TEORI DASAR Penetapan kadar obat dalam plasma adalah salah satu bagian dari pemantauan kadar obat didalam darah. Teknik ini biasa digunakan klinisi untuk mengoptimalkan dosis obat dengan memberikan dosis yang ditetapkan berdasarkan konsentrasi target dengan cara mengukur kadar obat dalam darah dan bila perlu melakukan penyesuaian dosis. Pemantauan kadar obat dalam darah ini bertujuan untuk membantu meningkatkan penggunaan obat yang lebih rasional baik keamanan dan efektifitas dosis pada individu penderita (Chamberlain,2014). Penelitian farmakokinetik melibatkan penentuan kadar obat dalam sampel biologis. Metode analisi yang digunakan untuk penentuan kuantitatif kadar obat dalam suatu sampel biologis merupakan hal yang sangat penting dalam evaluasi dan interpretasi data farmakokinetika. Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar dalam tubuh untuk penelitian farmakokinetik, sebagai contoh darah, urin, feses, saliva, jaringan tubuh, cairan blister, cairan spinal dan cairan sinovial. (Chamberlain,2014) Daftar Sampel Biologis Bergantung pada Fluiditasnya dalam Kaitanya dengan Tingkat Kemudahan Analisisnya (Chamberlain,2014) Tingkat Fluiditas Jenis Sampel Biologis Cairan - Cairan serebrospinal - Air mata. - Keringat - Ludah - Urin - Empedu Campuran - Plasma - Serum - Darah - Feses Padatan - Otak - Jantung, Ginjal dan Hepar - Paru, Otot - Tulang 1. Darah Pengukuran konsentrasi obat dalam darah, serum, atau plasma merupakan pendekatan paling baik untuk memperoleh profil farmakokinetik obat didalam tubuh (Shargel, Wu Pong & Yu, 2015). Plasma adalah suatu cairan kompleks yang berfungsi sebagai media transportasi untuk zat-zat yang diangkut dalam darah. Konstituen plasma antara lain air, elektrolit, nutrien, zat sisa, gas, hormon, dan protein plasma (Ganong, 2009). Plasma diperoleh dari supernatan darah yang telah ditambah antikoagulan kemudian disentrifugasi (Shargel, Wu Pong & Yu, 2015). Prinsip kerja dari sentrifugasi yaitu objek diputar secara horizontal. Pada saat objek diputar, partikel-partikel yang ada akan berpisah sesuai berat jenis masingmasing partikel. Gaya yang berperan dalam sentrifugasi ini adalah gaya sentrifugal. Setelah dilakukan sentrifugasi, spesimen terpisah menjadi dua bagian yaitu pellet yang berada di bagian bawah berupa endapan yang memiliki bobot jenis yang lebih besar dan supernatan yang berada pada bagian atas dengan warna yang lebih jernih yang memiliki bobot jenis yang lebih kecil. Pellet berupa plasma sedangkan supernatan adalah serum. Serum adalah bagian cairan darah, tanpa faktor pembekuan atau sel darah. Sedangkan plasma adalah cairan darah sebelum darah membeku yang mengandung unsur pembekuan darah (Bernasconi G. 2016). Penentuan kadar suatu obat dalam plasma merupakan hal yang kompleks disebabkan plasma merupakan suatu matriks yang kompleks. Perlakuan awal terhadap sampel meliputi isolasi obat yang akan ditentukan dari sampel matriks biologis harus dilakukan. Preparasi sampel plasma agar dapat memisahkan atau mengisolasi obat diupayakan menggunakan prosedur seminimal mungkin untuk menghindari kehilangan obat yang akan ditentukan didalam plasma. Semakin panjang tahapan prosedur untuk preparasi sampel plasma hingga proses memisahkan atau mengisolasi obat maka semakin besar kemungkinan hilangnya obat yang akan ditentukan ( Hendra Adijuwana. 2011). Beberapa cara preparasi sampel untuk penetapan kadar obat dalam plasma (Evans, 2010), yakni : a. Pengendapan Protein Plasma Contoh zat pengendap protein: asam tungsat, amonium sulfat, tricloro acetic acid (TCA), asam perklorat, ZnSO4, metanol, dan asetonitril. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat protein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektriik, yakni pH dimana jumlah obat total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga protein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga protein mengendap. Selain itu, terdapat juga beberapa sifat lain yang berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Larutan (NH4)2SO4 merupakan garam dengan konsentrasi tinggi. Mekanisme (NH4)2SO4 sebagai anti presipitasi protein dikenal sebagai salting out, yakni penurunan kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi garam. Hal ini terjadi karena interaksi antara air dengan gugus polar dari protein menurun. Kelarutan protein akan berkurang bila terdapat garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi mengakibatkan pengendapan protein tersebut. Sifat ini terjadi karena kemampuan ion garam untuk terhidrasi dan terjadi kompetisi antara garam dengan molekul protein untuk mengikat air. Mekanisme ZnSO4 – NaOH sebagai agen presipitasi adalah NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang berasal dari logam berat yakni Zn2+ membentuk logam protein yang tidak larut. Logam berat juga akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ikatan dari ion logam bermuatan positif akan menurunkan kelarutan protein. Ion logam akan berkompetisi dengan proton-proton pada larutan untuk berikatan dengan asam amino. Semakin kuat ikatan ion-ion logam untuk menggantikan ikatan oleh proton-proton akan menurunkan pH larutan. Kombinasi dari perubahan pI, penurunan pH (baik akibat ion logam maupun NaOH) akan menyebabkan protein mengendap. Penambahan larutan organik seperti metanol dan asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurrunkan KD (Konestanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air disekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. a. Ekstaksi Padat-Cair (Solid-Phase Extraction) Ekstaksi padat-cair menggunakan catridge khusus untuk memisahkan obat dari sampel dengan volume relatif lebih kecil (0,5-1mL) yang tersedia secara komersial dengan harga yang cukup mahal (Khopkar, 2010). b. Ekstraksi Cair-Cair Ekstraksi cair-cair merupaka suatu metode yang paling banyak digunakan karena relatif cepat, simpel, dan murah dibandingkan dengan ekstraksi padat-cair. Ekstraksi ini menggunakan pelarut pengekstraksi diikuti proses pemekatan obat yang akan dianalisis. Pemilihan pelarut pengekstraksi dalam ekstraksi cair-cair harus didasarkan pada sifat fitokimia obat maupun metabolit yang akan diisolasi (Khopkar, 2010). Berbagai faktor dapat menjadi pertimbangan dalam seleksi pelarut yang akan digunakan antara lain : Tidak bercampur dengan air Mempunyai kemampuan melarutkan obat yang diinginkan dalam jumlah yang besar sehingga memberikan nilai recovery yang besar Mempunyai titik didih yang relatif rendah sehingga waktu evaporasi pelarut relatif lebih singkat Sedapat mungkin volume yang digunakan untuk ekstraksi adalah minimal sehingga akan menekan biaya yang dikeluarkan Jika memungkinkan gunakan pelarut dengan berat jenis yang lebih kecil dari berat jenis air sehingga proses pemisahan pelarut organik akan lebih mudah karena pelarut organik akan berada pada lapisan atas 2. Urin Urin, berbeda dengan plasma atau serum, biasanya bebas dari protein atau lemak sehingga bisa diekstraksi langsung dengan pelarut organic. Meskipun begitu, urin memiliki banyak variasi komposisi dan sangat tergantung pada jenis makanan yang dikonsumsi. Normalnya senyawa yang ditemukan dalam urin adalah larut air, sedangkan sebagian besar obat larut lipid sehingga dapat diekstraksi dengan pelarut yang cocok. Kesulitan dalam pengumpulan sampel urin adalah volume urin yang benar yang diproduksi selama interval waktu sampling, bukan pada penetapan kadarnya. Jumlah analit diperoleh dengan mengalikan volume dan konsentrasinya. Sampel urin juga sering memberikan hasil negative palsu misalnya pada pemeriksaan kreatinin. Urin juga memiliki variasi pH yang lebar, dipengaruhi oleh konsumsi makanan atau obat-obatan. Penggunaan antasida misalnya, kemungkinan bisa menyebabkan urin menjadi basa. Asam kuat tidak besar pengaruhnya, pH urin normal berkisar 5,5-7.( Katzung.2011). 3. Feses Penanganan sampel feses cukup rumit, mengingat bentuknya semi padat dan juga berupa campuran sisa-sisa proses pencernaan maupun senyawa-senyawa sisa proses metabolisme tubuh. Harus dipikirkan pengambilan cuplikan yang tepat dan juga jenis pelarut yang cocok karena banyaknya senyawa yang terkandung, apalagi jika kadar analit dalam sampel kecil ( Katzung.2011). 4. Sampel biologis lain Sampel biologis yang lain bisa berupa air susu, cairan serebrospinal, empedu, ludah dan lain-lain, masing-masing memiliki kekhasan sifat dan kandungan senyawa yang berbeda. Kelarutan obat dalam tiap larutan juga berbeda sehingga pemilihan pelarut harus dilakukan secara cermat ( Katzung.2011). DAFTAR PUSTAKA Bernasconi G. 2016. Teknologi Kimia . Jakarta: Pradya Paramita Chamberlain, J., 2014. The Analysis of Drugs in Biological Fluids 2 nd Ed. New York : CRC Press. Evans, G. 2010. A Handbook of Bioanaysis and Drug Metabolism. USA : CRC Press. Ganong, W. F. 2009. Buku Ajar Fisiologi Kedokteran. Edisi 22. Jakarta: EGC. Hendra Adijuwana. 2011. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB Press Katzung.Bertram, G. 2011. farmakologi dasar dan klinik, edisi 10. Jakarta: pustaka buku kedokteran Khopkar.S.M. 2010. Konsep dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI Press. Shargel, Leon., Susanna Wu-Pong, Andrew B. C. Yu. 2015. Biofarmasetika dan Farmakokinetika Terapan, Edisi V, terjemahan Fasich dan Budi Suprapti. Surabaya : Airlangga University Press.