a. JUDUL Identifikasi Bakteri Selulolitik Dari Saluran Pencernaan

a. JUDUL
Identifikasi Bakteri Selulolitik Dari Saluran Pencernaan Rayap Lokal Indonesia.
b.PENDAHULUAN
Rayap dalam kategori taksonomi termasuk dalam Kelas Insekta (serangga).
Rayap (Glyptotermes montanus) memiliki kemampuan merusak kayu yang diketahui
mengandung banyak serat ,dikarenakan adanya kemampuan enzim yang dihasilkan oleh
mikroba termasuk flagellata (protista),yeast,dan bakteri yang berada dalam saluran
pencernaan rayap (Trisnawati P,dkk: 2003).Fakta yang dapat dijumpai dalam kehidupan
sehari-hari rayap merupakan serangga hama yang merugikan secara ekonomi karena
menimbulkan kerusakan pada bangunan, berbagai jenis kayu serta tanaman pertanian.
Menurut Haltric and Steiner (dalam Trisnawati P,dkk: 2003),sel tanaman mengandung
serat atau lignoselulosa yang mengandung selulosa ,hemiselulosa dan lignin.
Pada umumnya rayap yang menimbulkan kerugian tersebut merupakan rayap dari kasta
pekerja. Rayap kasta pekerja inilah yang dapat mencerna selulosa menjadi karbohidrat
rantai pendek sehingga dapat digunakan oleh rayap dari kasta yang lain. Kemampuan
rayap pekerja mendegradasi selulosa dimungkinkan oleh keberadaan bakteri
selulolitik,dan enzim-enzim lain dalam saluran pencernaannya dan bakteri ini bersifat
species spesifik artinya untuk setiap jenis rayap dapat dihuni oleh strain bakteri
selulolitik yang berbeda (Eutick et al., 1978; Mannesmann, 1972; Thayer, 1976)
Hubungan antara rayap dan bakteri selulotik ini bersifat simbiotik mutualistik. Dengan
demikian masing-masing organisme dalam asosiasi ini saling mendapatkan keuntungan
dari organisme lain dalam asosiasi tersebut (Atlas and Bartha,1998).
Isolasi enzim mikroba dari saluran pencernaan rayap telah dilakukan, antara lain
isolasi enzim lignoselulase, yang selanjutnya diproduksi secara komersial.Enzim
Komersial dapat dihasilkan oleh berbagai macam mikroorganisme tetapi memiliki
aktifitas protein spesifik yang rendah,misalnya yang dihasilkan oleh kapang
Trichoderma.sp. (Trisnawati.P,dkk.2003)
Adanya
kemampuan
sifat
enzimatik
tertentu
misalnya
kemampuan
lignoselulolitik,mikroorganisme tersebut dapat dimanfaatkan misalnya untuk membantu
menyederhanakan pakan berserat sehingga mudah diserap oleh ternak, membantu
pengomposan, membantu menyederhanakan bahan lignoselulolitik untuk upaya
pengolahan limbah, dan industry makanan.
1
Berdasarkan fakta –fakta penemuan tersebut diatas, maka ada beberapa hal penting
yang dapat diteliti yaitu pertama, masih diperlukan langkah isolasi bakteri utamanya
yang bersifat selulolitik, kedua melakukan screening atai memilih isolate bakteri yang
memiliki pertumbuhan yang baik.Hal inilah yang menjadi pokok permasalahan yang
harus dijawab dari penelitian ini.
c.METODE PENELITIAN
Penelitian ini merupakan jenis penelitian deskriptif-eksploratif, yaitu dengan
mengambil seluruh isolate bakteri dari saluran pencernaan rayap pekerja yang diisolasi
dengan media selektif Carboxymetyl Cellulosa (CMC).Isolat bakteri yang ditemukan
selanjutnya diidentifikasi karakter morfologi dan karakter biokimiawinya.
1.Prosedur penelitian :
a. Sterilisasi dan Pembuatan media
Media yang dibuat meliputi media agar RCM, media CMC padat,media CMC
cair. Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam pembuatan media ditimbang sesuai
kebutuhan selanjutnya dicampur dan disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada
suhu 121⁰C, tekanan 2 atm.
b. Pengambilan Spesies rayap
Spesies rayap yang digunakan adalah spesies rayap kasta pekerja yang hidup di
kayu dan tanah lokal Indonesia., dan dalam penelitian ini rayap diambil dari kayu jati
yang selanjutnya dikarakterisasi.
c. Sterilisasi permukaan rayap dan pemisahan saluran pencernaan :
Sterilisasi Rayap :Rayap dari kasta pekerja disterilisasi dengan alkohol 70%.
Untuk membuktikan sterilitas
permukaan rayap maka rayap diusapkan dan
digulungkan di atas medium agar Reinforced
Clostridial Medium (RCM) dan
diinkubasi pada 30oC selama 72 jam. Bila ada pertumbuhan berarti permukaan belum
steril maka harus dicari lagi cara untuk mensterilkan permukaan rayap.
Pemisahan saluran pencernaan rayap: Bila rayap sudah steril maka rayap disayat
untuk dikeluarkan saluran pencernaannya secara aseptik di dalam Laminar air-flow.
Saluran pencernaan dimasukkan dalam buffer Ringer selanjutnya dihomogenisasi.
d. Isolasi Bakteri :
Melakukan serial pengenceran terhadap suspensi saluran pencernaan.dengan 10
ml buffer Ringer .Mengambil 0,1 ml kemudian dikulturkan kedalam media selektif
CMC padat dengan metode Spread Plate dan diinkubasikan pada temperatur 30oC
2
selama 24-72 jam. Mengisolasi setiap koloni yang tumbuh kedalam dalam media CMC
miring sebagai biakan murni. Selanjutnya biakan murni ini dapat digunakan untuk
pengujian sifat morfologi koloni, morfologi sel, uji biokhemis dan pengukuran diameter
koloni dan uji pembentukan zona bening.
e. Karakterisasi fenotipik dan pengukuran pertumbuhan:
Karakterisasi fenotipik bakteri meliputi karakter morfologi koloni,morfologi
sel dan sifat biokhemis. Sifat biokimis meliputi uji katalase dan fermentasi karbohidrat
(glukosa, fruktosa, sukrosa), uji kemampuan menggunakan amilum ,tipe pertumbuhan
dan kebutuhan oksigen. Pengukuran pertumbuhan isolat terpilih selama inkubasi diukur
dengan Spectrofotometer. Pembuatan “Starter Culture”: Media CMC cair steril
sebanyak 100 ml diinokulasikan dengan 1 ose biakan murni isolate terpilih dan
diikubasikan dalam inkubator goyang. Selanjutnya dilakukan pengukuran pertumbuhan
sel pada setiap interval 6 jam selama waktu inkubasi 0-72 jam .
d. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1.Hasil Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat-isolat bakteri selulolitik dari saluran
pencernaan rayap lokal dan menemukan isolate yang memiliki daya selulolitik tinggi.
Daya selulolitik tinggi diindikasikan dengan diameter koloni Rayap lokal yang
dimaksud adalah rayap yang berasal/ditemukan di Indonesia. Rayap yang berhasil
diperoleh selanjutnya dikarakterisasi. Karakterisasi meliputi karakter perilaku membuat
sarang dan karakter morfologinya.
a.Karakterisasi rayap.
Rayap kasta pekerja ini memiliki ciri anatara lain ,memiliki mobilitas yang lebih
aktif disbanding rayap kasta yang lain. Ciri morfologi rayap pekerja ini kepalnya bulat
telur,tidak memiliki capit,pada kepala dilengkapi antenna yang bersegmen (15 segmen
dan berambut). Dan rayap ini tergolong dalam Familia Rhinotermitidae.
b. Hasil isolasi bakteri selulolitik yang tumbuh pada media selektif CMC diperoleh
beberapa isolat dengan ciri-ciri morfologi koloni, seperti tertuang dalam Tabel 1
berikut.
Tabel 1.Morfologi koloni isolate bakteri selulolitik dari saluran pencernaan rayap
pekerja
No. Kode
Konfigurasi/bentuk Warna koloni
Margin/tepi Elevasi
isolat
3
1
C3 I 1
Round,
with Kuning
Lobate
F Flat
FFF
Convex
scalloped margin
2
C3 I 2
Round, with
scalloped margin
Irreguler,
spreading
Round, with
scalloped margin
Irreguler,
spreading
Round, with
scalloped margin
Round
with,scalloped
margin
Round, with
scalloped margin
Round, with
scalloped margin
Round, with
scalloped margin
Round, with
scalloped margin
Round, with
scalloped margin
Round, with
scalloped margin
Kuning kehijauan
Lobate
3
C3 I 4
Putih susu
Irreguler
4
C3 I 6
Kuning
Lobate
Convex
5
C3 I7
Orange Muda
Lobate
Hilly
6
C3 I 8
Kuning
Lobate
Hilly
7
C3 I 9
Kuning kehijauan
Lobate
Flat
8
C3 I 10
Kuning
Lobate
Flat
9
C3 I11
Putih bening
Lobate
Convex
10
C3 I 12
Kuning kehijauan
Lobate
Flat
11
C3 I 13
Putih susu
Irreguler
Umbonate
12
C3 I 14
Kuning kehijauan
Lobate
Flat
13
C3 I 15
Kuning kehijauan
Lobate
Flat
14
C3 I 16
Round, with
scalloped margin
Kuning kehijauan
Lobate
Flat
15
C3 I 17
Round, with
scalloped margin
Kuning
Lobate
Flat
16
C3 I 18
Round
with,scalloped
margin
Putih susu
Lobate
Flat
17
C3 I 20
Filamentous
Kuning keputihan
Branching
Umbonate
18
C3 I 21
Round with
scalloped margin
Putih susu
Irreguler
Hilly
19
C3 I 22
Round with
scalloped margin
Bening
Lobate
Umbonate
20
C3 I 24
Round with
Kuning keputihan
Lobate
Hilly
4
Flat
scalloped margin
21
C3 I 25
Irreguler
and Putih susu
Lobate
Hilly
and Putih susu
Lobate
Flat
Irreguler
Flat
spreading
22
C3 I 26
Irreguler
spreading
23
C3 I 27
Round
with Putih susu
scalloped margin
Tabel 1. Menunjukkan bahwa dari 23 isolat yang berhasil diisolasi memiliki
morfologi koloni yang bervariasi.Koloni yang telah dikarakterisasi morfologinya
selanjutnya diukur diameternya.Untuk pengukuran diameter koloni dilakukan hingga
umur 7 hari inkubasi, karena pertumbuhan koloni sangat lambat,sedangkan untuk
pengecatan Gram dilakukan pada saat kultur berumur 24 jam.Diameter koloni, isolate
bakteri yang bersifat CMCase (selulolitik), disajikan pada Tabel 2. berikut
Tabel.2.Karakter morfologi sel, sifat Gram dan diameter koloni bakteri selulolitik
pada hari ke 7 inkubasi.
No.
Kode isolat
Bentuk sel
Sifat Gram
Φ koloni (mm)
Hari ke 7
1
C3 I 1
kokus
negatif
5,8
2
C3 I 2
kokus
negatif
5,7
3
C3 I 4
kokus
negatif
5,7
4
C3 I 6
kokus
negatif
6,2 *
5
C3 I 7
kokus
negatif
5,25
6
C3 I 8
kokus
negatif
5,5
7
C3 I 9
kokus
negatif
5,3
8
C3 I 10
kokus
negatif
5,7
9
C3 I 11
kokus
negatif
5,3
10
C3 I 12
kokus
negatif
4
11
C3 I 13
kokus
negatif
5,8
12
C3 I 14
kokus
negatif
4,5
5
13
C3 I 15
kokus
negatif
6,75*
14
C3 I 16
kokus
negatif
4,6
15
C3 I 17
baatng pendek
negatif
4,25
16
C3 I 18
batang pendek
negatif
4,4
17
C3 I 20
kokus
negatif
5,1
18
C3 I 21
batang pendek
negatif
5,4
19
C3 I 22
batang pendek
negatif
4,7
20
C3 I 24
kokus
negatif
4,8
21
C3 I 25
kokus
negatif
4,3
22
C3 I 26
kokus
negatif
4,75
23
C3 I 27
batang pendek
negatif
5,8
Tabel 2. diatas menunjukkan bahwa dari 23 isolat yang diperoleh juga memiliki
bentuk sel,serta diameter koloni yang bervariasi,namun seluruh isolat memiliki sifat
Gram yang sama yaitu Gram (-). Untuk keperluan praktis perlu dipilih koloni yang
memiliki pertumbuhan yang baik,yaitu yang memiliki diameter koloni paling besar.Dari
23 isolat yang diperoleh, dapat dipilih isolat yang memiliki ukuran diameter koloni
yang besar yaitu isolate C3I6 dengan diameter koloni 6,2 mm dan isolate C3I15 dengan
dameter 6,75mm. Karakterisasi biokimiawi atau karakter fenotipik selanjutnya hanya
dilakukan untuk 2 koloni terpilih tersebut.
Karakter biokimiawi meliputi uji katalase ,uji fermentasi karbohidrat (glukosa,
fruktosa,
sukrosa)
uji
hidrolisa
amilum,uji
penggunaan
asam
sitrat,
uji
motilitas,kemampuan memproduksi H2S.Karakter fenotipik dari 2 isolat bakteri terpilih
dapat disajikan didalam Tabel3. berikut.
Tabel 3. Hasil pengamatan karakter fenotipik isolat bakteri selulolitik terpilih
No. Karakter
Isolat bakteri terpilih
C3.I.6
MORFOLOGI KOLONI
Configuration (bentuk koloni)
1
Round
2
Round with Scallope Margin
3
Round with Raised Margin
4
Round with Radiating Margin
+
6
C3.I.15
+
-
5
Irreguler and spreading
6
Filamentous
Margins (Tepi koloni)
7
Smooth
8
Wavy
9
Lobate
10
Irreguler
11
Branching
Elevation (Permukaan koloni)
12
Flat
13
Raised
14
Convex
15
Umbonate
16
Hilly
Warna koloni
17
Putih
18
Kuning
19
Merah
Pertumbuhan pada media agar miring
20
Filiform
21
Echinulate
22
Beaded
23
Effuse
24
Arborescent
25
Rhizoid
PERTUMBUHAN PADA MEDIA CAIR
26
Uniform Fine Turbidity
27
Flocculant Growth
28
Pellicle
29
Sediment
Kebutuhan oksigen
30
Aerob
31
Anaerob
32
Anaerob fakultatif
MORFOLOGI SEL
Sifat Gram
33
Gram (+)
34
Gram (-)
Bentuk sel
35
Kokus
36
Batang pendek
37
Batang panjang
Rangkaian sel
38
Tunggal
39
Diplo
40
Rantai
41
Tetrad
-
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
7
+
-
+
-
+
-
+
+
+
+
+
-
+
-
+
-
+
-
42
Seperti anggur
UJI FISIOLOGIS (biokimiawi)
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
-
-
Fermentasi glukosa
Kuning (asam)
Kuning (asam)
Fermentasi Sukrosa
Kuning (asam)
Kuning (asam)
Fermentasi laktosa
Merah muda (basa) Kuning (asam)
Fermentasi galaktosa
Kuning (asam)
Kuning (asam)
Fermetasi maltosa
Kuning (asam)
Kuning (asam)
Hidrolisis amilum
Uji katalase
+
+
Uji Sitrat
Motilitas
Produksi H2S
Tabel 3.di atas menunjukkan bahwa kedua isolat terpilih memiliki banyak
kesamaan baik sifat morfologi koloni,morfologi sel,sifat dinding selnya dan sifat
fisiologisnya.Perbedaan hanya terlihat pada pertumbuhannya pada agar miring dan
permukaan koloninya.
Pemilihan isolate berdasarkan diameter koloni memerlukan konfirmasi lebih
lanjut yaitu dengan melihat profil pertumbuhan dari isolate tersebut selama masa
inkubasi 0 jam hingga 72 jam dengan interval waktu 6 jam. Pertumbuhan sel diukur
dengan Spectrofotometer yaitu dengan melihat kepadatan sel selama waktu
inkubasi.Pada pengukuran ini suspensi yang digunakan adalah pengenceran 10-¹ .Data
hasil
pengukuran
pertumbuhan
isolate
bakteri
selulolitik
terpilih
dengan
spectrophotometer berdasarkan Optical Density pada panjang gelombang (λ) 600 nm
disajikan pada Tabel 4. berikut.
Tabel 4. Pertumbuhan isolat bakteri selulolitik terpilih pada masa inkubasi 0-72 jam
Kode
isolat
C3I6
Σ
Rt2
C3I15
Σ
Rt2
0
0.08
0,07
0,15
0,08
0,05
0,09
0,14
0,07
6
0,19
0,75
0,94
0,47
0,68
0,29
0,97
0,49
12
0,19
0,21
0,40
0,20
0,57
0,54
1,11
0,56
Jumlah sel/ml (1x10¹)dengan interval inkubasi 6 jam
18
24
30
36
42
48
54
1,13 0,49 0,54 0,51 0,47 0,49 0,53
1,20 0,86 0,45 0,50 0,55 0,45 0,51
2,33 1,35 0,99 1,01 1,02 0,94 1,04
1,17 0,67 0,49 0,51 0,51 0,47 0,52
1,20 0,64 0,46 0,54 0,69 0,54 0,55
1,40 0,60 0,62 0,41 0,60 0,52 0,54
2,60 1,24 1,08 0,95 1,29 1,06 1,09
1,3
0,62 0,54 0,48 0,65 0,53 0,55
60
0,52
0,52
1,04
0,52
0,53
0,65
1,18
0,59
66
0,33
0,41
0,74
0,37
0,38
0,34
0,72
0,59
72
0,39
0,33
0,72
0,36
0,31
0,21
0,52
0,26
Jika dilihat data Tabel.4 di atas menunjukkan bawa pertumbuhan bakteri
selulolitik kedua isolate terpilih mengalami pertumbuhan yang menurun setelah
inkubasi 18 jam. Sedangkan pertumbuhan terbaik dicapai pada inkubasi 18 jam.
B.Pembahasan
8
Dari data-data diatas dapat dinyatakan bahwa hasil isolasi bakteri selulolitik
dengan menggunakan media selektif CMC dari pencernaan rayap pekerja diperoleh 23
isolat bakteri yang bersifat selullolitik,karena koloni ini mampu tumbuh pada media
selolusa. Data yang tertuang dalam Tabel.2 menunjukkan bahwa diameter koloni yang
juga menggambarkan pertumbuhan sel, nampak lambat
pertumbuhannya dalam
inkubasi sampai 7 hari. Hal ini dapat diartikan bahwa,masa inkubasi yang panjang
nampak tidak mendukung pertumbuhan koloni yang baik.Fakta ini kemungkinan dilatar
belakangi oleh ketersediaan substrat yang tidak cukup untuk mendukung pertumbuhan,
atau juga oleh faktor-faktor lain. Menurut hasil penelitian, bahwa produksi CMCase
tidak ditentukan oleh lama inkubasi (dalam Tresnawati P. et al,2003). Biasanya jika
diameter
koloninya
tinggi
juga
memiliki
daya
selulolitik
tinggi.Lambatnya
pertumbuhan ini dimungkinkan oleh sedikitnya sumber karbon tersedia yaitu glukosa
di dalam media sebagai hasil hidrolisis selulosa. Glukosa merupaka sejenis sumber
karbon yang paling mudah ditransfer kedalam sel dan mudahdimetabolisir.Daya
selulolitik suatu mikroba tergantung pada jenis mikrobanya yang selanjutnya akan
menentukan perbandingan komplek selulase.Hal ini didukung oleh suatu hasil
penelitian bahwa enzim ekstraseluler bakteri Cellulomonas CS1-17 lebih berperan
dalam penguraian selulosa amorf (Tresnawati P. et al,1995).Menurut Ramasamy dan
Verachert,1980 (dalamTresnawati P. et al,2003) enzim selobiase
atau
β-
glukosidase,umumnya bersifat ekstraseluler pada kapang bukan pada bakteri,dan enzim
ini
pada
bakteri
Pseudomonas.sp
disimpan
dalam
periplasma
dan
tidak
diekskresikan.Hal ini memperkuat dugaan bahwa lambatnya pertumbuhan koloni
bakteri tersebut lebih disebabkanoleh tidak adanya enzim selobise yang berakibat tidak
tersedianya substrat glukosa dilingkungannya.
Berdasar penelusuran terhadap karakter fenotipik 2 isolat terpilih yaitu isolat
C3I6 dan C3 I15 nampak bahwa sejumlah besar karakter, baik morfologi koloni,
morfologi sel, sifat dinding sel dan sifat biokhemisnya memiliki banyak kesamaan,
kecuali pada pada pertumbuhannya di media agar miring dan permukaan koloninya.
Pemanfaatan bakteri selulolitik untuk tujuan praktis dapat dilakukan misalnya
untuk tujuan pengomposan ,membantu dalam penyediaan pakan ternak sehingga lebih
mudah dicerna .Dalam aplikasinya ,lebih banyak digunakan isolat bakteri atau kapang
yang bersifat selulolitik secara langsung.
e.KESIMPULAN DAN SARAN
9
Kesimpulan :
Berdasarkan hasil dan pembahasan diperoleh kesimpulan sebagai berikut :
Hasil isolasi bakteri selulolitik dari pencernaan rayap yang hidup di pohon
nangka mati atau rayap local yang termasuk dalam Fam. Rhinotermidae, diperoleh 23
isolat bakteri selulolitik.Diantara 23 isolat yang ditemukan diperoleh 2 isolat yang
memiliki pertumbuhan yang baik yaitu isolate C3I6 dengan ф koloni 6,2 mm dan
isolate C3 I15 dengan ф koloni 6,75. Kedua isolate tersebut diketahui memiliki karakter
yang banyak kesamaannya, kecuali berbeda pada sifat pertumbuhannya di media agar
miring dan permukaan koloninya.Disamping itu juga menunjukkan bahwa pertumbuhan
paling baik dari kedua isolat tersebut dicapai pada inkubasi 18 jam.
Saran & rekomendasi:
Beberapa saran yang dapat disampaikan antara lain,perlunya dilakukan optimasi
pertumbuhan pada kisaran suhu dan pH dan faktor-faktor eksternal lain yang
berpengaruh terhadap produksi CMCase.Perlunya dilakukan karakterisasi lebih lanjut
tentang sifat genetiknya.Aplikasi bakteri selulolitik seyogyanya dilakukan bersama
kapang selulolitik agar dapat diperoleh hasil pemecahan substrat yang optimal.Perlu
dilakukan penelitian lanjut dari lingkungan hidup rayap yang kemungkinan juga
terdapat mikroorganisme selulolitik.
f.DAFTAR PUSTAKA
Aaronson, S. 1970. Experimental Microbial Ecology. Academic Press, New York.
Atlas, R.M. and Bartha, R. 1998. Microbial Ecology, Fundamental and Application.
Benjamin/ Cummings Science Publishing 2725 Sand Hill Road, Menlo
Park,California
Eutick, M.I., O’Brien, R.W. and Slaytor,M. 1978. Bacteria from the gut of Australian
termites. Appll. and Environ. Microbiol. 35 (5) : 823-828.
Fahn, A. 1985. Plant anatomy. 3rd ed. Great Britain. Pergamon Press
Kabirun. 1990. Biodegradasi limbah berselulosa: kursus singkat ekologi mikrobia.
PAU Bioteknologi UGM. Yogyakarta
Lehninger, A. 1983. Dasar-dasar Biokimia. Penerbit Erlangga. Jakarta
Lynd L.R., J.W. Paul, H.V.Willem, and S.P. Isak. 2002. Microbial cellulase utilization
Fundamental & Biotech. Microbial and Mol. Biology. 66(3): 506-577
Tresnawati,P.,P.A.Marbuna.,A.P.Sinurat.2003.Perbandingan Aktivitas Enzim Selulase
10
dari Bakteri dan Kapang.Indonesian Journal of Agricultural Science.IPB.
Tresnawati,P.,P,P.Ketaren,A.P Sinurat.,Irawan Sutikno.2003. Identification and
Evaluation of Fiber Hydrolitik Enzymes in The Exctract of Termites
(Glyptotermes montanus) For Poulktry Feed Application. Indonesian Journal of
Agricultural Science.IPB Bogor.
11