BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama 6 bulan yaitu pada bulan Januari 2019 sampai Juni 2019. Pengerjaan sampel dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana, Jalan P.B. Sudirman, Denpasar sehingga diperoleh data tentang daya hambat perasan buah mengkudu terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella typhi. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari buah mengkudu, bakteri S. typhi, media Salmonella Shigella Agar, media Mueller Hinton Agar, Standar Mc Farland 0,5%, aquades steril, NaCl fisiologis 0,85%, aluminium foil, chloramphenicol, cakram disk kosong, lidi kapas steril. 3.2.2 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pisau, lampu spritus/bunsen, botol vial, pipet ukur merek Pyrex 10 ml, mikropipet merek Iso Lab volume 1000 µl, blue tips, ose bulat, tabung reaksi merek Pyrex volume 10 ml, rak tabung reaksi, pinset steril, inkubator merek LW Scientific, jangka sorong, autoclave, kertas saring, parutan, gelas ukur, termometer air, plate steril, stopwach. 3.3 Rancangan Penelitian 18 19 Dalam penelitian “Daya hambat perasan buah mengkudu (Morinda citrifolia L.) terhadap pertumbuhan bakteri Salmonella typhi”, jenis penelitian yang digunakan yaitu true–experiment. Jenis rancangan yang digunakan peneliti yaitu posttest dengan kelompok kontrol (Posttest Only Control Grup Design). Bentuk rancangan penelitian ini adalah : K+ O1 K- O2 P1 O3 P2 O4 P3 O5 P4 O6 P5 O7 P RS S Gambar 3.1 Rancangan Penelitian Keterangan : P : Populasi S : Sampel RS : Random Sampling RA : Random Alokasi K+ : Kontrol positif (cakram disk yang mengandung antibiotik chloramphenicol). K: Kontrol negatif (cakram disk yang mengandung aquadest). P1 : Perlakuan 1 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu 20%). P2 : Perlakuan 2 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu 40%). P3 : Perlakuan 3 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu 60%). P4 : Perlakuan 4 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu 20 P5 O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7 80%). : Perlakuan 5 (cakram disk yang mengandung perasan buah mengkudu 100%). : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada K+ : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada K: Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P1 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P2 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P3 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P4 : Zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada P5 3.4 Populasi, Sampel, dan Jumlah Sampel 3.4.1 Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah biakan murni bakteri S. typhi pada media Salmonella Shigella Agar. 3.4.2 Sampel Sampel dalam penelitian ini adalah hasil biakan murni bakteri S. typhi pada media Salmonella Shigella Agar yang diukur zona hambatnya pada media Mueller Hinton Agar. 3.4.3 Jumlah Unit Penelitian Jumlah unit penelitian dalam penelitian ini sebanyak tujuh unit yaitu bakteri S. typhi yang akan diberikan perlakuan meliputi konsentrasi perasan buah mengkudu 20%, 40%, 60%, 80%, 100% ditambah dengan satu kontrol positif dan satu kontrol negatif. Konsentrasi tersebut dipilih berdasarkan penelitian yang menunjukkan bahwa konsentrasi efektif dalam menghambat pertumbuhan bakteri Flavobacterium dan Enterobacter yakni 30% dan 35% (Maliana dkk., 2013). Oleh sebab itu, untuk mengetahui daya hambat perasan buah mengkudu terhadap pertumbuhan bakteri S. typhi, peneliti menggunakan konsentrasi yang lebih rendah 21 dari 30% sampai dengan konsentrasi diatas 35%, sehingga konsentrasi yang digunakan adalah 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%. Penggunaan chloramphenicol sebagai kontrol positif disebabkan karena chloramphenicol merupakan senyawa antimikroba berspektrum luas yang dapat digunakan untuk bakteri gram negatif. Chloramphenicol bekerja dengan menghambat sintesis protein bakteri, yang dihambat adalah enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator untuk membentuk ikatan-ikatan peptida pada proses sintesis protein pada bakteri (Brooks, 2005). Untuk mendapatkan hasil penelitian yang valid maka perlu dilakukan pengulangan guna mendapat jumlah unit penelitian yang valid. Jumlah pengulangan ditentukan dengan rumus Federer (1963) sebagai berikut : (t-1)(r-1) ≥ 15 Keterangan : r = banyaknya pengulangan t = jumlah perlakuan Karena jumlah perlakuan adalah tujuh, maka jumlah pengulangan sebagai berikut : (7-1)(r-1) ≥ 15 6(r-1) ≥ 15 6r ≥ 15 + 6 r ≥ 3,5 Berdasarkan rumus diatas, diperoleh nilai r = 3,5 maka banyak pengulangan yang harus dilakukan adalah sebanyak empat kali. Maka jumlah unit penelitian yang digunakan adalah empat dikali tujuh sebanyak 28. 22 3.5 Variabel Penelitian 1. Variabel bebas (independent variables) Dalam penelitian ini variabel bebas adalah perasan buah mengkudu dengan konsentrasi 20%, 40%, 60%, 80%, dan 100%. 2. Variabel terikat (dependent variables) Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat pertumbuhan bakteri S. typhi pada media Mueller Hinton Agar. 3. Variabel penganggu (confounding) Pada penelitian ini yang menjadi variabel peganggu yaitu kontaminasi mikroba lain, ketebalan media, kekeruhan suspensi bakteri, suhu inkubasi, waktu inkubasi. 3.6 Definisi Operasional Variabel a. Perasan buah mengkudu adalah cairan yang berwarna cokelat keruh dari buah mengkudu matang yang diperoleh dengan cara memeras secara manual menggunakan tangan. b. Bakteri S. typhi adalah bakteri gram negatif yang koloninya tak berwarna dengan bagian tengah berwarna hitam pada media selektif Salmonella Shigella Agar yang dicampurkan kedalam larutan NaCl fisiologis. c. Pertumbuhan bakteri adalah pertambahan jumlah sel bakteri yang terlihat dari pertambahan jumlah koloni yang semakin banyak atau ukuran koloni yang semakin besar pada media Mueller Hinton Agar setelah diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam. 23 d. Daya hambat perasan buah mengkudu adalah kemampuan zat yang terdapat pada perasan buah buah mengkudu untuk menghambat pertumbuhan bakteri S. typhi dan dinyatakan dengan diameter zona hambat (mm). e. Diameter zona hambat adalah daerah bening disekitar cakram disk yang terdapat dalam media Mueller Hinton Agar yang menunjukkan luas pertumbuhan bakteri S. typhi yang dihambat oleh perasan buah mengkudu. Daerah bening yang terbentuk diukur menggunakan jangka sorong dan hasilnya dinyatakan dalam satuan milimeter. 3.7 Prosedur Penelitian 3.7.1 Tahap persiapan a. Pengambilan buah mengkudu Buah mengkudu yang digunakan untuk bahan penelitian diambil di Kelurahan Ubung Kaja, Kota Denpasar. Buah mengkudu tersebut kemudian dibersihkan untuk diproses menjadi perasan buah mengkudu. b. Pembuatan perasan buah mengkudu 1. Buah mengkudu matang yang berwarna putih kehijauan, agak lembek dan berbau khas yang sudah dipetik dari pohon dicuci bersih dengan air mengalir. 2. Alkohol 96% disemprotkan ke seluruh permukaan kulit buah mengkudu. 3. Buah mengkudu dibilas menggunakan akuades steril dan ditiriskan. 4. Buah mengkudu dipotong menjadi dua bagian, kemudian tiap potongan buah mengkudu diparut kemudian diperas secara manual menggunakan tangan yang sudah memakai sarung tangan. 24 5. Perasan buah mengkudu ditampung dalam gelas beker dan dipindahkan ke dalam erlenmeyer sambil disaring menggunakan kain saring sebanyak satu kali dan kertas saring sebanyak dua kali. Kain saring dan kertas saring sebelumnya telah disterilkan menggunakan autoklaf. 6. Hasil saringan ditampung dalam gelas ukur dan ditutup rapat dan dinyatakan sebagai perasan buah mengkudu dengan konsentrasi 100%. c. Pengenceran perasan buah mengkudu 1. Pengenceran perasan buah mengkudu dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi 80%, 60%, 40%, dan 20% dengan rumus pengenceran sebagai berikut : V1 x C1 = V2 x C2 Keterangan rumus : V1 : volume perasan buah mengkudu yang akan diencerkan dari konsentrasi 100%. V2 : volume perasan buah mengkudu yang akan dibuat, yaitu 1000 µl. C1 : konsentrasi perasan buah mengkudu yang akan diencerkan, yaitu 100%. C2 : konsentrasi perasan buah mengkudu yang akan dibuat. Jumlah perasan buah mengkudu konsentrasi 100% yang diperlukan untuk masing-masing konsentrasi adalah sebagai berikut : Tabel 3.1 Pengenceran perasan buah mengkudu Konsentrasi 80% 60% 40% 20% (Sugianti, 2012) Perasan buah mengkudu (100%) 800 µl 600 µl 400 µl 200 µl Aquadest steril 200 µl 400 µl 600 µl 800 µl d. Pembuatan media uji sensitivitas (Mueller Hinton Agar) 1. Bubuk media Mueller Hinton Agar ditimbang sebanyak 20,4 g menggunakan neraca analitik. 25 2. Setelah ditimbang, dilarutkan dengan 600 ml aquadest. 3. Media dipanaskan sambil diaduk sampai larut sempurna. 4. Setelah larut sempurna, diukur pH media dengan menggunakan pH stik (pH optimal 7,3 ± 0,1 pada suhu 25 ºC). 5. Erlenmeyer ditutup dengan kapas lemak dan aluminium foil. 6. Media disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit. 7. Media yang telah disterilisasi, didiamkan sampai suhu media mencapai 4050ºC. 8. Larutan media dituang ke dalam cawan petri ± 15 ml. Kemudian didiamkan hingga memadat. 9. Setelah media memadat, cawan petri dibalik. 10. Jika media tidak segera digunakan, media dalam tabung erlenmeyer disimpan di tempat yang aman dan tidak lembab. e. Pembuatan suspensi bakteri S. typhi 1. Satu sampai tiga ose koloni S. typhi dari biakan murni diambil dan disuspensikan ke dalam tabung yang berisi 5 ml larutan NaCl fisiologis 0,85%. 2. Suspensi ini dibandingkan dengan kekeruhan standar Mc Farland 0,5%. 3. Cara untuk membandingkan adalah dengan memegang kedua tabung saling berhimpitan. 3.7.2 Tahap Pemeriksaan 26 1. Cakram disk kosong disiapkan dan cakram disk ini direndam ke dalam air perasan buah mengkudu selama 1 jam pada setiap konsentrasi hingga seluruh cairan meresap ke dalam cakram disk. 2. Untuk kontrol negatif digunakan cakram disk yang direndam ke dalam 1000 µl aquades steril. 3. Untuk kontrol positif digunakan cakram disk antibiotik chloramphenicol. 4. Suspensi S. typhi dengan kepekatan 0,5% Mc Farland disiapkan. 5. Swab kapas steril disiapkan dan dicelupkan kedalam suspensi bakteri. Setelah suspensi bakteri meresap, swab kapas steril diangkat dan diperas dengan cara menekankan pada dinding tabung bagian dalam sambil diputar-putar. 6. Swab kapas yang telah dicelupkan tadi digores-goreskan pada permukaan media Mueller Hinton Agar sampai seluruh permukaan tertutup rapat dengan goresan-goresan. Goresan dilakukan dengan merata. 7. Media Mueller Hinton Agar didiamkan selama 5 sampai 15 menit agar suspensi bakteri meresap ke dalam media. 8. Masing-masing cakram disk yang telah jenuh dengan perasan buah mengkudu serta kontrol positif dan kontrol negatif kemudian ditempelkan pada permukaan media Mueller Hinton Agar yang sudah digoreskan suspensi bakteri dan sedikit ditekan dengan pinset sampai melekat sempurna. 9. Jarak antar cakram satu dengan cakram lain minimal 15 mm dan cakram yang telah ditempelkan pada permukaan media tidak boleh dipindahkan atau digeser. 27 10. Media yang telah ditanami cakram disk diinkubasi pada suhu 37° C selama 24 jam dengan posisi terbalik. 3.8 Alur penelitian Bakteri S. typhi Cakram disk yang diisi Media MHA Aquadest (kontrol negatif) Chlorampenicol (kontrol positif) Perasan buah mengkudu 20% Perasan buah mengkudu 40% Perasan buah mengkudu 60% Perasan buah mengkudu 80% Perasan buah mengkudu 100% Daya Hambat Analisis Data Simpulan Gambar 3.2 Alur penelitian 3.9 Analisis Data Data dari hasil penelitian berupa diameter zona hambat yang dinyatakan dalam satuan millimeter, selanjutnya diolah dengan menggunakan uji statistik menggunakan bantuan perangkat lunak (software) SPSS 16.0 for windows dengan langkah sebagai berikut : a. Analisis statistik 28 1. Analisis normalitas untuk mengetahui kenormalan data pada masing-masing kelompok perlakuan dengan menggunakan uji Saphiro Wilk pada taraf kepercayaan 95% atau = 0,05. 2. Analisis homogenitas untuk mengetahui homogenitas variasi data dengan menggunakan uji Levene Test pada taraf kepercayaan 95% atau = 0,05. 3. Analisis komparasi dengan menggunakan uji One Way Anova yang apabila data berdistribusi normal dan varian homogen dan apabila signifikan dilanjutkan dengan uji beda dengan uji Least Significant Difference (LSD) pada taraf kepercayaan 95% atau = 0,05. Sedangkan jika data berdistribusi tidak normal dan varian tidak homogen maka dilakukan uji non parametrik dengan uji Kruskal Walls (KW) dan apabila signifikan dilanjutkan dengan uji Mann Whitney dengan taraf kepercayaan 95% atau = 0,05. 4. Analisis korelasi untuk mengetahui korelasi data dengan menggunakan uji Product Moment pada taraf kepercayaan 95% atau = 0,05. b. Analisis komparasi Kategori zona hambat hasil penelitian dibandingkan dengan kategori zona hambat bakteri menurut Davis Stout (1971) berikut : Tabel 3.2 Tabel kategori zona hambat No Diameter Zona Hambat (mm) 1 <5 2 5 – 10 3 11 – 20 4 >20 (Davis dan Stout, 1971) Kategori Lemah Sedang Kuat Sangat Kuat
