BIOKIMIA ANALISIS DAN KETEKNIKAN REAL TIME PCR ABDUL AZIZ G851190021 SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2019 REAL TIME PCR 1 Instrumen PCR 2 Dogma Sentral 3 Mekanisme perbanyakan DNA 4 Tahap PCR 5 Aplikasi PCR 2 PCR (POLIMERASE CHAIN REACTION) Amplifikasi pita DNA yang dilakukan diluar sel makhluk hidup Fungsi utama: untuk memperbanyak DNA target dalam waktu relatif cepat Instrumen Aplikasi sepasang primer template/cetakan enzim Taq DNA poly merase dNTP dan buffer isolasi gen DNA sequencing Forensik diagnosa penyakit. Teknik ini diperkenalkan oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya. Dogma sentral aliran informasi genetik Teknik PCR, berdasarkan mekanisme replikasi DNA pada semua sel (in vivo) RT PCR Pada real time PCR hasil amplifikasi melalui metode real time PCR terukur secara “real time” seiring dengan berlangsungnya reaksi PCR STEP 3 DATA ANALISIS STEP 2 REAKSI PCR STEP 1 PRIMER DESIGN Tahap PCR 1. Denaturasi 2. Annealing 3. Perpanjangan (extention) INDIKATOR -% GC (>50%) -Panjang Primer (15-30 pb) - Hindari self dimmer, pair dimmer, hairpin -Temperatur penempelan primer tidak jauh berbeda Aplikasi -Forensik -dna Sequencing -diagnosa penyakit RT-PCR Komponen reaksi PCR 1 DNA TARGET DNA sampel mengandung DNA target Denaturasi 2 PRIMER Oligonukleotida komplemen DNA target Annealing 5 dNTP Nukleotida untuk perpanjangan utas DNA 3 DNA Polimerase Enzim yang cukup stabil dalam pemanasan Extention 6 Fluorescent Detector Ethidium bromide 4 BUFFER MgCl2, Tris HCL dan KCL Monitoring 2010 Tahap RT PCR Annealing Denaturasi 1,5 menit 50 oC 5 menit 95 oC rt PCR 1-10 menit 72 oC Extention Analisa Denaturasi Annealing Pemanjangan Pemanjangan Proses amplifikasi DNA target Elektroforegram hasil PCR 1 2 3 23.1 kb 9.4 kb 6.5 kb 2,6 kb 4.3 kb 2.3 kb 1 2.0 kb 3 2 0,2 kb More Cycles = More DNA Jumlah siklus Ukuran Marker 0 10 15 20 25 30 Aplikasi RT-PCR 01 Isolasi Gen • DNA Makhluk hidup cukup besar • DNA manusia -/+ 3 miliar basa • Isolasi gen penghasil Insulin • menyisipkannya gen insulin ke sel bakteri 02 DNA Sequencing • Melihat urutan basa suatu DNA • Identifikasi organisme hasil isolasi • Identifikasi tingkat kekerabatan organisme 03 04 Forensik • Identifikasi korban atau pelaku kejahatan • Penatibus sit amet • Lorem ipsum dolor Diagnosa Penyakit • Diagnosa flu babi • Hasil akurat • Amplifikasi hanya dilakukan pada fragmen DNA virus flu babi (H1N1) 13 Terimakasih