Kegiatan ke 1 Sterilisasi Alat dan Bahan A. Tujuan Kegiatan Mahasiswa dapat mengetahui proses sterilisasi alat dan bahan. B. Kajian Pustaka Prinsip-prinsip pengendalian mikroorganisme lain perlu diperhatikan pada saat analisis mikroorganisme di laboratorium. Hal ini dilakukan agar menghindari kontaminasi pertumbuhan sel bakteri oleh mikroorganisme lain. Dengan selalu meperhatikan kondisi steril dalam setiap analisi bekteriologis di laboratorium, memungkinkan diperoleh kondisi berbagai alat atau bahan yang digunakan dalam laboratorium tersebut terbebas dari kehidupan apapun (Boleng, 2015: 65). Pembebasan suatu bahan, wadah, dari kehidupan (mikroorganisme) apapun, akan menghasilkan suatu keadaan yang bebas dari kehidupan apapupn. Keadaan suatu bahan atau wadah yang terbebas dari kehidupan disebut sterilisasi. Proses pembebasan suatu bahan atau wadah dari kehidupan apapun dapat dilakukan dengan sterilisasi atau disenfikasi (Boleng, 2015: 66). Sterilisasi dalam mikrobiologi berarti membebaskan tiap benda atau substansi dari semua kehidupan dalam bentuk apapun. Untuk tujuan mikrobiologi dalam usaha mendapatkan keadaan steril, mikroorganisme dapat dimatikan setempat (in situ) oleh panas (kalor), gas-gas seperti formaldehyde, etilenoksida atau betapriolakton oleh macam-macam larutan kimia oleh sinar lembayung ultra atau sinar gamma. Mikroorganisme juga dapat disingkirkan secara mekanik oleh sentrifugasi kecepatan tinggi atau oleh filtrasi (Irianto, 2006: 75). Sterilisasi adalah proses untuk membebaskan suatu benda dari semua mikroorganisme baik bentuk vegetatif maupun bentuk sporanya. Kita hanya menjumpai di alam adanya benda yang steril dan tidak steril. Tidak ada benda yang setengah steril. Benda steril berarti benda tersebut bebas dari 2 mikroorganisme. Sterilisasi dapat dikatakan juga bahwa sebuah proses untuk mematikan semua bentuk makhluk hidup (Boleng, 2015: 66). Sterilisasi juga diartikan sebagai suatu proses yang digunakan untuk menghancurkan atau mengurangi mikroorganisme yang dapat muncul pada atau dalam produk kemasan. Sediaan steril memiliki beberapa sifat bentuk takaran yang unik, seperti bebas dari mikroorganisme, pyrogen dan bebas dari partikula, serta memiliki standar yang sangat tinggi dalam hal kemurnian dan kualitas (Syah, 2016: 3). Istilah sterilisasi mengandung arti suatu perlakuan penghancuran semua mikroba beserta sporanya. Derajat sterilitas yang cukup dapat diperoleh bila titik terdingin dalam kaleng cukup menerima panas untuk menghancurkan mikroba. Derajat sterilitas biasanya direpresentasikan sebagai nilai F yaitu waktu dalam menit pada suhu 121o C yang diperlukan untuk menghancurkan mikroba. Nilai F ini tergantung pada suhu proses dan nilai Z (perubahan suhu) dimana mikroba hancur sebesar 1 log atau 10n (Nurhikmat, 2016: 72). Teknik sterilisasi media yang umumnya digunakan adalah sterilisasi autoklaf dan radiasi sinar Gamma. Sterilisasi autoklaf mempunyai kelemahan yaitu mampu meningkatkan kelarutan logam Mn pada bahan pembawa. Sterilisasi tanah menggunakan autoklaf dapat meningkatan kelarutan Fe, Mn, Zn. Peningkatan logam-logam berat dalam jumlah besar ini akan berpengaruh negatif terhadap pada viabilitas mikrob dalam bahan pembawa dan pada akhirnya akan berpengaruh pada pertumbuhan tanaman (Nurrobifahmi, 2017: 12). Menurut Boleng (2015, 67-71); Gabriel (1996, 32-33) secara umum ada dua acara sterilisasi, yaitu: 1. Sterilisasi secara fisik Sterilisasi secara fisik, terdiri atas beberapa macam, yaitu: a. Sterilisasi yang menggunakan cahaya matahari yaitu dengan sinar ultraviolet dan sterilisasi dengan cara ini digunakan untuk sterilisasi air sungai dan danau. 3 b. Sterilisasi dengan cara pengeringan yang digunakan untuk membunuh kuman, terutama bentuk vegetatifnya. Sterilisasi dengan cara pengeringan ini tidak efektif terhadap spora kuman. c. Sterilisasi dengan cara pemanasan yaitu dipengaruhi oleh faktor jenis pemanasan dimana menggunakan pemanasan basah atau kering serta suhu dan lama pemanasan, angka sel mikroorganisme yang ada, keberadaan spora didalam sel mikroorganisme, dan jenis bahan yang mengandung mikroorganisme. Sterilisasi dengan cara pemanasan dibedakan menjadi: 1) Pemananasan kering Pemanasan kering ini kurang efektif apabila temperatur kurang tinggi. Untuk mencapai efektivitas diperlukan pemanasan mencapai temperatur antara 160°C sampai 180°C. Pada system pemanasan kering terdapat udara yang dimana telah diketahui bahwa udara merupakan penghantar panas yang buruk sehingga sterilisasi melalui pemanasan kering memerlukan waktu yang cukup lama, rata-rata waktu yang diperlukan adalah 45 menit. Dasar-dasar proses membunuh kuman dengan pemanasan kering adalah denaturasi protein, kerusakan akibat oksidasi, dan efek toksik akibat kadar elektrolit. Ada beberapa pemanasan kering diataranya adalah pemanasan langsung sampai merah, melayangkan di atas nyala api, pembakaran dan sterilisasi dengan udara panas. 2) Pemanasan basah Pada pemanasan basah, efeknya adalah denaturasi protein, ada beberapa cara steriliasi pemanasan basah, diantaranya adalah: a) Pemanasan dengan menggunakan suhu di bawah 100°C, yaitu pemanasan dengan menggunakan suhu 63°C selama 30 menit (cara holder). Pemanasan dengan suhu 72°C selama 15-20 menit (cara flash), sasaran utamanya adalah bakteri Mycrobacterium, Salmonella, dan Brucella. b) Pemanasan dengan menggunakan suhu 100°C, dengan cara tindalasi yaitu dilakukan dengan memanaskan pembenihan pada suhu 100°C 4 pada aliran uap selama 30 menit selama tiga hari secara berturutturut. Kemudian sterilisasi dengan cara mendidihkan dilakukan dengan mensterilkan alat dalam air mendidih selama 10-30 menit. d. Metode pemanasan dengan uap air dan pengaruh tekanan (auto claver) Pemanasan dilakukan hingga air mendidih (diperkirakan pada suhu 100°C), pada tekanan 15 temperatur mencapai 121°C. Organisme yang tidak berspora dapat dimatikan dalam tempo 10 menit saja. Banyak jenis spora hanya dapat mati dengan pemanasan 100°C selama 30 menit tetapi ada beberapa jenis spora dapat bertahan pada temperature ini selama beberaapa jam. e. Sterilisasi dengan cara penyaringan Sterilisasi cara ini berguna untuk larutan antibiotika, serum, larutan karbohidrat, dan lain-lain. Cara ini juga berguna untuk memisahkan kuman dari toksin dan dari fage. Sterilisasi cara ini juga dipergunakan dalam menyaring kuman yang jumlahnya sedikit di dalam suatu cairan. Virus dan mikroplasma dapat lewat saringan kuman. Hal ini merupakan kekurangan dara cara sterilisasi dengan penyaringan ini. Ada beberapa jenis saringan kumanyaitu filterdari gelas berlubang, filter membrane atau kolodion, tabung porseler (misalnya Berkefeld atau Camberland), filter piringan abses (misalnya Seitz). f. Sterilisasi dengan cara radiasi Dalam mikrobiologi radiasi gelombang elektromagnetik yang banyak digunakan adalah radiasi sinar ultraviolet, radiasi sinar gamma atau sinar X dan sinar matahari. Sterilisasi dengan penyinaran sinar gamma berdaya tinggi dipergunakan untuk objek-objek yang tertutup plastik. Untuk makanan dan obat-obatan tidak dibolehkan menggunakan sinar gamma untuk sterilisasi karena akan terjadi perubahan struktur kimia pada makanan maupun obat-obatan tersebut. 2. Sterilisasi secara kimia Bahan kimia bersifat bakteriostatik, hal disebabkan oleh: a. Bahan kimia tersebut dapat mengumpulkan protoplasma kuman 5 b. Bahan kimia tersebut dapat menimbulkan kerusakan selaput sitoplasma c. Bahan kimia tersebut dapat mempengaruhi oksidasi atau pembakaran protoplasma kuman d. Bahan kimia tersebut dapat mempengaruhi enzim atau koenzim kuman Alat laboratorium yang digunakan dalam penelitian yaitu autoklaf sebagai sterilisator dengan pemanasan basah dan oven sebagai sterilisator dengan pemanasan kering yang dilengkapi dengan ozon di bagian atas dan infrared di bagian bawah. Selain itu juga alat yang lazim digunakan di laboratorium mikrobiologi, termasuk bahan untuk pengecatan gram dan pengecatan klein (Meliawaty, 2012: 150). Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang mahal harganya. Inovasi oven sudah banyak diterapkan, diantaranya melalui penambahan ozon dan infrared, sehingga menjadi alat sterilisasi yang jauh lebih murah. Ruangan dalam oven itu dibagi menjadi 2, bagian atas dilengkapi ozon sedangkan bagian bawah dengan infrared. Ozon bersifat bakterisid, mikobakterisid, dan sporisid. Sterilisator dengan menggunakan bentuk dasar radiasi infrared membunuh spora Bacillus atrophaeus. Keuntungan teknologi infrared adalah waktu siklus pendek, pemakaian energi rendah, tidak ada residu, dan tidak beracun terhadap lingkungan, hanya jaminan sterilitasnya tidak pernah disertakan, oleh karena tidak dilengkapi termometer, sehingga pemantauan hasil sterilitas secara fisika sulit ditentukan (Meliawaty, 2012: 149-150). Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna sehingga bisa memberikan jaminan sterilitas, dapat digunakan mikroba penguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora (Syah, 2016: 4). Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan mikroba penguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan disterilkan. Setelah proses sterilisasi lalu ditumbuhkan pada media. Jika media 6 tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik (Syah, 2016: 62). Menurut Irianto (2006, 79-80) faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi diantaranya adalah: 1. Hidrasi Pada pemanasan kering yang menggunakan suhu 165-170°C selama 1 jam, mikroorganisme itu dimatikan dengan penghangusan. Dengan sendirinya cara itu tidak dapat dilakukan terhadap bahan-bahan yang titik didihnya berada dibawah suhu ini dan terhadap bahan-bahan yang tidak tahan terhadap suhu yang terlalu tinggi. Pemanasan dalam keadaan lembab (basah) lebih efektif dari pemanasan kering. 2. Pengaruh suhu Aktivitas mematikan bakteri bertolak belakang antara suhu dengan waktu. Pada umumnya semakin rendah suhu yang digunakan maka semakin lama waktu yang diperlukan untuk membunuh organisme itu. Biasanya dalam batas suhu tumbuh mikroorganisme, peningkatan suhu 10°C saja dapat meningkatkan derajat reaksi 2 sampai 8 kali. 7 C. Alat dan Bahan 1. Alat a. Labu Erlenmeyer 1 buah b. Cawan Petri 2 buah c. Tabung Reaksi 3 buah d. Pipet Ukur 2 buah e. Ozon sterilizer 1 unit f. autoklaf 1 unit 2. Bahan a. Semua alat yang disterilisasi b. Alumunium Foil secukupnya c. HVS secukupnya d. Label 5 lembar e. Tisu secukupnya D. Cara Kerja 1. Alat yang akan di sterilisasi diambil, kemudian dicuci dengan menggunakan air bersih 2. Alat yang sudah dicuci dikeringkan menggunakan tisu hingga benar-benar kering 3. Permukaan alat-alat atau bahan yang akan disterilisasi dibungkus menggunakan alumunium foil dan HVS untuk meminimalisir adanya spora bakteri kontaminan 4. Setelah itu, alat yang sudah dibungkus disterilisasi menggunakan alat ozon sterilizer 5. Alat dan atau bahan yang tidak tahan panas (<180◦C) ditempatkan pada rak pintu atas dan yang tahan panas (<250◦C) pada rak pintu bawah 6. Pintu sterilizer dalam keadaan tertutup sebelum dihubungkan ke stop kontak 7. Ozon sterilizer dihubungkan dengan stop kontak pada sumber arus 220V 8. Alat Ozon sterilizer dihidupkan dengan cara menekan tombol “POWER” 8 9. Proses sterilisasi dapat dimulai dengan menkan tombol “DESINFECT” (kiri power) hinggalampu indicator menyala merah 10. Untuk mengaktifkan sterilisasi teknologi ozone pada rak pintu atas, dengan menekan tombol O3 (kiri disinfect) hingga lampu indicator menyala kuning 11. Proses sterilisasi berjalan selama ± 10 menit setelah lampu indicator mati (dilarang membuka pintu Ozon sterilizer) otomatis 12. Lampu indikator power ditunggu hingga menyala, lalu matikan dengan menekan tombol power 13. Sebelum membuka pintu Ozone sterilizer disarankan untuk menunggu ±20 menit, terhitung waktu setelah proses sterilisasi berakhir 9 Daftar Rujukan Boleng, D. T. 2015. Bakeriologi Konsep-Konsep Dasar. Malang: Universitas Mulawarman Gabriel, J.F. 1996. Fisika Kedokteran. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Menguak Dunia Mikroorganisme. Bandung: Rama Widya Nurhikmat, Asep, dkk. 2016. Pengaruh Suhu dan Waktu Sterilisasi Terhadap Nilai F dan Kondisi Fisik Kaleng Kemasan Pada Pengalengan Gudeg. Agritech. 36(1): 72. https://media.neliti.com. Diakses pada tanggal 07 Maret 2019 Nurrobifahmi, dkk. 2017. Pengaruh Metode Sterilisasi Radiasi Sinar Gamma Co60 dan Autoklaf terhadap Bahan Pembawa, Viabilitas Spora Gigaspora margarita dan Ketersediaan Fe, Mn, dan Zn. Jurnal Tanah dan Iklim. 41(1): 1-2. http://ejurnal.litbang.pertanian.go.id. Diakses pada tanggal 07 Maret 2019 Syah, Insan S.K, dkk. 2016. Indicator Biologi Spore Strip Sebagai Penentu Jaminan Sterilisasi. Farmaka. 14(1): 1, 3-4. http://download.portalgaruda.org. diakses pada tanggal 07 Maret 2019 10 LEMBAR PENGESAHAN Samarinda, 11 Maret 2019 Mengetahui, Asisten Praktikum Praktikan Dea Fitri Kinanti Lia Agustina 11 NIM. 1505015032 NIM. 1605015013
