Prosedur ekstraksi

Prosedur ekstraksi
Prosedur ekstraksi tergantung pada kebutuhan penyidik untuk menentukan kuantitas total
thiamin, atau tiamin dan ester fosfat. Untuk menganalisis jumlah thiamin, langkah-langkah
ekstraksi biasanya mencakup disintegrasi asam diikuti oleh pencernaan enzimatik. Langkahlangkah ini diperlukan untuk melepaskan bentuk yang terikat protein dan terfosforilasi dari
vitamin. Sebuah teknik ekstraksi solid (SPE) menggunakan kolom C18 sekali pakai lebih sering
digunakan untuk tujuan ini (Riccio et al, 2006), meskipun resin pertukaran ion dapat diterapkan
untuk menghapus beberapa gangguan. Kuantifikasi tiamin bebas dan ester fosfat individu
membutuhkan kondisi yang tidak menghidrolisis ikatan ester. Sampel ekstraksi terbatas pada
hidrolisis asam hingga tiamin bebas yang terikat matriks. Biasanya tidak perlu untuk metode
pencernaan untuk mendapatkan tiamin dari produk makanan yang diperkaya, karena vitamin
bebas bisa secara berhasil, diekstrak dari bentuk terikat. Dalam hal ini, penentuan kandungan
vitamin endogen bukan persyaratan yang ketat dan persiapan sampel enzimatik tidak diperlukan
(Engel et al, 2010). Dengan demikian, metode seperti elektroforesis kapiler (Fotsing et al, 1997,
2000), kromatografi elektrokinetik misel (Dinelli dan Bonetti 1994; Fujiwara et al, 1988),
kromatografi cair misel (Ghorbani et al.204, Monferrer-Pons et.al. 2003) dan kromatografi cair
telah dikembangkan. Di antara metode ini, kromatografi cair menjadi menjanjikan karena
perbaikan di kedua fase stasioner dan peralatan kromatografi tetapi tidak divalidasi sebagai
metode Association of Official Analytical Chemists (AOAC).
1. Metode Mikrobiologi untuk Analisis Tiamin.
Saat ini, tes mikrobiologi paling sering digunakan untuk tingkat rendah, yang secara alami
menghadirkan vitamin dalam makanan. Kandungan vitamin khusus dapat ditentukan dengan
memantau pertumbuhan mikroorganisme tertentu. Prosedur ekstraksi untuk analisis mikrobiologi
tiamin umumnya mengikuti hidrolisis enzim pada ester fosfat. Langkah ini diperlukan untuk
menghindari respon pertumbuhan diferensial untuk TMP, TPP dan TTP.
Spesies yang paling umum digunakan untuk penentuan tiamin adalah beberapa Lactobacilli
seperti L. fermentum dan L. Viridescens (ATCC 12706). Yang terakhir adalah mikroorganisme
yang paling banyak digunakan untuk mengukur konsentrasi thiamin. Hal ini membutuhkan
molekul tiamin utuh untuk pertumbuhan. Organisme lain seperti Phycomyces blakeslekanus,
Klocckera brevis (ATCC 9774), Ochromonas danica dan Neurospora crassa juga tersedia, tetapi
mereka kurang berguna.
Dalam mikrobiologi tradisional, koloni sasaran mikroorganisme harus terlebih dahulu
dipelihara dan kemudian dikelola oleh inokulasi reguler. Sebelum prosedur uji yang sebenarnya
dapat dimulai, pemeliharaan seharusnya secara segar disiapkan dan jumlah mikroorganisme harus
diatur sebelum organisme ditransfer ke medium. Membutuhkan banyak waktu dan tenaga kerja.
Tersedia juga secara komersial alat mikrobiologi untuk menentukan konsentrasi tiamin dalam
makanan seperti Difco TMThiamine Assay Medium dan DifcoTM Tiamin Assay medium LV.
Tiamin Assay Medium diterapkan untuk menentukan konsentrasi tiamin dengan teknik uji
mikrobiologi menggunakan Lactobacillus fermentum ATCCTM 9338 sedangkan Thiamine assay
Medium LV Technique menggunakan Weissella (Lactobacillus viridescens) ATCCTM 12.706
Menurut Blake (2007), prinsip-prinsip teknik ini meliputi:
1. Ekstraksi tiamin dari matriks makanan baik oleh autoklaf dalam kehadiran asam, atau
mencerna dengan enzim yang sesuai seperti Takadiastase atau protease.
2. Inkubasi dari ekstrak makanan di beberapa tingkat pengenceran dengan media
pertumbuhan dan pemeliharaan mikrobiologi.
3. Bacakanlah kekeruhan, yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme, dengan
spektrofotometer 540-660 nm.
4. Kalibrasi: plot semi-logaritmik dari absorbansi terhadap peningkatan konsentrasi vitamin.
Pengujian telah menjadi alat yang ampuh untuk analisis tiamin dalam berbagai makanan.
Namun, proses analisis bisa memakan waktu hingga 72 jam dan sering diganggu oleh
reproduktifitas yang buruk. Hal ini memungkinkan untuk mendeteksi jumlah tiamin antara 5 dan
50 ng. Teknik aseptik harus digunakan sepanjang prosedur uji mikrobiologi di bawah kondisi
yang sama untuk hasil yang sukses.
Namun, tes tidak lagi dianggap sebagai standar emas dalam analisis vitamin (Blake 2007).
Secara umum presisi dan akurasi dari tes mikrobiologi tidak tinggi dan secara tidak pasti
pengukuran relatif sekitar 20% cukup umum. Perkembangan terbaru adalah penggunaan pelat
yang sebelumnya dilapisi. Yang memungkinkan banyak masalah yang harus dihindari dengan
tetap menjaga pemeliharaan stok. Sistem VitaFast ®, berdasarkan metode referensi AOAC, EN
dan DIN, menentukan kandungan vitamin secara mikrobiologis dengan memanfaatkan pelat
microtitre yang dilapisi dengan mikroorganisme khusus. Alat uji dipasarkan oleh R-Biopharm AG
dan hal tersebut ideal untuk analisis rutin karena reagen siap digunakan dan alat mudah
digunakan. Tidak seperti sistem uji imunologi lainnya, tidak ada langkah pencucian yang
diperlukan. Alat VitaFast® untuk tiamin disahkan dan telah digunakan untuk analisis tiamin di
beberapa jus buah (Niemeijer et al 2009). Dibandingkan dengan uji vitamin mikrobiologi
tradisional, waktu yang dibutuhkan untuk analisis menggunakan alat uji VitaFast® adalah sekitar
sekitar 48 jam dan penentuan biaya dikurangi sekitar 70% (Niemeijer et al, 2009). Sistem
VitaFast® memiliki potensi untuk menawarkan perbaikan yang signifikan untuk tes mikrobiologi.
Hal ini dapat berhasil digunakan untuk menentukan tiamin serta vitamin B12, biotin, niasin, asam
pantotenat, riboflavin dan pyridoxine dalam makanan yang diperkaya dan alami. Selain metode
mikrobiologi, adapun metode lain yang diakui sebagai metode resmi.
1. Metode Kimia Analisis Tiamin
Metode kimia kini menjadi pilihan pertama untuk analisis tiamin. Dalam tes ini hal yang
khusus harus diambil untuk melindungi sampel dan standar dari cahaya dan panas pada pH basa.
Metode yang diusulkan berdasarkan pada Uranium (FL) dan HPLC (Blake 2007).
1.1 Metode Fluorometrik
Analisis tingkat tiamin dalam makanan secara tradisional didasarkan pada oksidasi tiamin
bebas untuk memberikan tiokrom (Gregory 1996). Variasi pada prosedur dasar telah
dikembangkan dan umumnya melibatkan pengukuran tiokrom dengan spectrofluorimeter. Metode
tiokrom tergantung pada oksidasi basa tiamin pada tiokrom (Gambar 17.2).
Langkah awal yang meliputi ekstraksi dan hidrolisis enzimatik dari ester fosfat tiamin.
Vitamin tersebut kemudian membersihkan kromatografi pertukaran ion dan akhirnya teroksidasi
menjadi tiokrom. Tiokrom tersebut akhirnya diekstraksi ke dalam pelarut organik seperti alkohol
isobutil. Tiokrom menunjukkan sebuah fluoresensi biru intens yang dapat diukur secara
fluorometris. Hal ini biasanya dianalisis dengan menggunakan 360-365 nm sebagai panjang
gelombang eksitasi dan 460-480 nm sebagai panjang gelombang emisi. Dalam kondisi standar
dan tidak adanya zat fluoresensi lainnya, fluoresens sebanding dengan ini tiokrom yang hadir
demikian juga dengan konten tiamin (Gubler 1991). Prosedur telah divalidasi dan diterima secara
internasional sebagai metode standar oleh Association of Official Analytical Chemists (AACC:
metode AACC 86-80) dan the International Association of Cereal Science and Technology (ICCStandard no 117:. ICC 1990).
Metode AOAC diterima secara internasional oleh komunitas kimia analitis. Metode-metode
standar ini menawarkan keuntungan untuk menjadi mapan dan dapat diandalkan. Mereka dapat
digunakan secara cepat dan ekonomis, dan akibatnya berlaku pada penentuan rutin tiamin
(Ellefson 1985). Presisi diketahui secara umum sangat baik untuk prosedur kimia tersebut.
Ekstraksi dan uji tiamin menurut metode fluorometrik (metode AOAC 953,17: 1990a
AOAC) dapat diringkas sebagai berikut: persiapan sampel, pengasaman (homogen dengan 0,1 M
HCL), autoklaf (20 menit, 109oC), sentrifugasi (20 min, 3500 rpm), oksidasi menggunakan
K3Fe(CN)6, ekstraksi (isobutil alkohol) dan penentuan tiokrom (pengukuran fluorosensi
menggunakan panjang gelombang eksitasi yang diatur pada 365 nm dan panjang gelombang
emisi pada 435 nm). Pengukuran tiokrom didasarkan pada kenyataan bahwa tiokrom larut dalam
isobutil alkohol (IUPAC nomenklatur: 2-metil-1-propanolol) dan hasil yang sangat konstan di
bawah kondisi standar (Ellefson 1985). Solusi sulfat kina digunakan untuk menilai
reproduktifitas.
1.2 Metode HPLC dengan UV dan Deteksi Fluorosensi
HPLC dengan UV dan deteksi fluoresensi adalah teknik yang paling umum digunakan saat
ini. HPLC adalah teknik yang lebih disukai untuk pemisahanan vitamin karena selektivitas yang
tinggi. Membalikkan - kromatografi fase pada dukungan kolom C18 dengan fase gerakan
isotaktik bekerja secara efisien untuk resolusi thiamin.
Dalam kebanyakan matriks sampel makanan, pengobatan asam dan/atau enzimatik, butuh
untuk melepaskan thiamin dari fosfat dan protein. Asam dan enzim yang berbeda telah diusulkan,
termasuk hidroklorat, asam trikloroasetat dan sulfat. Enzim tunggal seperti papain dan pepsin,
atau campuran enzim seperti Takadiastase atau claradistase. Hidrolisis menggunakan pasangan
clara diastase dengan asam klorida telah membuktikan pengobatan yang paling efisien.
Deteksi ultraviolet pada 245-254 nm tidak cukup sensitif untuk tingkat tiamin yang terjadi
secara alami, TMP, TPP dan TPP dalam makanan, dan karena itu lebih banyak digunakan untuk
makanan yang diperkaya. Meskipun beberapa metode memungkinkan penentuan tiamin secara
langsung oleh HPLC dengan deteksi UV, kandungan vitamin rendah, penyerapan molar yang
sangat rendah dari tiamin dan kuantitas yang tinggi mengganggu senyawa dalam bahan makanan
berarti bahwa analisis tiamin yang lebih baik diperoleh ketika didahului oleh oksidasi pada
tiokrom baik dengan pra-atau pasca-reaksi kolom dengan atau tanpa ekstraksi menjadi alkohol
isobutil dengan pemilihan waktu yang tepat dan ketika analisis akhir dilakukan dengan
menggunakan HPLC dengan deteksi FL.
Derivatisasi pra kolom biasanya digunakan, walaupun derivatisasi pasca kolom yang harus
lebih nyaman untuk analisis rutin, tidak sering diterapkan. Dalam kasus ini, pemisahan thiamin
memerlukan penggunaan pasangan ion kromatografi cair karena tidak dipertahankan dalam
pembalikkan - kolom fase (Blake 2007). Teknik ini juga meningkatkan sensitivitas dan
reproduktifitas uji tiamin.
Penentuan tiokrom melibatkan dua masalah yang terkait dengan ketidakstabilan tiokrom itu
sendiri dan untuk masalah kromatografi terkait dengan kelebihan mengoksidasi reagen. Masalah
sebelumnya dapat diselesaikan dengan penambahan asam ortofosfat, yang meminimalkan
pembentukan disulfida thiamin dan menstabilkan tiokrom. Masalah kedua dapat diatasi dengan
fase padat pembersihan kromatografi menggunakan kartrid C18 atau dengan mengekstraksi
tiokrom yang menjadi alkohol isobutil sesegera mungkin setelah terbentuk. Untuk analisis akhir,
fase terbalik HPLC menawarkan hasil terbaik, meskipun solusi harus segera disuntikkan setelah
pembentukan tiokrom. Kolom kromatografi yang paling umum digunakan adalah C18 dan C8.
Fase pergerakan, termasuk pelarut organik, pasangan ion dan campuran penyangga air organik,
juga telah digunakan. Sebagian besar metode yang dioptimalkan untuk vitamin tunggal dan
mungkin melibatkan kolom dan peralatan yang tidak umum. Masalah tambahan adalah kurangnya
standar internal yang cocok untuk thiamin dan juga solusi standar eksternal yang telah mengalami
prosedur yang sama seperti sampel yang biasanya digunakan untuk kuantifikasi tiamin. Metode
HPLC representatif untuk analisis tiamin tercantum dalam tabel 17.2
ANALISIS TIAMIN DENGAN METODE MULTIVITAMIN DENGAN POTENSI UNTUK
MENINGKATKAN KINERJA DI MASA DEPAN
Meskipun estimasi kadar vitamin harus diperoleh lebih tepat dengan pendekatan 'satu
vitamin pada satu waktu', penentuan yang bukan hanya vitamin tunggal dalam makanan dan
suplemen yang diperkaya juga dapat menjadi perhatian besar. Karena berbagai vitamin larut air
harus ditentukan dalam produk makanan yang diperkaya, penggunaan metode multivitamin akan
menguntungkan terutama untuk pemantauan kepatuhan. Di AS, pendekatan pertama sering
dilaporkan cocok untuk pemantauan kepatuhan produk sedangkan di Eropa suatu pendekatan
adalah untuk menentukan konten vitamin total, yang melibatkan prosedur ekstraksi yang lebih
kompleks dan mengkonsumsi waktu. Sebuah presipitasi sederhana dari protein dengan zine asetat
dan phosphotungstate, asam perklorat atau asam trichloric diikuti dengan sentrifugasi atau filtrasi
mungkin cukup untuk matriks seperti susu formula atau minuman yang diperkaya, tetapi
pendekatan ini tidak cukup untuk produk makanan yang kompleks seperti sereal atau makanan
hewan peliharaan(Blake, 2007). Oleh karena itu untuk analisis tiamin yang dilakukan bersamasama dengan B2, B3, nicotinamide dan asam folat, hidrolisis asam biasanya diikuti oleh hidrolisis
enzim yang biasanya diperlukan (Vinas, et, al 2003). Beberapa kelompok peneliti telah
menguraikan metode multivitamin untuk uji vitamin B dalam susu formula bayi dan produk yang
diperkaya lainnya menggunakan kromatografi cair dengan deteksi tandem mass spectrometry
(LC- MS/MS), micellar liquid chromatography (MLC) ,liquid chromatography / diode array
detection – mass spectrometry (LC-DAD/MS) ,liquid chromatography /electrospray ionization –
mass spectrometry (LC/ESI-MS) or liquid chromatography isotope dilution mass spectrometry
( LC- IDMS) sistem yang menawarkan sensitivitas dan selektivitas yang lebih baik.
Fase metode HPLC terbalik dengan deteksi UV (RP -HPLC-UV) telah terbukti cocok untuk
pemantauan simultan dari vitamin B1, B2, B3, B6, B9, dan C tanpa menggunakan reagen
pasangan ion. Metode kromatografi ini dikombinasikan dengan metode persiapan sampel yang
dioptimalkan, berbeda dengan prinsip deteksi yang tidak ditentukan dan sampel bersih yang tidak
cukup, menunjukkan solusi sederhana dan rendah biaya untuk skrining beberapa kelompok
vitamin B, termasuk tiamin, pada biaya yang sama dengan pengukuran sebuah vitamin C tunggal
dalam produk makanan yang diperkaya (Engel et, el, 2010).
Fase HPLC terbalik dengan elektrokimia kuolometri dan deteksi UV (RP-HPLC ED-UV)
telah secara sukses diterapkan untuk penentuan simultan tiamin, vitamin B6 (pyridoxamine,
prydoxal, dan prydoxine) dan vitamin B12 dalam jangka tunggal jus buah. Metode menawarkan
linearitas, pengulangan dan reproduktifitas yang baik, serta waktu analisis yang relatif singkat.
Penentuan tiamin pada jus buah telah dilakukan dalam aliran yang berkelanjutan di wilayah UV
mengakibatkan kurangnya sinyal dari campuran substansi dalam rentang konsentrasi 22-8200
ng/ml dengan batas deteksi 9,2 ng/ml (Lebiedzitiska, et, al. 2007).
Metode LC-IDMS adalah pendekatan yang sangat baik untuk membangun nilai-nilai
referensi dan dapat berguna dalam metode penyelidikan dan validasi. Versi berlabel secara
isotopis dari tiamin digunakan dalam studi yang dilakukan oleh Goldschmidt dan Wolf (2010)
adalah 4,5,4 metil- 13C3 - tiamin klorida. Namun, karena biaya dan kompleksitas, metode IDMS
secara umum tidak cocok untuk analisis rutin.
LC-MS/MS memberi kemungkinan melakukan beberapa pengukuran analitis secara
simultan. Metode ini telah terbukti memiliki sensitivitas dan spesifisitas tinggi, dan memiliki
aplikasi luas di berbagai bidang termasuk analisis makanan dan gizi. Beberapa data yang
diperoleh LC-MS/MS untuk susu formula bayi biasanya menunjukkan nilai yang sedikit lebih
rendah dibandingkan dengan yang diperoleh dengan metode mikrobiologi saat ini. Mengingat
bahwa LC-MS/MS memiliki spesifisitas yang lebih tinggi daripada metode mikrobiologi, hasil
yang lebih tinggi diperoleh dengan metode mikrobiologi yang disebabkan oleh reaktivitas silang
bakteri (Huang et al 2009).
MLC menawarkan sejumlah keunggulan dibandingkan dengan metode kromatografi lainnya
termasuk biaya rendah, toksisitas rendah, volatilitas yang rendah dari konstituen fase pergerakan,
kemungkinan simultan senyawa ionik dan non ionik, dan jarangnya pemisahan selektivitas karena
keterlibatan sejumlah besar parameter (Ghorbani et al, 2004)
METODE ELEKTROKIMIA
Kelompok besar lain dari metode praktek yang digunakan untuk menentukan tiamin
bersama-sama dengan vitamin B2 dan vitamin C adalah metode elektrokimia. Metode voltametri
analisis telah menarik perhatian karena sensitivitas yang tinggi, kesederhanaan dan waktu analisis
yang relatif singkat, dan adanya kemungkinan menggunakan peralatan murah. Tiamin telah
secara simultan ditentukan dengan vitamin B2 dan vitamin C pada elektroda logam seperti emas,
platinum, hanging mercury drop electrode (HMDE) and dropping mercury electrode (DME)
(Aboulkasim, 2006)
Dalam hal persyaratan validasi di elektroanalisis rutin vitamin, hanya elektroda merkuri
terbaru yang digunakan. Tetapi meskipun kinerja analisis mereka besar, peningkatan risiko yang
terkait dengan penggunaan, manipulasi dan pembuangan logam merkuri telah menyebabkan
pencarian sensor altenative (Bas, et, al 2011). Penentuan kuantitatif tiamin bersama-sama dengan
vitamin B2, C, E dan kuersetin telah terbukti efektif menggunakan voltametri diferensial
berdenyut dengan film merkuri sebagai indikator elektroda (Slepehenko et, al 2005)
Baru-baru ini, elektroda berbasis perak film merkuri yang disegarkan (Hg(Ag)FE) telah
disarankan untuk dapat diterapkan pada penentuan vitamin B1, B2, C. Bas et al (2011) berhasil
menerapkan perak film amalgam cair baru yang dimodifikasi perak padat amalgam annular band
elektroda (AgLAF-Ag SAE) untuk penentuan tiamin bersama-sama dengan vitamin B2 dan C
dalam produk farmasi dan jus buah yang tersedia secara komersial dengan menggunakan
adsorptive stripping voltammetry (AdSV). Sampel jus dianalisis tanpa persiapan sebelumnya dan
konsentrasi tiamin yang diukur berkisar dari 0,01 ke 0,1 mg/ml dengan batas deteksi 0,003
mg/ml. Penggunaan elektroda AgLAF-AgSAE tidak menimbulkan masalah yang signifikan
dengan pembuangan dan toksisitas merkuri - tidak seperti elektroda merkuri cair. Selain itu,
elektroda AgLAF-AgSAE terbukti stabil terhadap penentuan bersama tiamin, vitamin B2 dan
vitamin C karena tidak rusak selama penurunan/oksidasi vitamin
UJI HEWAN (METODE BIOLOGIS)
Tiamin dapat menumpuk di semua sel tubuh tetapi pada hakikatnya tidak ada satu situs
penyimpanan khusus. Tubuh tidak menyimpan vitamin dan dengan demikian pasokan harian yang
dibutuhkan. Tes hewan digunakan untuk menentukan ketersediaan thiamine dalam sumber
makanan. Mereka didasarkan pada efek dari tiamin pada pertumbuhan dan evolusi penyakit yang
berhubungan dengan kurangnya pengaruh tiamin. Kekurangan tiamin dikaitkan dengan anoreksia,
jaringan pembuangan, fungsi jantung yang terganggu, kelemahan dan kelainan neurobiologis,
yang semuanya adalah gejala klasik dari beri-beri. Tes hewan hampir tidak pernah digunakan,
karena mereka memakan waktu (6-8 minggu) dan memperburuk reproduksi. Hewan percobaan
termasuk tikus, merpati, dan ayam, meskipun tikus lebih banyak dipilih (Caster dan Meadows
1980). Materi yang diuji memungkinkan pengukuran efek kuratif dari sumber makanan pada
tikus yang telah membuat kekurangan tiamin dan membandingkannya dengan efek kuratif
hidroklorida tiamin sintetis murni.
UJI MIKROBIOLOGI
Dalam uji mikrobiologi, tiamin ditentukan berdasarkan respon pertumbuhan mikroorganisme
yang bergantung pada tiamin. Bakteri, seperti Lactobacillus fermentum, diinokulasi ke dalam
ekstrak makanan. Setelah beberapa jam inkubasi, kekeruhan sesuai dengan pertumbuhan bakteri
diukur dengan menggunakan spektrofotometer pada 660 nm. Uji mikrobiologi berguna untuk
mengukur isi tiamin total dalam makanan, tetapi hal itu memiliki kekurangan. Komposisi
vitamers tiamin dalam makanan tidak dapat dipastikan dari penghambatan bakteri, karena respon
pertumbuhan bakteri tidak membedakan vitamers. Umumnya, konsentrasi tiamin ditentukan
dengan menggunakan uji mikrobiologi yang lebih tinggi daripada menggunakan fluorometry atau
HPLC.
UJI FLUOROMETRIK
Spektrofotometri fluorometrik telah menjadi teknik AOAC yang direkomendasikan untuk
menentukan tiamin sejak tahun 1960. Intensitas tiokrom sebanding dengan jumlah tiamin yang
hadir ketika ditentukan pada 365 nm dari panjang gelombang eksitasi dan 425 nm panjang
gelombang emisi. Konsentrasi tiamin kemudian dihitung menggunakan standar kalibrasi eksternal
untuk menghasilkan pengukuran total tiamin.
KROMATOGRAFI CAIR BERTEKANAN TINGGI
HPLC adalah teknik pemisahan yang memanfaatkan interaksi diferensial analit dengan fase
diam dan fase gerak. Peamisahan kromatografi vitamers tiamin memungkinkan tiamin bebas dan
individu memfosforilasi bentuk tiamin untuk diidentifikasi dan diukur. Menggunakan HPLC,
memungkinkan untuk secara bersamaan memisahkan semua vitamin dari B kompleks, dan ini
berguna untuk mengukur multivitamin dalam suplemen diet. Vitamin B kompleks dalam berbagai
matriks makanan juga dapat secara bersamaan dianalisis. Karena berbagai sifat fisikokimia dan
stabilitas vitamin dalam makanan, protokol ekstraksi yang berbeda harus dilakukan untuk
beberapa vitamin.
Analisis tiamin HPLC didasarkan pada kromatografi pasangan ion, jenis kromatografi fase
cadangan, digunakan untuk pemisahan dan penentuan spesies ion. Fase gerak terdiri dari
penyangga air yang mengandung kedua organik pelarut dan ion kontra. Karena ion kontra
bergabung dengan tiamin atau tiokrom untuk membentuk pasangan ion netral, ini kemudian
ditahan pada kolom fase terbalik. Sistem fase pergerakan cocok untuk kolom fase terbalik antara
metanol, hexanesulfonate, dan/atau octanesulfonate. Kolom fase normal, serta kolom fenil, juga
telah digunakan untuk analisis tiamin, meskipun mereka tidak banyak digunakan.
HPLC dapat dihubungkan dengan beberapa mode deteksi, misalnya, UV, UV-Vis (uji dioda),
fluoresensi, Fourier transform infrared (FTIR), dan spektrometri massa electrospray. Tiamin
terdeteksi dan diidentifikasi berdasarkan waktu retensi, panjang gelombang dalam serapan
maksimum (UV), UV-Vis spectrum (uji dioda), dan eksitasi/panjang gelombang emisi
(fluoresensi). Deteksi UV berguna untuk mengukur tingkat tinggi thiamine dalam makanan dan
suplemen diet yang diperkaya. Deteksi fluoresensi cocok untuk mendeteksi konsentrasi rendah
dari tiamin yang terjadi secara alami, karena menawarkan sensitivitas yang lebih baik daripada
detektor UV. Untuk deteksi fluorometric, tiamin teroksidasi untuk neon tiokrom baik pra kolom
atau (online) pasca kolom.
PRA- DAN POSTCOLUMN OKSIDASI TIAMIN
Van de Weerdhof et al. pertama kali merintis penggunaan detektor fluoresensi untuk
menentukan tiokrom setelah oksidasi postcolumn dengan kalium heksasianoferat [K3Fe (CN) 6].
Komposisi fase gerak adalah 0,1 M bufer fosfat (pH 6,8) dan 10% metanol. Menambahkan
metanol sebagai pengubah organik dalam fase gerak umumnya meningkatkan pembentukan
tiokrom dan memproduksi intensitas sinyal yang lebih tinggi. Reproduktifitas sinyal membaik
dengan penambahan 12% metanol, ketika lebih dari 12% metanol menyebabkan puncak
asimetris. Sebuah sistem fase pergerakan dengan pH > 4,0 menahan (teroksidasi postcolumn)
tiokrom yang lebih panjang, berbeda dengan pH antara 2,0 dan 3,0. Sebuah oksidasi postcolumn
tiamin metabolit, 2- (1-hidroksietil) tiamin, pertama kali diidentifikasi oleh Ujiie et al., pada ikan
dan daging, selama tahun 1990. Metabolit ini dinyatakan secara kuantitatif dianalisis sebagai
tiamin ketika oksidasi pra kolom dilakukan. Makanan berbasis hewani mengandung 7-24%, 2-(1hidroksietil) tiamin, dan dalam ragi, itu membuat 37% dari total tiamin. Dengan meluasnya
penggunaan kolom fase terbalik, oksidasi tiamin dilakukan pra kolom daripada postcolumn,
karena meningkatkan sensitivitas. Keterbatasan derivatisasi pra kolom adalah bahwa tiokrom
harus dianalisis segera untuk meminimalkan degradasi (karena ketidakstabilan yang melekat).