Analisis Ekspresi Gen Penyandi Metallothionein

4
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Mekanisme Toleransi Terhadap Aluminium (Al)
Pada prinsipnya ada dua mekanisme toleransi tanaman terhadap cekaman
Al. Menurut Taylor (1991), mekanisme pertama adalah mekanisme eksklusi
dengan cara mencegah Al masuk kedalam simplas dan mencapai daerah
metabolik yang peka. Mekanisme kedua adalah mekanisme internal dengan
imobilisasi, kompartementasi dan detoksifikasi saat Al masuk kedalam simplas.
Mekanisme eksklusi dapat berupa: (1) immobilisasi Al pada dinding sel:
dinding sel tanaman memiliki sifat yang berbeda dalam menghalangi pergerakan
Al. Sebagian besar Al yang diserap akar masuk melalui apoplas dengan
menggantikan kedudukan Ca2+ dalam sel tanaman. Immobilisasi Al pada dinding
sel akan mengurangi pergerakan Al ke dalam simplas; (2) Permeabilitas selektif
membran plasma terhadap Al: membran plasma bertindak sebagai penghalang
terhadap masuknya Al ke sitosol; (3) Meningkatkan pH di sekitar perakaran:
tanaman yang toleran terhadap Al cenderung menaikkan pH lebih cepat
dibandingkan tanaman yang peka sehingga dapat membentuk Al menjadi bentuk
yang tidak beracun; (4) Eksudasi senyawa-senyawa pengkelat: Al dapat
dikeluarkan dari simplas jika ligan pengkelat dibebaskan ke rizosfir dan ligan
tersebut membentuk kompleks yang stabil dengan Al, sehingga mengurangi
aktifitas ion Al bebas pada daerah akar-tanah serta mengurangi absorpsi melalui
membran plasma. Contoh ligan pengkelat adalah asam organik seperti asam
oksalat, asam sitrat, asam suksinat, dan asam malat; dan (5) Eksudasi fosfat: fosfat
yang secara aktif dikeluarkan dari akar tanaman dapat membentuk kompleks tak
larut dengan Al, sehingga mengurangi pengaruh Al pada permukaan menbran
dan/atau penyerapan melalui membran plasma.
Mekanisme internal mencakup: (1) kelatisasi Al di sitosol: meningkatnya
produksi asam organik pada tanaman yang toleran Al dapat berperan dalam
mengurangi toksisitas Al dalam sitosol; (2) kompartemensasi Al di vakuola yakni
Al diasingkan pada tempat yang tidak peka terhadap Al; (3) Protein pengikat Al:
banyak jenis tanaman memiliki protein pengikat logam yang pembentukannya
dapat terinduksi oleh logam-logam terutama Cd, Zn, Cu, dan Pb yang dikenal
5
dengan nama fitokelatin; dan (4) Induksi sintesis protein tertentu: pada tanaman
gandum kultivar PT741 (toleran Al) Basu et al. (1994) menemukan protein
sebesar 51 kD yang diisolasi dari membran mikrosomal pada akar. Protein ini
disintesis pada ujung akar karena terinduksi cekaman Al 100 µM sedangkan pada
kultivar Neepawa (peka terhadap Al) tidak terbentuk protein tersebut.
Beberapa spesies tanaman memiliki kemampuan untuk mengakumulasi Al
di dalam tunas daun dan akar. Tanaman yang memiliki kemampuan ini antara lain
teh (Carr et al. 2003; Ruan & Wong 2004), melastoma (Watanabe & Osaki 2002),
dan buckwheat (Ma et al. 1998 ; Zheng et al. 1998). Tanaman disebut sebagai
akumulator logam bila mampu mengakumulasi logam sedikitnya 0,1 % pada
jaringan (Barcel & Poschnenrider 2003).
Mekanisme tanaman dalam mengakumulasi Al masih belum diketahui
secara pasti. Namun beberapa penelitian menunjukkan bahwa Al yang masuk ke
dalam tanaman terjerap oleh asam organik yang dihasilkan oleh tanaman. Pada teh
diduga bahwa Al terikat pada senyawa chatecin (Vitorello et al. 2005), sedangkan
pada melastoma Al terikat pada oksalat dan malat dalam daun (Watanabe & Osaki
2002).
Ekspresi beberapa gen pada gandum terinduksi oleh Al, dan salah satu
diantaranya adalah gen penyandi metallothionein (Snowden et al. 1995).
Metallothionein merupakan protein yang diproduksi oleh tanaman untuk mengikat
logam (Cobbett & Goldsbrough 2002). Gen penyandi metallothionein juga
berhasil diisolasi dan dikarakterisasi dari Melastoma affine L. yang merupakan
salah satu tanaman akumulator Al (Suharsono et al. 2009).
Snowden dan Gardner (1993) menyatakan bahwa Al meningkatkan
ekspresi gen MT pada gandum. Al merupakan kation yang sangat reaktif dan
termasuk ke dalam golongan hard cation bedasarkan klasifikasi dari Niebour dan
Richardson (1980). Oleh karena itu, Al merupakan pengikat yang kuat untuk
kelompok hard negative donor, misalnya kelompok karboksil (-COOH), hidroksil
(-OH), karbonil (-CO), dan fosfat (-PO3). Sedangkan gugus sulfidril tidak dapat
mengikat Al dengan kuat, walaupun berada pada pengkelat seperti misalnya pada
metallothionein dan pada phytochelatin (Vitorello et al 2005). Oleh karena itu,
induksi gen MT2 oleh cekaman Al diduga berkaitan dengan interferensi Al
6
terhadap ion logam lain yang berpengaruh terhadap metabolisme tanaman secara
normal, sehingga MT2 dibutuhkan untuk menjaga homeostasis ion logam
tersebut. Ion logam esensial yang dibutuhkan oleh tanaman dan berikatan dengan
MT2 adalah Cu dan Zn (Snowden & Gardner 1993).
2.2 Metallothionein
Tanaman memiliki mekanisme untuk mengendalikan dan merespon
masuknya ion logam yang berbahaya ke dalam selnya. Salah satu mekanisme
internal yang dimiliki oleh tanaman yaitu dengan mengikat ion logam tersebut
pada protein atau senyawa organik tertentu dan mengakumulasikannya pada
bagian tanaman tertentu misalnya daun. Tanaman tingkat tinggi memiliki dua
kelompok besar peptida pengikat logam, yaitu metallothionein (MT) dan
phytochelatin (PC) (Cobbett & Goldsbrough 2002).
MT merupakan polipeptida yang memiliki banyak ikatan sistein (cys)
yang disandikan oleh gen, memiliki berat molekul yang rendah, dan merupakan
protein pengikat logam. Sebagai konsekuensi dari banyaknya kandungan asam
amino Cys maka protein ini mengandung kelompok ’thiol’ (sulfidril, -SH) dalam
jumlah yang besar. Kelompok ’thiol’ mengikat logam-logam berat dengan sangat
kuat dan efisien, termasuk zink, merkuri, tembaga, dan kadmium. Residu sulfidril
dari Cys mampu mengikat logam dimana satu ion logam diikat oleh tiga residu
–SH atau satu ion logam dengan 2 residu –SH. Koordinasi pengikatan dari setiap
ion logam melalui residu –SH yang ada pada Cys, membentuk struktur tetrahedral
tetrathiolate (Schultze et al. 1988; Robbins et al. 1991). Pada hewan, logam akan
terikat pada residu cys dalam formasi logam-cys-(thiolate) dengan cara pertukaran
ion logam misalnya ion Zn tergantikan dengan ion Cu, Cd, atau Hg (Duncan et al.
2006). Menurut Zangger et al. (2001), MT mengikat logam dengan sangat kuat
namun pertukaran ikatan logam dapat berlangsung dengan mudah karena ikatan
MT terhadap logam memiliki stabilitas termodinamik yang tinggi dan stabilitas
kinetik yang rendah.
Selain terinduksi oleh logam, gen MT terinduksi oleh cekaman oksidatif
pada jaringan gabus (Mir et al. 2004), terekspresi pada saat fase senescense pada
daun (Buchanan-Wallaston 1994), dan saat pematangan buah (Davies & Robinson
7
2000). Seringkali beberapa tipe MT ditemui pada tanaman yang sama dan
memiliki kesamaan kinerja seperti yang ditemui pada Arabidopsis, dimana
Hernandez et al. (1998) menemukan bahwa terdapat overlapping antara MT1 dan
MT2 dalam pola ekspresinya. Pada arabidopsis, MT ditemukan terekspresi
walaupun tidak ada cekaman Cu. Saat tidak ada cekaman, MT1 terekspresi pada
jaringan trikoma dan vaskular daun, akar, bunga, dan benih. Sedangkan saat
dikenai cekaman Cu, MT1 diekspresikan pada jaringan mesofil daun dan tunas.
MT2 ditemukan pada trikoma Arabidopsis, baik yang dikenai cekaman maupun
yang tidak dikenai cekaman Cu.
Kemampuan MT untuk melakukan kompartemensasi Cd pada vakuola
ditunjukkan oleh hasil penelitian Vogeli-Lange (1990). Pada vakuola daun
tembakau (Nicotiana rustica), Cd terikat pada protein yang memiliki gugus (γGlu-Cys)3Gly dan (γ-Glu-Cys)4Gly, yang kemudian dikenali sebagai MT tipe 3.
Selain berfungsi untuk detoksifikasi logam berat, berbagai fungsi seluler
MT adalah untuk pengaturan homeostasis logam esensial, perlindungan terhadap
radiasi dan kerusakan oksidatif, dan kontrol seluler dalam poliferasi dan apoptosis
(Klaassen 1998).
2.3 Melastoma affine L.
M. affine L. merupakan salah satu spesies dari famili Melastomataceae
yang mampu mengakumulasi Al (Jansen et al. 2002), setelah Rubiaceae (Jansen et
al. 2003). Menurut Li et al (2000), M. affine L. dapat hidup pada tanah dengan
pH dibawah 4 dan mampu mengakumulasi Al sebanyak 9099 – 12810 mg/kg
daun dan 3499 – 3633 mg/kg akar. Tanaman diklasifikasikan sebagai akumulator
bila mengakumulasi Al sedikitnya 1000 mg/kg daun (Jansen et al. 2002).
Penelitian Watanabe et al (2001) menunjukkan bahwa selain tahan
terhadap cekaman Al, pertumbuhan melastoma juga dipacu oleh Al pada
konsentrasi yang rendah. Penelitian oleh Muhaemin (2008) menunjukkan bahwa
perlakuan 3,2 mM Al pada pH 4 pada M. affine L. mempunyai pengaruh positif
yang ditandai dengan pertambahan pertumbuhan akar sebesar 70,41 % setelah 6
minggu perlakuan dan tidak ditemui kerusakan jaringan pada ujung akar.
Cekaman Al pada tanaman toleran akan menginduksi sejumlah gen untuk
8
menghindari pengaruh ion Al. Pada melastoma, gen-gen ini diduga tidak hanya
berperan dalam mendetoksifikasi Al, tetapi juga menginduksi hormon
pertumbuhan.
Watanabe dan Osaki (2003) menyatakan bahwa Al mampu menembus
jaringan endodermis dan masuk ke dalam pembuluh xilem dan ditimbun di dalam
daun. Penelitian Mutiasari (2008) menunjukkan adanya akumulasi Al sebesar 8,81
mg/gr daun tua tanaman M. affine L. yang diberi cekaman 3,2 mM Al pada pH 4
selama 2 bulan. Akumulasi Al tersebut dapat ditemui pada jaringan mesofil daun
(Mutiasari 2008). Penelitian lain yang dilakukan oleh Watanabe dan Osaki (2002)
menyatakan bahwa akumulasi Al terjadi terutama pada bagian vakuola daun.
Selain itu juga terjadi akumulasi pada jaringan periderm sampai xilem pada akar
dan pada jaringan korteks, xilem sekunder dan empulur batang (Mutiasari 2008).
Didalam jaringan melastoma, Al ditemukan dalam bentuk Al monomerik, Aloksalat, Al-(oksalat)2, dan Al-(oksalat)3 (Watanabe et al. 1998). Karena
kemampuan Melastoma untuk mengakumulasi Al dalam jumlah yang tinggi,
maka melastoma dapat dijadikan sebagai tanaman model bagi ketahanan Al
terutama bagi tanaman dikotil.
2.4 Real Time Polimerase Chain Reaction (Real Time PCR)
Kemampuan sel untuk tumbuh, melakukan aktifitas, dan pertahanan
terhadap cekaman merupakan refleksi dari ekspresi gen. Oleh karena itu, tingkat
transkripsi dari gen spesifik dapat digunakan untuk mengetahui fungsi dari gen.
Terdapat empat metode yang biasanya digunakan untuk mengetahui tingkat
transkripsi yaitu northern blotting, in situ hybridization, Rnase protection assay,
dan quantitatif reverse transcriptase. Dengan menggunakan analisis Northern,
bisa diketahui ukuran dari mRNA dan integritas RNA sampel. Rnase protection
assay memungkinkan untuk melakukan pemetaan daerah inisiasi pada transkripsi,
daerah terminasi, batas ekson atau intron, dan membedakan mRNA yang memiliki
ukuran yang sama, yang akan ditampilkan sebagai satu pita pada analisis
Northern. In situ hybridization merupakan satu-satunya metode yang dapat
digunakan untuk menunjukkan transkripsi lokal pada sel spesifik suatu jaringan.
Kekurangan dari ketiga metode tersebut adalah kurang akurat (Bustin 2000).
9
Untuk mengetahui kuantitas ekspresi dari suatu gen, biasanya digunakan
northern blotting atau PCR biasa yang menggunakan produk akhir sebagai dasar
perhitungan. Penggunaan northern blotting untuk mengetahui ekspresi gen
memerlukan jumlah RNA yang cukup banyak (Hunt 2006). Selain itu,
pengukuran kuantitas ekspresi suatu gen dengan menggunakan hasil akhir dari
proses PCR mempunyai kelemahan yaitu presisi yang kurang, tidak sensitif,
resolusi rendah, tidak otomatis, diskriminasi hanya dari ukuran saja, hasil tidak
diekspresikan secara kuantitatif (Applied Biosystem 2007).
Pada proses PCR, terdapat tiga fase utama yaitu eksponensial, linier, dan
plateu (datar) (Gambar 1). Pada fase eksponensial, terjadi penggandaan dari
jumlah sesungguhnya DNA atau RNA yang digunakan sebagai cetakan, sehingga
perhitungan kuantitas DNA pada fase ini memiliki akurasi 100 %. Pada fase linier
sudah terjadi penggunaan bahan reaksi, reaksi penggandaan terjadi pelan dan
produk mulai terdegradasi. Dan saat plateu, tidak terjadi lagi proses penggandaan
DNA dan pada saat ini juga terjadi degradasi DNA produk, oleh sebab itu deteksi
ekspresi gen berdasarkan hasil akhir PCR memiliki akuransi yang rendah
(Applied Biosystem 2007).
10
Plateu
Plateu
Linier
eksponensial
Linier
Rn
eksponensial
SIKLUS
A.
B.
Gambar 1. Tiga fase utama pada proses PCR: (1) fase eksponensial dimana
terjadi penggandaan jumlah DNA cetakan yang sebenarnya, (2) fase
linier dimana proses penggandaan cetakan mulai menurun, (3) fase
plateu dimana tidak terjadi lagi proses penggandaan cetakan dan
DNA mulai terdegradasi. Deteksi untuk Real Time PCR terjadi pada
fase eksponensial, sedangkan deteksi pada PCR biasa terjadi pada
fase plateu yang digambarkan dalam bentuk kurva linier (A) dan
kurva log (B) (Applied Biosystem 2007)
Real Time PCR adalah metode kuantifikasi PCR yang memungkinkan
untuk mengamati pertambahan amplikon selama proses amplifikasi. Pada Real
Time PCR, perhitungan amplikon dilakukan pada saat fase eksponensial (Gambar
1). Sistem Real Time PCR menggunakan dasar pada deteksi dan kuantifikasi
fluorescence reporter. Signal akan meningkat sesuai dengan jumlah produk PCR
pada setiap siklus (Dorak 2006). Ada dua macam fluorescence reporter yang
biasanya digunakan dalam Real Time PCR, yaitu SYBR Green (Gambar 2) dan
TaqMan (Gambar 3). SYBR Green merupakan senyawa kimia yang akan
mendeteksi semua utas ganda DNA, biasa digunakan untuk perhitungan kuantitas
DNA dengan tujuan yang tidak spesifik. Sedangkan TaqMan lebih spesifik
daripada SYBR Green karena menggunakan TaqMan probe, yaitu probe yang
komplemen dengan utas DNA spesifik yang berada diantara primer forward dan
primer reverse dan didesain sedemikian rupa sehingga bila probe tersebut rusak
akibat proses perpanjangan DNA pada proses PCR maka akan melepaskan energi
yang dapat ditangkap oleh mesin Real Time PCR dengan dasar teknologi FRET
(Fluorescent Resonance Energy Transfer). Teknologi FRET didasari oleh transfer
11
energi dari pelacak berenergi tinggi (reporter dye) yang diletakkan didekat
pelacak berenergi rendah (quencer dye), transfer energi tersebut akan terjadi bila
pelacak berenergi tinggi rusak (Applied Biosystem 2007).
Gambar 2. Proses deteksi pada Real Time PCR dengan menggunakan SYBR
Green. SYBR Green akan terdeteksi bila terikat pada utas ganda DNA
saat fase perpanjangan DNA (extention) (Dorak 2006)
Gambar 3. Proses deteksi pada Real Time PCR dengan menggunakan TaqMan.
Deteksi akan terjadi bila TaqMan probe yang menempel diantara
primer forward dan primer reverse rusak selama fase perpanjangan
DNA (extention) (Dorak 2006)
12
Fluorescence reporter akan meningkat sampai pada jumlah yang bisa
terdeteksi oleh Real Time PCR dan digambarkan dalam bentuk kurva amplifikasi
(Gambar 4). Kurva amplifikasi mengandung beberapa informasi penting:
(1) threshold yaitu daerah deteksi yang terjadi pada saat jumlah fluorescence
reporter bisa dideteksi oleh mesin Real Time PCR, agar hasil perhitungan lebih
akurat threshold berada pada fase eksponensial; (2) Cycle Threshold (Ct) yaitu
siklus pada proses PCR saat jumlah fluorescence reporter berpotongan dengan
garis threshold yang ditetapkan untuk perhitungan pada Real Time PCR; (3) Rn
yaitu jumlah fluorescence reporter yang terdeteksi; dan (4) Cycle yaitu jumlah
siklus yang digunakan dalam proses PCR (Applied Biosystem 2007).
Gambar 4. Kurva amplifikasi pada Real Time PCR. Threshold adalah daerah
deteksi yang digunakan dalam analisis. Cycle Threshold (Ct) adalah
siklus pada saat fluorescence reporter berpotongan dengan
threshold. Rn adalah jumlah fluorescence reporter yang terdeteksi
selama proses PCR. Cycle adalah banyaknya siklus yang digunakan
dalam proses PCR (Applied Biosystem 2007)
Terdapat dua macam perhitungan yang bisa dilakukan dengan Real Time
PCR, yaitu (1) absolute quantitation yang digunakan untuk mengetahui jumlah
molekul DNA yang tidak diketahui dengan menggunakan kurva standar yang
sudah diketahui jumlah molekul DNA-nya. (2) Relative quantitation yang
digunakan untuk mengetahui jumlah molekul DNA yang tidak diketahui dengan
membandingkannya dengan sampel DNA yang lain yang digunakan sebagai
pembanding (Applied Biosystem 2004).
13
Relative quantitation banyak digunakan untuk mengetahui tingkat ekspresi
suatu gen pada suatu perlakuan dibandingkan dengan ekspresi gen yang sama
pada perlakuan yang lain. Untuk mengetahui ekspresi suatu gen maka dibutuhkan
gen referensi sebagai pembanding internal (endogenous control) jumlah DNA
agar tidak terjadi kesalahan interpretasi akibat jumlah sel yang berbeda. Gen
referensi adalah gen yang tidak dipengaruhi oleh lingkungan. Gen referensi yang
paling banyak digunakan adalah β-aktin dan Glyceraldehyde-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) (Bustin 2000).
Ada dua metode yang bisa digunakan untuk mengetahui tingkat ekspresi
gen dengan menggunakan relative quantitation, yaitu metode kurva standar relatif
(relative standard curve method) dan metode comparative Ct (comparative Ct
method/∆∆Ct). Metode kurva standar relatif menggunakan kurva standar relatif
yang akan digunakan untuk menghitung kuantitas sampel. Kurva standar yang
digunakan dapat dibuat dari DNA apapun yang sudah diketahui kuantitasnya
dengan pengenceran berseri. Oleh karena itu metode ini membutuhkan tingkat
akurasi yang tinggi dalam pemipetan sampel DNA yang akan digunakan untuk
kurva standar dan tidak membutuhkan validasi PCR sebelumnya. Namun metode
ini membutuhkan lebih banyak bahan reaksi kimia dan membutuhkan banyak
tempat reaksi PCR. Selanjutnya kuantitas gen target dan gen referensi dapat
diketahui dengan memasukkan nilai Ct gen target dan gen referensi ke dalam
kurva standar (log ng DNA dibanding nilai Ct). Ekspresi gen target pada suatu
perlakuan dilakukan dengan menormalisasi kuantitas gen target dengan gen
referensi dan membandingkan hasil normalisasi gen target pada perlakuan dengan
hasil normalisasi gen target pada perlakuan kontrol (kalibrator) (Applied
Biosystem 2004).
Gen target yang dinormalisasi (perlakuan/kalibrator) =
ng gen t arg et
ng gen referensi
Ekspresi gen target pada perlakuan relatif terhadap kalibrator (Relative
Quantification/RQ)
=
gen t arg et yang dinormalisasi pada perlakuan
gen t arg et yang dinormalisasi pada kalibrator
14
Metode ∆∆Ct banyak digunakan untuk menghitung ekspresi gen dari
sampel yang banyak. Karena tidak perlu menggunakan kurva standar, metode ini
lebih menghemat bahan reaksi PCR dan tidak membutuhkan akuransi dalam
pemipetan. Dalam metode ∆∆Ct, dibutuhkan validitas efisiensi reaksi PCR yang
biasa dilakukan dengan merancang primer yang menghasilkan amplikon
berukuran lebih kecil daripada 150 pb, dimana pada ukuran amplikon tersebut
maka efisiensi PCR yang terjadi adalah 100%.
Metode ∆∆Ct menggunakan rumus aritmatika 2-∆∆CT untuk mengetahui
ekspresi gen target yang telah dinormalisasi gen referensi, dan relatif terhadap
kalibrator (Relative Quantification/RQ). Rumus aritmatika tersebut diperoleh dari
rumus eksponensial amplifikasi proses PCR yaitu:
Xn = X0 x (1 + EX)Ct = K
dimana K= konstanta
(1)
Dimana : Xn = jumlah DNA pada siklus ke n
X0 = jumlah DNA mula-mula
EX = efisiensi PCR
Ct = adalah siklus yang diinginkan atau Cycle threshold
Bila gen target disimbolkan dengan X dan gen referensi disimbolkan dengan R,
maka rumus tersebut diatas dapat digunakan untuk mencari KX maupun KR.
Sehingga ekspresi gen X dinormalisasikan dengan gen referensi R, adalah
XT
X 0 x (1 + E X ) CTX K X
=
=
RT
KR
R0 x (1 + E R ) CTR
(2)
Nilai efisiensi gen X (EX) dan gen R (ER) sama, sehingga
X0
x(1 + E ) CTX −CTR = K
R0
(3)
Nilai ekspresi suatu gen yang sesungguhnya adalah jumlah DNA awal yang
digunakan sebagai cetakan, sehingga rumus (4) dapat diturunkan menjadi
XN = K x (1+E)-∆CT
Dimana : XN =
(4)
X0
R0
∆CT = CTX-CTR
Dan untuk mengetahui ekspresi gen target X pada perlakuan relatif terhadap
kalibrator, maka ekspresi gen X pada perlakuan (XNP) dibagi dengan ekspresi gen
X pada kalibrator (XNK)
15
X NP K x (1 + E ) − ∆CTP
=
= (1 + E ) − ∆∆CT
− ∆CTK
X NK K x (1 + E )
(5)
Dimana : -∆∆CT = -(∆CTP - ∆CTK)
Bila amplikon yang dihasilkan berukuran kurang dari 150 pb, maka nilai effisiensi
PCR adalah 100% yang nilainya sama dengan 1, sehingga jumlah gen X pada
suatu perlakuan yang telah dinormalisasi dengan gen referensi, dibandingkan
dengan kalibrator adalah
2-∆∆CT
(6)
(Livak & Schmittgen 2001)
Real Time PCR sudah digunakan secara luas, yaitu untuk deteksi patogen,
kuantifikasi virus, kuantifikasi ekspresi gen, efisiensi terapi pada obat-obatan
baru, dan memastikan kerusakan DNA (Applied Biosystem 2007). Untuk ekspresi
gen metallothionein (MT), beberapa peneliti juga menggunakan Real Time PCR
antara lain van Hoof et al (2001) yang menggunakan metode ini untuk
mengetahui perbedaan ekspresi MT pada tanaman yang sensitif terhadap tembaga
(Cu) dan tanaman yang toleran terhadap Cu yang ditumbuhkan pada konsentrasi
CuSO4 0,1 µM dan Moyle et al (2005) yang menggunakan kuantitatif Real Time
PCR untuk mengetahui ekspresi gen MT pada saat pematangan buah nanas.