materi dan metode

MATERI DAN METODE
Waktu Dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di laboratorium riset Bagian Patologi,
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, Balai Besar Pengujuan
Mutu dan Sertifikasi Obat Hewan (BBPMSOH) dan di Animal Health
Laboratory PT CPJF, Ancol, Jakarta. Waktu pelaksanaan penelitian adalah
dari bulan April sampai Oktober 2010.
Alat Dan Bahan
a. Hewan percobaan
Penelitian ini menggunakan ayam broiler yang dibagi menjadi 8
kelompok percobaan.Selain itu juga menggunakan kelinci untuk produksi
poliklonal antibodi untuk imunohistokimia.
b. Peralatan
Delapan set kandang kawat lengkap dengan tempat pakan dan minum.
Kemudian satu set peralatan nekropsi (pisau bedah, gunting bedah, pinset,
formalin 10%). Selain itu juga satu set peralatan histologi dan
imunohistokimia, yaitu mikrotom, gelas obyek, cover glass, kit DAB,
antibodi primer, hematoksilin, entelan, serta mikroskop dan kameral.
Peralatan elisa meliputi satu set kit elisa, komputer yang dilengkapi
dengan software, reader dan pipet dengan tipnya. Sedangkan peralatan untuk
persiapan virus dan vaksin berupa satu set peralatan kultur jaringan, telur
ayam berembrio 9 hari, antibiotik, telur ayam SPF yang berembrio 8-9 hari,
dan media kultur.
Metode Penelitian
Ayam dibagi menjadi 8 kelompok percobaan :
Kelompok I(Infected) :kontrol positif, tidak divaksin tetapi diinfeksi.
Kelompok NI(Not Infected) :kontrol negatif, tidak divaksin dan tidak
diinfeksi.
Kelompok V1I (Vaccine 1 + Infected) :divaksin IBD strain V1, diinfeksi.
19
Kelompok V1NI (Vaccine 1 + Not Infected): divaksin IBD strain V1, tidak
diinfeksi.
Kelompok V2I (Vaccine 2 + Infected) :divaksin IBD strain V2, diinfeksi.
Kelompok V2NI (Vaccine 2 + Not Infected): divaksin IBD strain V2, tidak
diinfeksi.
Kelompok V3I (Vaccine 2 + Infected) :divaksin IBD strain V3, diinfeksi.
Kelompok V3NI (Vaccine 2 + Not Infected): divaksin IBD strain V3, tidak
diinfeksi.
Vaksin strain V1 adalah strain W2512, golongan intermediate plus
yang diaplikasikan di hatchery. Vaksin strain V2 adalah strain D78, golongan
intermediate yang diaplikasikan pada umur 13 hari. Sedangkan Vaksin strain
V3 adalah strain 228E, golongan intermediate plus yang diaplikasikan pada
umur 13 hari.
Setiap kelompok diambil 2 macam sampel untuk selanjutnya
dilakukan pemeriksaan di laboratorium, yaitu sampel darah dan organ.Organ
yang diambil meliputi bursa Fabricius, limpa, timus, seka tonsil dan
proventrikulus. Sampel darah diambil 3 kali, yaitu pada DOC, sebelum
diinfeksi pada umur 21 hari dan setelah diinfeksi yaitu pada umur 29 hari.
Ayam dinekropsi dan diambil organ-organnya pada umur 29 hari dan
kemudian difiksasi untuk selanjutnya dipersiapkan sebagai preparat
histologi/imunohistokimia.
Persiapan Antibodi Primer
Antibodi primer dibuat dengan mengimunisasikan virus IBD strain
Kediri dan vaksin V3 pada dua kelinci, sementara satu ekor kelinci
digunakan sebagai kontrolnegatif. Setelah 3 minggu kemudian kelinci
dibooster dengan mengimunisasikan ulang virus/ vaksin yang sama. Enam
minggu kemudian kelinci diambil darahnya untuk diperiksa serumnya,
diukur titernya.Pengukuran titer antibodi dilakukan dengan metode SN
(serum neutralization).
20
Persiapan Virus dan Vaksin
Persiapan virus dilakukan dengan cara mempropagasi isolat virus IBD
strain Kediri-Jawa Timur, kemudian diukur titernya dengan titrasi pada telur
dan dengan kultur jaringan. Virus diinokulasikan pada telur ayam bertunas,
dan diamati adanya infeksi sampai 7 hari.Infeksi ditandai dengan adanya
kematian embrio, bintil-bintil pox dan kekerdilan embrio. Langkah
berikutnya adalah menghitung titer dengan melalui angka EID 50 dari virus
tersebut, dengan rumus :
PD = % > 50 – 50/ % > 50 - % < 50
EP50 = - Log pengenceran > 50% + PD
EP50 = - Log EID50
Titer virus = EID50/ 1 inokulum
Pada kultur jaringan dapat dilakukan dengan menanam virus pada
embrio ayam SPF berumur 8-9 hari dan diamati selama 5 hari. Kultur
kemudian diamati adanya CPE-nya (Cytopathic effect).Titer didapatkan
dengan menghitung angka TCID50 dari virus.
Pemeliharaan, Vaksinasi dan Infeksi Broiler
Pemeliharaan ayam dilakukan pada tempat terpisah antara kelompok
yang diinfeksi dan yang tidak. Infeksi dilakukan terhadap kelompok I, V1I,
V2I dan V3I pada hari ke 21 dengan virus IBD strain Kediridengan dosis
infeksi : 105EID50 (Suwarno, 2010, Komunikasi pribadi). Kemudian ayam
dinekropsi pada umur 29 hari, untuk kemudian diambil beberapa organnya.
Pengambilan darah dilakukan pada umur 1 hari, umur 21 hari
sebelum ayam diinfeksi dan 29 hari sebelum ayam dinekropsi. Darah
kemudian diamati titer antibodi IBDnya.Pemeriksaan imunohistokimia
dilakukan 2 kali, dengan menggunakan 2 macam antibodi primer yang
berbeda. Antibodi primer pertama adalah dari strain virus yang sama dengan
yang digunakan untuk menginfeksi (virus tantang). Sedangkan antibodi
primer kedua adalah dari virus vaksin (V3).
21
Gambar 6Skema pemeliharaan ayam percobaan dari DOC sampai umur 29 hari.
Pemeriksaan ELISA dan Imunohistokimia
ELISA dilakukan mengikuti prosedur kit ELISA tersebut. Dalam hal
ini kit yang digunakan adalah Biochek (Babiker, 2008b). Serum diencerkan
dengan
perbandingan
1:500
dengan
buffer
diluent.Kontrol
negatif
dimasukkan pada lubang A1 dan A2 pada plate yang sudah ditempeli dengan
antigen, kemudian diteruskan kontrol positif pada A3 dan A4.Sedangkan
Reference Kontrol pada lubang A5. Serum yang telah diencerkan dengan
perbandingan1 : 500 kemudian dimasukkan pada lubang A6, A7, A8 dan
seterusnya. Plate tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 22-270 C selama
30 menit. Plate kemudian dicuci selama 3-5 kali dan kemudian ditambahkan
konjugat pada semua lubangnya. Inkubasi juga dilakukan selama 30 menit
pada suhu yang sama. Setelah itu plate dicuci 3-5 kali, dan diteruskan dengan
penambahan substrat dan diinkubasi selama 15 menit. Pada saat inkubasi
tepat 15 menit, ditambahkan stop solution untuk menghentikan reaksi pada
plate. Selanjutnya plate dibaca OD-nya, yang kemudian dikonfersikan ke
dalam titer.
Imunohistokimia digunakan dengan mengikuti prosedur dari Biocare
dan dengan menggunakan DAB (Diamino Benzidine) sebagai kromogen.
Ayam yang telah dinekropsi diambil organ-organnya, kemudian difiksasi
dengan buffered Neutral Formalin 10%. . Kemudian dilanjutkan dengan
22
proses deparafinisasi dan blocking endogenous activitydengan 3% H2O2
dalam methanoldan snipper block.Penambahan antibodi primer ditambahkan
sesudah blocking dan diteruskan dengan antibodi sekunder. Langkah
berikutnya adalah dengan penambahan label, dan terakhir dengan pewarna
DAB.
Untuk
memberikan
latar
belakang
maka
diwarnai
dengan
hematoksilin. Langkah terakhir dari pewarnaan ini yaitu dengan cara hidrasi,
yaitu dengan mencelupkan slide ke dalam alkohol bertingkat dan kemudian
ke dalam xylol.
Pengamatan terhadap organ yang telah diwarnai dengan DAB
dilakukan secara
kualitatif dan kuantitatif.Secara
kualitatif dengan
menyatakan negatif atau positif. Penilaiankuantitatif dinyatakan dengan :
1. – (tidak ditemukan antigen pada semua lapang pandang)
2. + (jumlah antigen 1-10pada satu lapang pandang)
3. ++ (jumlah antigen 11-30pada satu lapang pandang)
4. +++ (jumlah antigen > 30pada satu lapang pandang)
23