14_Stabilitas Enzim PAL_NF.Devy

EVALUASI STABILITAS ENZIM PAL PADA TIGA KONDISI
LINGKUNGAN YANG BERBEDA
(Evaluation of PAL Enzyme Stability on Three Different Environments)
Nirmala F. Devy1, Chaereni Martasari1 dan Karsinah2
BALAI PENELITIAN TANAMAN JERUK DAN BUAH SUBTROPIKA
2
BALAI PENELITIAN TANAMAN BUAH SOLOK
1
ABSTRAK
Lingkungan serta umur sangat mempengaruhi proses fisiologis pada suatu tanaman,
salah satunya adalah aktivitas enzim PAL (phenil alanin amonialiase). Menurut
Salisbury dan Ross (1992), enzim PAL merupakan katalisator dalam reaksi konversi
phenilalanin menjadi asam sinamik, dengan proses deaminasi pada siklus asam
sikimik. Siklus ini sangat penting pada tanaman karena produk akhirnya akan
dirubah menjadi protein, phytoaleksin, kaumarin, lignin, dan berbagai flavonoid
seperti anthosianin. Untuk melihat sampai sejauh mana lingkungan mempengaruhi
stabilitas enzim tersebut, maka penelitian 'Evaluasi stabilitas enzim PAL pada tiga
kondisi lingkungan yang berbeda' ini dilakukan. Penelitian dilaksanakan pada bulan
Januari sampai dengan Desember 2004 di Lolitjeruk Tlekung dan Balitbu Solok,
Sumbar. Tanaman yang digunakan adalah hasil sambungan antara batang bawah JC
dengan tanaman hasil perkawinan silang antara 2 (dua) kultivar Siam (Siam
Pekanbaru/SP, Siam Madu/SM,) dan 3 (tiga) kultivar Keprok (K. Dancy/KD, KCK,
dan K.51) serta 2 (dua) kultivar Pamelo (Pasaman/BP dan King/PK). Tanaman
sampel diperlakukan pada 3 kondisi lingkungan, yaitu normal (kontrol), kekeringan
dan genangan yang masing-masing dilakukan selama 1 minggu. Untuk mengukur
aktivitas enzim PAL, ekstrak didapat dari 1 g daun yang digerus dalam 10 ml buffer
Borat. Aktivitas enzim PAL yang berasal dari supernatant diukur dengan
menggunakan alat spektrofotometer dengan panjang gelombang λ= 290 nm. Dari
penelitian ini secara umum dihasilkan bahwa rata-rata nilai enzim PAL pada setiap
individu yang dicobakan adalah berbeda. Perlakuan kering maupun genangan pada
tanaman juga memberikan efek yang berbeda pada setiap sampel/asesi maupun
jenisnya. Pada jenis BP, SM, SP/KCK, dan SP/PK secara umum perlakuan kering
maupun genangan mendorong terjadinya peningkatan aktivitas enzim PAL
dibandingkan kontrol, dimana kenaikan aktivitas tersebut berkisar antara 1-37%
dan 2-62% pada masing-masing perlakuan pengeringan dan penggenangan.
Sedangkan jenis lainnya (PK, SP/K51, KD/SP, dan BP/SP) hanya perlakuan kering
yang dapat meningkatkan (2-21%) nilai tersebut, sedangkan perlakuan genangan
cenderung menurunkan (3-53%) aktivitasnya. Jika dilihat secara keseluruhan, maka
perlakuan pengeringan selama 1 minggu meningkatkan (13.6%) aktivitas enzim
PAL, sedangkan perlakuan genangan cenderung menurunkannya (3.8%)
dibandingkan dengan kontrol.
Kata kunci : Jeruk (Citrus sp.), enzim PAL (phenil alanin amonialiase),
kekeringan, genangan, spektrofotometer.
152
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
ABSTRACT
The environment and age would be influence on plant physiological processes, such
as PAL (phenil alanin amonialiase) enzyme activity. According to Salisbury and
Ross (1992), PAL enzyme is a catalyst on conversion of phenylalanine to cinnamic
acid by shikimic acid pathway. This pathway is very important because phenolics as
its product would be converted into several derivates besides protein, like
phytoalexins, caumarins, lignin and various flavonoids such as the anthocyanins.
The study of PAL enzyme stability on three different environments was done on
January - December 2004 at Cistrophres Tlekung and Balitbu Solok. Used plants
were hybrid of 2 Siam (Siam Pekanbaru/SP, Siam Madu/SM,) crossed into 3
mandarins (K. Dancy/KD, KCK, and K.51) and 2 cultivars of Pamelo (Pasaman/BP
and King/PK) that grafted on JC rootstock. Those plants were grown on 3 different
environments, i.e. normal/optima (control), one-week of drought and under
waterlogged conditions. Activity of PAL enzyme was done by measuring
spectrophotometric (λ= 290 nm) of extract sample supernatant. From this study,
generally it could be concluded that the average value of enzyme PAL activity and
effect raised from unfavorable environment on individual plant was different. The
BP, SM, SP/KCK, and SP/PK plants both on drought and waterlogged conditions
had higher number of enzyme activity (1-37% and 2-62%, respectively) than control
treatment. On the other hand, on drought condition, PK, SP/K51, KD/SP, and BP/SP
plants induced higher enzyme activity 2-21% but decreased 3-53% this activity on
waterlogged one. Overall, one-week drought condition treatment would induce
average of PAL enzyme activity up to 13.6% and waterlogged one decrease it up to
3.8% than control.
Keywords : Citrus (Citrus sp.), PAL (phenil alanin amonialiase) enzyme,
drought, waterlogged, spectrophotometer.
PENDAHULUAN
Perbaikan tanaman jeruk melalui hibridisasi tidak banyak diminati oleh
pemulia tanaman, karena menyebabkan perubahan besar sifat tanaman dan
memerlukan waktu relatif lama. Namun perkembangan teknik korelasi genetik dan
pembuatan mutan yang diintegrasikan ke dalam konsep pemuliaan konvensional
mampu mempercepat proses seleksi dan pembuatan keragaman genetik yang
diperlukan. Teknis korelasi genetik mampu menganalisis keterkaitan antara
aktifitas enzim tertentu pada tanaman dengan penampilan morfologi yang
disebabkannya, sehingga proses seleksi dapat dilakukan lebih dini pada fase awal
pertumbuhan. Keberhasilan penggunaan teknik mutasi dan hibridisasi sekarang
dapat dideteksi lebih dini melalui analisis enzim yang terkait dengan eksresi
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
153
morfologi tanaman dan analisis sitologinya. Enzim yang berkaitan dengan kualitas
buah seperti rasa manis, adalah sukrosa phospat sintetase (SPS), Invertase (Al), dan
sukrosa sintetase (SS) (Hubbart et al., 1989; Yamachi and Ishikawa, 1986;
Sugiharto et al., 1996). Tekstur buah dikendalikan oleh phenil alanin amonialiase
(PAL), sedangkan kadar asam oleh phenol. Warna buah terutama penampilan warna
merah terkait dengan aktivitas produk metabolit sekunder antosianin (Gianfagna
and Berkowitz, 1986 dan Andersen, 1987), sedangkan kriteria produktif oleh enzim
Esterase (Purnomo et al., 1996).
Dari hasil analisa enzim PAL yang dilakukan pada F1 hasil silangan antara 4
(empat) kultivar Siam (Siam Pekanbaru, Siam Madu, Siam Banjar, dan Siam
Bengkulu) dan 3 (tiga) kultivar Keprok (K. Dancy, KCK, dan K.51) serta 2 (dua)
kultivar Pamelo (Nambangan dan Pamelo) dihasilkan bahwa nilai enzim PAL pada
daun dalam setiap asesi berbeda (Devy et al., 2004), sehingga untuk memastikan
bahwa nilai enzim tsb akan stabil pada setiap kondisi, maka diperlukan studi
mengenai stabilitas enzim PAL jeruk pada kondisi yang berbeda, yaitu kondisi
optimal, tergenang dan kering.
Menurut Salisbury dan Ross (1992), enzim PAL merupakan katalisator dalam
reaksi konversi phenilalanin menjadi asam sinamik, dengan proses deaminasi pada
siklus asam sikimik. Siklus ini sangat penting pada tanaman karena produk
akhirnya akan dirubah menjadi protein, phytoaleksin, kaumarin, lignin, dan
berbagai flavonoid seperti anthosianin. Selain hal tersebut, enzim PAL juga sangat
penting dalam pembentukan komponen phenolik yang berperan pada pemulihan
luka yang terjadi pada tanaman. Ditambahkan pula, dalam siklusnya aktivitas
enzim PAL dalam tanaman sangat dipengaruhi oleh keadaan tanaman itu sendiri dan
lingkungan dimana tanaman tersebut berada. Pada tanaman yang telah tua,
kandungan ethyline yang meningkat akan meningkatkan pula aktivitasnya;
sedangkan lingkungan yang sangat berpengaruh adalah cahaya, stress air maupun
hama atau penyakit.
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat stabilitas
kandungan Enzim PAL pada tanaman jeruk dalam kondisi yang berbeda.
154
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
BAHAN DAN METODE
Penelitian akan dilaksanakan di nursery house Loka Penelitian Tanaman Jeruk
dan Hortikultura Subtropika dan Laboratorium Balitbu Solok, Sumbar mulai bulan
Januari sampai November 2004.
Bahan tanaman yang digunakan berasal dari benih F1 hasil persilangan antara
Siam Pekanbaru (SP) x Keprok Kacang (KCK); SP x K51; SP X K Dancy; SP X
Pamelo King (PK); KD X SP; S Madu (SM) X PK; Besar Pasaman (BP) X SP, dan
induk dari BP, PK, SM, SP, KCK, K51, serta KD masing-masing sejumlah 5-10 asesi
setiap hasil silangan, sedang induk diambil 1-2 tanaman. Tanaman-tanaman akan
diuji ulang enzim PAL nya pada beberapa kondisi tanaman, yaitu optimal, kering,
dan tergenang.
Prosedur Pelaksanaan
Tanaman F1 hasil silangan akan dikelompokkan menjadi 3, yaitu yang
mempunyai enzim PAL < 11; 11-20; > 20. Pada tanaman terpilih tersebut dijadikan
untuk induk dan disambungkan pada batang bawah JC yang berumur antara 8-10
bulan. Tanaman yang tumbuh akan dikelompokkan dan diperlakukan pada 3
lingkungan, yaitu lingkungan tumbuh yang optimal, kering, dan tergenang. Masingmasing perlakuan menggunakan unit perlakuan sebanyak 5 tanaman. Setelah 7 hari
perlakuan, aktivitas enzim PAL-nya dianalisa.
Analisa enzim PAL : Menimbang sampel 1 g daun jeruk segar, kemudian
dihaluskan dengan mortar dan diekstrak menggunakan 10 ml buffer Borat 0,1 M pH
3,8 + 20 mM Mercaptoethanol + polyclar AT (0,4 g/g daun). Larutan tersebut
disaring, supernatan disentrifugasi selama 30 menit, bagian yang jernih dipisahkan
dengan endapannya. Protein diendapkan dari supernatan dengan menggunakan
(NH 4) 2SO 4 jenuh, kemudian disentrifugasi selama 15 menit. Endapan tersebut
kemudian dilarutkan dalam 5 ml buffer Borat pH 8,8 dan 1 ml 60 µM phenil alanin,
diinkubasi pada suhu 35°C selama 1 jam. Aktivitas enzim PAL ditetapkan dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 290 nm. Aktivitas enzim PAL dinyatakan
dalan 1 unit aktivitas enzim PAL. Penilaian aktivitas PAL juga dilakukan terhadap
tanaman dewasa yaitu dari daun tanaman tetua.
Parameter pengamatan adalah : aktivitas enzim PAL pada daun tanaman setelah
perlakuan penggenangan/pengeringan.
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
155
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari hasil pelaksanaan analisa aktivitas enzim PAL pada daun tanaman sampel
secara keseluruhan, secara umum dihasilkan bahwa nilai enzim PAL pada setiap
individu yang dicobakan adalah berbeda. Demikian pula perlakuan kering maupun
genangan pada tanaman tersebut juga memberikan efek yang berbeda pada setiap
sampel/asesi maupun jenisnya (Tabel 1, Gambar 1).
Tabel 1. Rata-rata Nilai Enzim PAL Tanaman Jeruk pada 3 Keadaan Lingkungan.
(Average Value of Citrus PAL Enzyme on Three Different Environments)
ASESI
Perlakuan Lingkungan Tumbuh
SP/KCK 22.1
SP/KCK 22.2
SP/KCK 24.1
SP/KCK 56.9
SP/KCK 40.1
SP/KCK 55.2
SP/KCK 55.3
SP/KCK 55.6
SP/KCK 55.8
SP/KCK 55.15
Kontrol
16.46
18.20
16.94
17.54
17.68
13.10
9.04
9.70
14.12
12.80
Kering
18.16
17.76
17.74
15.58
18.42
12.78
17.66
15.40
18.66
9.70
Genangan
16.36
16.56
17.60
15.56
17.44
15.6
15.10
7.70
15.18
12.62
BNT 5%=1.42
14.56 a
16.18 b
14.97 a
18.50
10.72
16.36
15.58
15.40
14.32
18.58
18.98
16.66
17.82
12.96
19.12
12.62
13.56
13.62
10.40
11.78
16.24
15.14 b
17.35 c
13.03 a
15.64
8.68
11.4
16.52
1174
18.28
12.84
11.64
17.46
17.44
14.58
14.14
8.92
16.72
7.48
SP/K51 62.1
SP/K51 66.1
SP/K51 66.4
SP/K51 66.6
SP/K51 66.8
SP/KD 95.2
BNT 5%= 0.83
SP/BN 32.1
SP/BN 43.1
SP/BN 43.3
SP/BN 43.4
SP/BN 35.5
BNT 5%= 1.00
12.79 a
15.53 b
12.37 a
SP/PK 137.7
SP/PK 138.13
11.26
18.82
11.72
18.66
15.14
17.08
BNT 5%= 0.17
15.04 a
15.19 a
16.11 b
156
Rata-rata
16.99tn
17.50
17.42
16.22
17.84
13.82
13.93
10.93
15.98
11.70
16.56 tn
14.42
15.54
14.60
13.38
16.56
16.16 tn
11.89
10.65
16.90
12.22
12.70 tn
18.18
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
ASESI
Perlakuan Lingkungan Tumbuh
KD/SP 46.1
KD/SP 46.2
KD/SP 46.3
KD/SP 47.1
KD/SP 47.2
KD/SP 47.3
KD/SP 47.3
Kontrol
8.90
18.14
7.86
12.80
19.10
5.64
13.60
Kering
17.40
18.30
12.50
10.58
11.12
8.72
9.88
Genangan
7.22
14.60
6.24
7.67
8.90
12.76
11.52
BNT 5%= 0.31
12.29 b
12.64 c
9.84 a
9.66
10.64
13.04
18.60
17.74
12.58
16.82
5.98
16.78
9.80
10.48
16.44
12.94
17.60
16.50
12.98
16.60
14.60
17.82
13.42
10.74
6.16
7.60
9.42
10.88
13.74
10.82
6.92
13.34
12.68
BNT 5%= 0.31
13.16 a
14.94 b
10.23 a
Besar Pasaman
Pamelo King
Siam Madu
8.34 a
13.22 b
12.56 a
9.29 a
14.66 b
17.28 c
13.52 b
6.20 a
16.38 b
BP/SP 54.1
BP/SP 54.3
BP/SP 54.7
BP/SP 54.9
BP/SP 54.9
BP/SP 54.15
BP/SP 54.17
BP/SP 54.19
BP/SP 54.24
BP/SP 54.25
Rata-rata
11.17 tn
17.01
8.86
10.34
13.04
9.04
11.66
10.29 tn
11.08
11.19
15.20
15.04
13.10
14.74
9.16
15.98
11.96
10.38 tn
11.36
15.40
BNT 5%= 1.93
Keterangan : *)tn = tidak nyata pada uji BNT 5%
Di dalam satu kolom, angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama berarti tidak berbeda
nyata pada BNT 5%.
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
157
Nilai PAL
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Jenis jeruk
Besar Pasaman (BP)
Pamelo King (PK)
KD/SP
BP/SP
SP/BN
SP/K51
SP/KCK
Siem Madu (SM)
SP/PK
Gambar 1. Rata-rata Nilai Aktivitas Enzim PAL secara Umum pada 9 Jenis Tanaman Jeruk.
(Average Value of Generally PAL Enzyme Activity on Nine Types of Citrus)
Pada jenis BP, SM, SP/KCK, dan SP/PK secara umum perlakuan kering
maupun genangan mendorong terjadinya peningkatan aktivitas enzim PAL
dibandingkan kontrol, dimana kenaikan aktivitas tersebut berkisar antara 1-37%
dan 2-62% pada masing-masing perlakuan pengeringan dan penggenangan
Sedangkan jenis lainnya (PK, SP/K51, KD/SP, dan BP/SP) hanya perlakuan
kering yang dapat meningkatkan (2-21%) nilai tersebut, sedangkan perlakuan
genangan cenderung menurunkan (3-53%) aktivitasnya (Gambar 2).
158
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
20
Nilai PAL
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
BP
PK
SM
SP/KCK SP/K51
SP/BN
SP/PK
KD/SP
BP/SP
Jenis Tanaman
Kontrol
Kering
Genangan
Gambar 2. Rata-rata Nilai Aktivitas Enzim PAL pada 6 Jenis F1 serta 3 Jenis Induk Jeruk
Masing-masing Sesudah Perlakuan Kering, Genangan dan Optimal (Kontrol).
(Average Value of PAL Enzyme Activity on Six Types of F1 and Three Types of
Mother-plant, Each on After Treatment of Drought, Waterlogged and Optimal
(Control) Condition)
Namun demikian bila dilihat secara keseluruhan, walaupun secara analisa
statistika tidak nyata, perlakuan pengeringan selama 1 minggu dapat meningkatkan
aktivitas enzim PAL, sedangkan perlakuan genangan cenderung menurunkannya
dibandingkan dengan kontrol masing-masing sebanyak 13.6% dan 3.8% (Gambar
3).
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
159
14.78
15
14.5
14
13.5
13.01
13
12.51
12.5
12
11.5
11
Nilai PAL
Lingkungan tumbuh
Kontrol
Kering
Genangan
Gambar 3. Rata-rata Nilai Aktivitas Enzim PAL Secara Umum pada Tanaman Jeruk Masingmasing Sesudah Perlakuan Kering, Genangan dan Optimal (Kontrol).
(Average Value of Generally PAL Enzyme Activity on Citrus Plants Each on After
Treatment of Drought, Waterlogged and Optimal (Control) Condition)
Perlakuan kekeringan maupun genangan merupakan suatu signal yang secara
sistematik menyebabkan reaksi fisiologis dalam tanaman untuk mengurangi dampak
negatifnya. Menurut Salisbury dan Ross (1992), dalam siklusnya aktivitas enzim
PAL dalam tanaman sangat dipengaruhi oleh keadaan tanaman itu sendiri dan
lingkungan dimana tanaman tersebut berada. Pada tanaman yang telah tua,
kandungan ethyline yang meningkat akan meningkatkan pula aktivitasnya;
sedangkan lingkungan yang sangat berpengaruh adalah cahaya, stress air maupun
hama atau penyakit. Perlakuan pengeringan diduga merupakan signal lingkungan
yang menyebabkan aktivitas beberapa enzim meningkat, salah satunya adalah PAL.
Peningkatan aktivitas ini bertujuan untuk melindungi diri dari lingkungan yang
tidak menguntungkan. Hal ini sesuai dengan penelitian Smith-Becker et al. (1998),
dimana disimpulkan bahwa tanaman ketimun yang daunnya diinfeksi oleh
Pseudomonas syringae pv syringae menyebabkan meningkatnya aktivitas enzim
PAL pada tangkai daun yang terinfeksi dan pada batang yang terletak di atas daun
tersebut dan diikuti oleh peningkatan konsentrasi SA (salicylic acid) dan 4HBA (4hydroxybenzoid). Kedua senyawa tersebut terbentuk merupakan suatu respon dari
signal yang berasal perlakuan infeksi untuk melindungi tanaman. Meningkatnya
aktivitas PAL ini umumnya terjadi di jaringan vaskular yang diduga merupakan
jaringan prekursor untuk penumpukan lignin di xilem.
160
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
KESIMPULAN
Secara umum dari penelitian ini dihasilkan bahwa rata-rata nilai enzim PAL
pada setiap individu yang dicobakan adalah berbeda serta lingkungan yang tidak
optimal mendorong terjadinya perubahan nilai aktivitas enzim tersebut. Perlakuan
kering maupun genangan pada tanaman juga memberikan efek yang berbeda pada
setiap sampel/asesi maupun jenisnya. Pada jenis BP, SM, SP/KCK, dan SP/PK
secara umum perlakuan kering maupun genangan mendorong terjadinya
peningkatan aktivitas enzim PAL dibandingkan kontrol. Sedangkan pada jenis PK,
SP/K51, KD/SP, dan BP/SP hanya perlakuan kering yang dapat meningkatkan nilai
tersebut, sedangkan perlakuan genangan cenderung menurunkan aktivitasnya. Jika
dilihat secara keseluruhan, maka perlakuan pengeringan selama 1 minggu
meningkatkan 13.6% aktivitas enzim PAL, sedangkan perlakuan genangan
cenderung menurunkannya 3.8% dibandingkan dengan kontrol.
DAFTAR PUSTAKA
Devy, N.F. C. Martasari, D. Agisimanto, Hardiyanto, Karsinah dan Jati. 2003. Seleksi F1
Jeruk Berstekstur 'Renyah' Berdasarkan Aktivitas Enzim PAL. Laporan Akhir Penelitian
TA. 2003. Lolit Jeruk Tlekung (Tidak dipublikasikan)
Hubbart, N.L., S.C. Huber, and D.M. Pharr. 1989. Sucrose phosphate synthase and acid
invertase as determinants os sucrose concentration in developing musk - melon (Cucumis
melo L. ) fruits. Plant Physiol. 91 : 1527 -1534.
Purnomo, S., S. Handayani, dan S. Hosni. 1996. Penentuan kriteria dan seleksi kultivar
mangga produktif. Jurnal Hortikultura, 6 (4) : 325 - 334.
Salisbury, F.B. dan C.W. Ross. 1992. Plant Physiology (4th ed). Wadsworth Pub. Com.
Belmont, California. 682 pp.
Smith-Becker, J., E. Marios, E. J. Huguet, S.L. Midland, J.J. Sims and N.T. Keen. 1998.
Accumulation of salicylic acid and 4-hydroxybenzoic acid in phloem fluids of cucumber
during systemic acquired resistence is preceded by a trancient increase in phenylalanine
ammonia-lyase activity in petioles and stems. Plant Physiol. 116:231-238
Sugiharto, B., T. Handoyo dan Sumadi. 1996. Variasi dan korelasi enzim fotosintetik dan
enzim metabolisme sukrosa pada beberapa genotip tebu. Zuriat, 7 (2) : 76 - 84.
Yamachi, S., and Ishikawa, 1986. Roles of four sorbitol related enzymes and invertase in the
seasonal alteration of sugar metabolism in citrus leaf. J. Japan. Soc. Hort. Sci, 59 307 312.
Prosiding Seminar Nasional Jeruk Tropika Indonesia 2005
161