Pengujian Difusi

Teori Zona Difusi Antibiotik
DR. Pingkan Aditiawati
Difusi
Formula yang berbeda digunakan untuk:
a. Mempertahankan konsentrasi antibiotik tetap konstan pada
reservoir.
b. Pemberian formula dengan jumlah tertentu akan
menghasilkan penurunan konsentrasi setelah difusi dimulai.
 Penggunaan formula yang tepat pada kasus (b) lebih mudah
daripada kasus (a).
 Difusi diluar bagian tepi zona hambat akan berhenti pada kedua
kasus diatas (a dan b) karena setelah waktu kritis (critical time),
populasi kritis (critical population) yang dicapai akan menyerap
fresh antibiotic.

Difusi



Jika antibiotik ditambahkan pada reservoir h jam setelah inkubasi
dimulai, maka periode pra-inkubasi akan mengurangi waktu difusi.
T = T0 – h , dimana
T = waktu difusi
T0 = waktu inkubasi hingga terjadi pertumbuhan, dimana terbentuk tepi
zona hambat
Pra-difusi ( -h ) dibawah suhu inkubasi yang memungkinkan untuk
pertumbuhan, akan menghasilkan 2 periode difusi, yang masing-masing
dikontrol dengan koefisien difusi ( D ) yang berbeda, yaitu:
D1 = koefisien difusi pada saat suhu rendah pada h jam
D2 = koefisien difusi pada suhu inkubasi pada T0 jam
Pertumbuhan dan Multiplikasi
Waktu kritis
 Inokulum

Waktu Kritis






Pertumbuhan populasi merupakan hal yang paling penting untuk
diperhatikan dalam hal absorpsi dan kerja dari antibiotik.
Kecepatan sintesis reseptor untuk antibiotik merupakan faktor pembatas
dari kerja antibiotik.
Pertumbuhan populasi yang terus meningkat bergantung pada
kecepatan metabolisme.
Pada umumnya, adanya penghambatan menunjukkan adanya
pencegahan multiplikasi individu organisme.
Waktu kritis ( T0 ) antara dimulainya pertumbuhan dengan pembentukan
tepi zona hambat merupakan jumlah generasi atau doubling time (n’),
serta ditambah periode lag /L( pada awal pembelahan sel setelah waktu
ke-0 dan selama metabolisme yang sempurna telah dimulai pada waktu
tersebut).
Kecepatan pertumbuhan pada umunya dipengaruhi oleh suhu. Contoh:
pengaruh suhu pada streptomisin dalam pembentukan zona hambat.
Inokulum
 Keadaan dan jumlah inokulum merupakan dasar yang penting
dalam menentukan waktu kritis saat tepi zona hambat dibentuk.
 Beberapa faktor yang cukup kompleks mempengaruhi keadaan
inokulum, seperti kematian dan pertumbuhan kriptik.
 Keadaan dan jumlah inokulum dipengaruhi oleh perubahan
nutrisi pada medium, dimana organisme diinokulasi dari satu
medium ke medium lain.
 Selain itu pengaruh yang berbeda pada periode lag dalam
sintesis RNA, protein atau DNA, dan dalam pembelahan sel
akan mengakibatkan hasil yang berbeda dengan pengaruh
sintesis antibiotik yang berbeda.
Adsorpsi
Penghitungan jumlah populasi penghambat penyerap
streptomisin menentukan resting cell staphylococcus.
 Nilai Nn = 1,36 X 108 berkorelasi dengan penyerapan 6,7 X106
mol streptomisin per sel.
 Perhitungan yang sama dari populasi kritis untuk penyerapan
adalah 2,3 X 107 mol per sel (N’ = 3,85 X 107) selama
pertumbuhan logaritmik.
 Kesulitan dalam pengujian penghitungan tersebut adalah
kesulitan dalam percobaan menentukan nilai populasi kritis dan
penyerapan antibiotik oleh sel dalam kondisi yang stabil.
 Rasio konsentrasi kritis terhadap konsentrasi minimum
penghambatan (m’/C) juga sulit ditentukan dalam keadaan yang
stabil.

Adsorpsi


Bagaimanapun kesalahan
dalam percobaan sulit
ditentukan.
Pada gambar disamping
menunjukkan nilai yang
diperoleh untuk C dan m’ pada
strain yang berbeda 
Streptococcus viridans diuji
dengan penisilin pada kultur
permukaan (surface culture)
Adsorpsi
Kombinasi pengaruh pH
dan konsentrasi Mg 2+
pada m’ dapat dilihat
pada kurva disamping
ini.
 Dapat dilihat konsentrasi
kritis ditentukan dengan
difusi streptomisn pada
agar perbenihan.

Mekanisme kerja






Antibiotik dapat dirusak atau menyimpang dari mekanisme kerja yang
spesifik.
Spesifisitas kerja yang berbeda ditunjukkan dalam campuran antibiotik
dengan hasil kuantitatif yang berbeda pada organisme yang berbeda
(contoh: penisilin pada Staphylococcus dan Bacillus).
Mekanisme kerja secara sinergis, aditif, dan antagonis tergantung pada
mekanisme kerja yang berbeda.
Penisilin yang bekerja pada sintesis dinding sel, hanya efektif pada
perbanyakan organisme dan dapat dibuat tidak efektif dengan
bakteriostatis yang dihasilkan oleh substansi penghambat lainnya.
Streptomisin memerlukan aktivitas metabolik untuk mekanisme
kerjanya.
Tahapan penting agar antibiotik dapat bekerja pada sel adalah
penyerepan antibiotik dengan segera pada sel reseptor.
Pengujian
Metode pengujian dasar
 Formula difusi
 Kemiringan pada garis pengujian
 Ketajaman bagian tepi zona hambat
 Presentasi grafik pembentukan tepi zona hambat

Prinsip Metode Pengujian

Zona penghambatan antibiotik telah digunakan secara
luas untuk memperkirakan kerja beberapa antibiotik pada
seluruh tahapan isolasi dan purifikasi antibiotik baru (dari
produk mentah biologi hingga memperkirakan aktivitas zat
kimia yang murni).
 Tanpa pengetahuan faktor biologi yang mempengaruhi
suatu uji,maka tidak ada perkiraan variasi statistik yang
memungkinkan (yang dapat membuktikan validitas suatu
uji).
 Respons biologi (U) diperkirakan secara langsung dengan
mengukur lebar zona penghambatan yang dihasilkan
antibiotik. Dosis (Z) merupakan konsentrasi antibiotik
pada kondisi pengujian, U=F(Z)



Jika kondisi yang mempengaruhi aktivitas antibiotik
sangat terkontrol, pada sampel dan standar sama,
sehingga diperoleh fungsi yang identik untuk
dibandingkan:
Standar Us =F(Zs)
Uji
Ur =F(Zr)
Rasio respons Ur / Us digunakan untuk menghitung
rasio dosis Zr / Zs (jika Zs diketahui, Zr maka dapat
diuji)
Metode paling sederhana yang dapat dicapai dalam
perhitungan ini adalah menggunakan fungsi yang
menghasilkan garis lurus, dimana terdapat hubungan
antara respons dan dosis (dimana fungsi identik dan
garis yang diplot akan paralel)
Formula Difusi



Kasus paling sederhana yang terjadi dalam reservoir besar 
dimana konsentrasi m0 antibiotik yang bersentuhan dengan kultur
agar selalu konstan selama periode pembentukan zona
penghambatan.
Hubungan garis lurus antara ln m0 dan X2 yang benar (dalam
batas kesalahan percobaan),akan menghasilkan m0 beberapa kali
lebih besar daripada m’, dan X adalah jarak difusi bukan diameter
zona penghambatan.
Untuk antibiotik yang lemah, hanya dapat diperoleh dalam
konsentrasi rendah dibawah konsentrasi kritis, dan saat X kecil,
hubungan garis lurus yang diperoleh akan lebih baik dengan
memplot X (daripada X2 ) terhadap log m0 . Pada kondisi ini aliran
air dan mengembangnya agar menjadi deviator yang penting.
Kemiringan Garis Uji






Dengan konsentrasi antibiotik yang konstan dalam reservoir
kemiringan garis lurus yang ditunjukkan dengan memplot ln m0
terhadap X2 ditentukan oleh D dan T.Untuk uji yang valid akan
menghasilkan garis paralel DT yang konstan dan sama untuk standar
dan pengujian.
Keakuratan waktu awal inkubasi dan penambahan antibiotik adalah hal
yang diperlukan. Selain itu perlakuan yang sama antara standar dan
sampel uji juga penting dalam desain pengerjaan dasar statistik.
Standarisasi kondisi inokulasi juga merupakan hal yang penting.
Ukuran inokulum (N0), periode lag dalam pembelahan sel (L), waktu
generasi (G), seluruhnya mempengaruhi nilai T, dan kemiringan kurva
uji.
Ketersediaan oksigen merupakan faktor yang sangat penting, pada
beberapa organisme uji dan antibiotik gagal menghasilkan zona
hambat yang tajam dalam keadaan mikroaerofilik.
Saat terdapat enzim destruktif, seperti penisilinase yang dihasilkan
organisme uji, ukuran inokulum sangat mempengaruhi ukuran zona
hambat.
Ketajaman Bagian Tepi Zona Hambat

Keakuratan suatu uji sangat jelas tergantung pada
keakuratan pengukuran lebar zona hambat yang
dapat diukur.
 Jarak antara dua titik dapat dibaca dengan akurat
dengan bantuan sistem yang baik.
 Pada reservoir kecil (cakram dengan diameter 5 mm)
pada banyak formula difusi menggunakan
pengukuran ( r ) dari bagian tengah daripada dari
bagian tepi reservoir (X).
 Kesulitan dalam memperkirakan tepi zona hambat
(50% penghambatan) akan menurunkan keakuratan
uji.

Faktor yang diketahui mempengaruhi ketajaman dan jarak
penglihatan bagian tepi zona hambat. adalah:
1. Rasio konsentrasi reservoir terhadap konsentrasi kritis
2. Penggunaan terbatas antibiotik dalam reservoir menghasilkan
konsentrasi maksimum pada saat sebelum bagian tepi zona
hambat terbentuk
3. Peningkatan waktu difusi menurunkan gradien konsentrasi
saat terbentuknya bagian tepi zona hambat.
4. Waktu kritis dan seluruh faktor mempengaruhi n’ dan G. Hal
terpenting adalah suhu dan ukuran inokulum (rasio N0/N’).
5. Pertumbuhan dan opacity-nya setelah pembentukan zona
hambat sebelum zona hambat diukur. Hal ini tergantung pada
komposisi medium dan atmosfer.
6.Penyebaran sensitivitas antibiotik individu organisme pada
populasi terhadap antibiotik.
Presentasi Grafik Pembentukan Tepi Zona
Hambat





Pada gambar disamping grafik
kurva hiperbolik peningkatan
konsentrasi dengan jarak
waktu yang berbeda-beda dari
reservoir.
Konsentrasi dalam skala
logaritma.
Setengah bagian terbawah
menunjukkan tiga kurva
pertumbuhan organisme.
Garis horizontal menunjukkan
populasi kritis.
Kemiringan garis merupakan
faktor dalam menentukan
ketajaman bagian tepi zona
hambat.
METODE KHUSUS




Double and triple layer plates
Penggunaan layer(lapisan) pada agar di bagian bawah dan atas (yang tidak
diinokulasi), dan lapisan yang diinokulasi (lapisan pertumbuhan) dibuat tipis.
Inokulasi permukaan
Pemanasan kultur
Membunuh inokulum dengan pemanasan menurunkan penyebaran variabel,
seperti sensitivitas dan waktu generasi individu sel dalam populasi.
Spora
Penggunaan suspensi spora (pada organsime vegetatif) sangat reproduktif.
Fungsi waktu generasi ditambahkan pada awal priode lag. Harus diingat faktor
yang mempengaruhi germinasi (nutrisi, suhu, sebelum perlakuan) akan
berbeda dengan faktor yang mempengaruhi pertumbuhan vegetatif. Faktorfaktor tersebut harus dikontrol dan dibuat seiidentik mungkin untuk standar
dan pengujian.
UJI SENSITIVITAS


Kondisi dan Intepretasi
Ketidakcocokan antara uji sensitivitas pada beberapa laboratorium sering
terjadi. Penggunaan cakram standar, medium, dan teknik bersamaan dengan
kontrol sensitif dan strain yang resisten pada kondisi yang sama
memungkinkan hasil yang konsisten, sehingga memerlukan peneltian.
Gradient Plates
Gradient plates telah digunakan dengan berbagai variasi modifikasi untuk
menentukan konsentrasi antibiotik  menunjukkan perbedaan yang kecil
pada beberapa kultur. (Lihat gambar di bawah ini)