coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP AES), inductively coupled
plasma mass spectrometry (ICP-MS) atau electrospray ionisation mass
spectrometry (ESI MS) untuk pendeteksian selektif unsur dan molekul. Metode
2
gabungan merupakan metode yang paling umum digunakan dalam analisis
spesiasi (Michalke, 2002; 2003b; Caruso dkk., 2003).
Seludang pembuluh (sieve tube) merupakan jalur transport jarak jauh nutrisi dan
sinyal antara organ sumber dan organ penyimpanan dalam tanaman. Komposisi
cairan floem yang ditransportasikan dalam unsur tapis (sieve element) sangat
kompleks dan merupakan spesi yang sangat spesifik (Kehr dkk., 1999). Dalam
unsur tapis, karbohidrat dan senyawaan nitrogen dipindahkan dari organ sumber
ke organ penimbunan seperti pada bagian pucuk pertumbuhan, kuncup, ujung
akar, dan jaringan penyimpanan. Pada tempat terjadinya pertumbuhan tersebut
dibutuhkan sejumlah mineral melalui floem. Hal ini dicapai melalui proses
transport dari xilem ke floem pada batang dan daun.
Beberapa hasil penelitian menunjukkan unsur-unsur nutrien minor seperti Mn dan
Zn ditransportasikan dalam bentuk kompleks khelat dengan senyawa organik
(Schmidke dan Stephan, 1995). Sayangnya pengetahuan tentang ligan tersebut
masih sangat terbatas. Cairan floem diketahui mengandung sejumlah komponen
pembentuk khelat seperti senyawaan asam organik, asam amino, maupun peptida,
namun belum ada yang teridentifikasi sebagai ligan transport kation tersebut.
Mullins dkk. (1986) telah membuat analisis komputasi berdasarkan konsentrasi
kation dan senyawa organik dalam cairan floem untuk menentukan ligan mana
yang sesuai untuk unsur hara tertentu. Penelitian ini sangat informatif namun
secara eksperimen sulit dilakukan. Hal ini disebabkan karena kesulitan
memperoleh sampel cairan floem dalam jumlah relatif besar untuk proses analisis,
konsentrasi unsur tersebut dalam cairan floem sangat kecil sehingga sulit untuk
mendeteksinya, dan tingginya kompleksitas matriks cairan floem.
Tanaman jarak (Ricinus communis L.) merupakan salah satu dari sejumlah kecil
tanaman model untuk penelitian cairan floem. Cairan floem dapat diperoleh dari
tanaman ini dalam jumlah volume yang relatif besar (Milburn, 1970), yaitu sekitar
20 – 80 µL/2 jam sampling/tanaman. Cairan floem dari tanaman ini juga telah
3
diteliti untuk menentukan spesi kimia mangan dan seng (Van Goor dan Wiersma,
1976), nikel dan kobalt (Wiersma dan Van Goor, 1979), konsentrasi ion kalsium
(Wiersum, 1979; Brauer dkk., 1998), ion Mg (Zhong dkk., 1993), translokasi
unsur Cu, Mn, Zn dan Fe (Stephan dkk., 1994; Schmidke dan Stephan, 1995),
karakteristik transport besi (Schmidke dkk., 1999) maupun identifikasi protein
pengikat besi (Krüger dkk., 2002). Beberapa penelitian ini dilakukan dengan
menggunakan kecambah tanaman jarak (Kallarackal dkk., 1989; Geigenberger
dkk., 1993; Sakuth, 1993; Zhong dkk., 1993; Stephan dkk., 1994; Schmidke dan
Stephan, 1995; Brauer dkk., 1998; Verscht dkk., 1998; Kalusche dkk., 1999;
Schmidke dkk., 1999; Schobert dkk., 2000; Krüger dkk., 2002) dan hanya sedikit
yang menggunakan tanaman jarak dewasa.
I.2
Masalah Penelitian
Diferensiasi dan distribusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo dan Cd dalam cairan floem
tanaman jarak belum terungkap sepenuhnya walaupun fungsi, peranan, defisiensi
dan toksisitasnya telah banyak dibahas. Hal ini disebabkan kompleksitas matriks
cairan floem yang menyulitkan analisis unsur-unsur runut tersebut. Selain itu, juga
disebabkan rendahnya kadar beberapa unsur runut yang membutuhkan teknik
analisis dengan kepekaan tinggi. Permasalahan lain adalah menjaga spesi agar
tidak terdekstruksi atau mengalami perubahan struktur molekul atau perubahan
bilangan oksidasi selama proses analisis. Dengan demikian pemilihan metode
analisis yang tepat dan optimasinya sangat diperlukan untuk elusidasi spesi kimia
unsur tersebut dalam cairan floem tanaman jarak.
Berdasarkan deskripsi di atas, permasalahan utama penelitian ini adalah:
Bagaimana mendiferensiasikan spesi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dengan
konsentrasi sampai orde pg/mL dalam cairan floem tanaman jarak?
Dalam penelitian ini, permasalahan difokuskan pada:
-
Metode apa yang tepat digunakan untuk memisahkan spesi Mg, Ca, Mn, Zn,
Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)?
4
-
Bagaimana kondisi optimal untuk memisahkan spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo,
dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)?
-
Bagaimana metode yang tepat untuk mendeteksi spesi tersebut yang
konsentrasinya dalam kisaran pg/mL – µg/mL?
-
Bagaimana distribusi berat molekul spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam
cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.)?
I.3
Asumsi-asumsi
Teknik Kromatografi eksklusi ukuran (Size Exclusion Chromatography, SEC) dan
Quantitative Preparative Native Continuous Polyacrylamide Gel Electrophoresis
(QPNC PAGE), merupakan suatu metode pemisahan spesiasi unsur yang telah
teruji handal dan banyak digunakan dalam analisis spesiasi. Pemisahan spesiasi
bidimensional dapat dilakukan dengan kedua teknik tersebut atau dengan
elektroforesis kapiler (Capillary Elektrophoresis, CE). Pemilihan metode
pemisahan bidimensional disesuaikan dengan karakter dan distribusi spesi pada
pemisahan sebelumnya.
Kandungan unsur-unsur dalam fraksi SEC dan PAGE dideteksi dengan
menggunakan ICP-MS. Metode deteksi unsur ini telah terbukti banyak digunakan
dalam analisis spesiasi multiunsur karena kemampuan analisis multiunsur pada
saat bersamaan, batas deteksi yang rendah hingga tingkat orde pg/mL, akurasi dan
presisi tinggi, instrument yang serba guna, serta dapat digunakan untuk analisis
hampir semua unsur dalam sistem periodik dan isotop unsur.
I.4
Hipotesis Penelitian
Berdasarkan permasalahan penelitian dan kajian pustaka yang dilakukan, maka
diajukan beberapa hipotesis sebagai berikut:
1.
Pemisahan tahap I unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem
tanaman jarak dapat dilakukan dengan menggunakan SEC dan QPNC
PAGE.
2.
Kondisi optimal untuk memisahkan spesi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan
Cd dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus communis L.) dapat
5
ditentukan dengan melakukan variasi buffer, komposisi buffer, pH, kolom,
dan parameter lain yang terkait dengan metode yang digunakan.
3.
Pemisahan spesi unsur yang diduga berikatan dengan protein/polipeptida
dapat dipisahkan dengan baik menggunakan teknik bidimensional SEC dan
QPNC PAGE.
4.
Pemisahan spesi unsur dengan berat molekul rendah dapat dipisahkan
dengan teknik bidimensional SEC dan CE.
5.
Pendeteksian unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam fraksi SEC dan
QPNC PAGE dapat dilakukan menggunakan ICP-MS hingga pada tingkat
orde pg/mL.
6.
Spesi dengan kelimpahan relatif kecil dengan berat molekul besar diduga
berikatan dengan protein/polipeptida.
I.5
Tujuan Penelitian
Berdasarkan permasalahan di atas, tujuan penelitian dirumuskan sebagai berikut:
1.
Menentukan metode analisis spesiasi yang tepat untuk analisis spesi nutrisi
utama Mg dan Ca, spesi kimia nutrisi minor Mn, Zn, dan Mo serta spesi
kimia logam berat (Cd) dalam cairan floem tanaman jarak (Ricinus
communis L.).
2.
Menentukan kondisi optimal pemisahan spesi unsur Mg, Ca, Mn, Zn, Mo,
dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak.
3.
Menentukan distribusi berat molekul spesi kimia unsur Mg, Ca, Mn, Zn,
Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak.
4.
Memisahkan lebih lanjut spesi kimia unsur Ca dan Mo dalam cairan floem
tanaman jarak.
Kontribusi ilmiah yang ingin dicapai dalam penelitian ini adalah mengetahui
diferensiasi dan distribusi spesi kimia unsur hara pokok Mg dan Ca, spesi kimia
unsur esensial runut Mn, Zn, dan Mo serta spesi kimia logam berat Cd dalam
cairan floem tanaman jarak. Diharapkan informasi tersebut dapat bermanfaat
untuk mengetahui mekanisme proses transformasi dan transport Mg, Ca, Mn, Zn,
Mo, dan Cd dalam cairan floem tanaman jarak.
6
I.6
Ruang Lingkup dan Batasan Penelitian
Masalah utama analisis spesiasi terutama spesiasi unsur runut dalam cairan floem
tanaman jarak dewasa adalah sulitnya memperoleh cairan floem dalam jumlah
besar, kompleksnya matriks sampel, dan kecilnya konsentrasi unsur tersebut. Oleh
karena itu diperlukan metode analisis yang tepat dan optimal untuk mengatasi
permasalahan ini.
Penelitian ini difokuskan pada analisis spesiasi operasional, yaitu karakterisasi
spesi yang tergantung pada metode analitik yang dipilih. Metode pemisahan
primer dilakukan dengan menggunakan SEC sedangkan pemisahan sekunder
menggunakan QPNC PAGE dan CE. Pendeteksian selektif unsur dilakukan
dengan menggunakan ICP-QMS.
I.7
Pelaksanaan Penelitian Secara Garis Besar
Pelaksanaan penelitian mulai dari tahap awal yaitu kultur tanaman sampai pada
tahap analisis di laboratorium dilakukan pada Institute of Chemistry and
Dynamics of the Geosphere: ICG-III Phytosphere, FZ-Jülich, Jerman pada kurun
waktu Oktober 2002 – September 2005.
Penelitian ini terdiri dari 6 tahap, meliputi:
(1) Kultur tanaman jarak
Kultur tanaman jarak dilakukan di dalam rumah kaca, dimana untuk satu periode
tanam berlangsung selama 7-8 pekan. Kultur tanaman dilakukan kontinyu pada
kurun waktu April 2003 – Juni 2005 karena kebutuhan sampel yang besar.
(2) Sampling cairan floem.
Sampling tanaman jarak yang juga dilakukan di dalam rumah kaca pada masa
transpirasi tanaman. Umumnya untuk sekali panen 30 – 40 tanaman berlangsung
sepekan. Cairan floem langsung dibekukan dalam tabung berisi nitrogen cair
(sekitar -80 °C) sebelum digunakan. Lama penyimpanan maksimal dalam tabung
tersebut umumnya 2-3 bulan tergantung kebutuhan.
7
(3) Penentuan kadar total unsur
Cairan floem tanaman jarak didestruksi dengan menggunakan metode microwave
tertutup untuk penentuan kadar total unsur dan kedapat-ulang unsur setelah proses
pemisahan SEC dan QPNC PAGE.
(4) Pemisahan
Pemisahan cairan floem tanaman jarak menggunakan berbagai metode pemisahan
seperti SEC, QPNC PAGE, dan CE. Pemisahan primer dilakukan dengan metode
SEC. Dua kolom SEC digunakan yaitu kolom sephadex G-25 M dan kolom
sephadex G-50 SF. Beberapa eluen diaplikasikan pada proses pemisahan ini, yaitu
Tris-HCl, MES, dan NaCl. Pemisahan sekunder dilakukan dengan metode QPNC
PAGE dan CE. Optimasi metode CE dilakukan cukup intensif dengan
menggunakan beberapa eluen, yaitu Tris-HCl, Na2HPO4/NaH2PO4/CTAB, dan
H3BO3/CTAB.
(5) Pendeteksian unsur
Pendeteksian selektif unsur setelah destruksi dan setelah proses pemisahan SEC
dan QPNC PAGE dilakukan dengan menggunakan metode ICP-QMS.
(6) Analisis dan interpretasi data penelitian.
Data hasil pemisahan dan analisis pendeteksian unsur ICP-QMS diolah dengan
menggunakan program Excel versi 2003 dan untuk memudahkan mengolah
puluhan ribu data hasil analisis dibuat program sederhana menggunakan program
Visual Basic for Application (VBA) versi 2003.
I.8
Sistematika Disertasi
Disertasi ini terdiri dari 5 bab dengan rincian sebagai berikut: Bab I merupakan
pendahuluan yang menguraikan deskripsi topik dan latar belakang penelitian,
masalah, tujuan, ruang lingkup dan batasan penelitian, pelaksanaan penelitian
secara garis besar dan sistematika disertasi. Bab II menguraikan kajian pusataka
yang berkaitan dengan penelitian ini. Bab III berisikan metodologi penelitian yang
8
digunakan untuk menyelesaikan permasalahan penelitian. Bab IV menyajikan
data hasil penelitian dan pembahasannya. Terakhir Bab V merumuskan
kesimpulan hasil penelitian dan saran-saran tindak lanjut penelitian ini.
I.9
Keaslian Penelitian
Berdasarkan studi literatur yang telah dilakukan, belum ada penelitian tentang
diferensiasi dan distribusi spesi Mg, Ca, Mn, Zn, Mo, dan Cd dalam cairan floem
tanaman jarak yang dilakukan secara komprehensif menggunakan metoda
pemisahan SEC, QPNC PAGE, dan CE dan metoda pendeteksian ICP QMS
hingga batas deteksi orde pg/mL serta pemisahan dua tahap spesi Mo dan spesi Ca
dengan menggunakan metoda-metoda tersebut di atas. Dengan demikian,
penelitian disertasi ini dapat dijamin keasliannya.
9