Isolasi dan karakterisasi cDNA hormon pertumbuhan ikan kerapu

II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Ikan Kerapu
2.1.1. Biologi Kerapu Bebek
Ikan kerapu bebek (Cromileptes altivelis) termasuk dalam famili Serranidae
yang mempunyai bentuk tubuh memanjang gepeng (compressed) dan panjang
bisa mencapai 1 meter dengan tubuh tertutup oleh sisik-sisik kecil (Gambar 1).
!h.tJ. kerapu di dunia intemasional dikenal sebagai groupers, rocleod, hinds dan
sea basses yang tergolong dalam sub famili Epinephelinae dengan 15 genus dan
159 spesies. Adapun klasifikasi kempl! bebek menurut Heemstm and Randa!!
(1993) yaitu :
Sub filum : Vertebrata
Kelas
: Teleostei
Sub kelas : Osteicanthopterygii (Actinopterygii)
Ordo
: Perciforma
Sub ordo
: Perciodea
Famili
: Serranidae
Genus
: Cromileptes
Spesies
: Cromileptes altivelis
Gambar L Morfologi ikan kerapu bebek (Cromileptes altivelis)
Ikan kerapu bebek ini mempunYai banyak nama lokal. Ikan ini di Australia
dikenal dengan nama Baramundi cod, Sarasa-hata (Jepang), Lapu-Lapung
Senorita (Tagalog, Pilipina), Polka-dot grouper. Sedangkan di Indonesia dan
4
Malaysia, ikan ini dikenal dengan nama kerapu bebek, kerapu tikus, kerapu belida
dan kerapu sonoh (Heemstra and Randall 1993).
Heemstra & Randall (1993) menyatakan bahwa seluruh permukaan tubuh
kerapu bebek berwama putih keabuan, berbintik bulat hitam serta moncong
kepala lancip menyerupai tikus atau bebek. Kelompok groupers, termasuk kerapu
bebek memp~myai masa hidup yuang panjang hingga 50 tahun dengan
perturnbuhan dan pematangan yang lambat (Huntsman et al. 1999). Kerapu bebek
mempunyai strategi seksual protogini di mana ikB.r1 ini pertB.mB. hE mata!'.g
sebagai betina kemudian berubah kelamin menjadi jantan (Sadovy 1996). Kerapu
bebek ternB.suk ke rh1am predator yang d0minan pada habitat karang denga!'.
makanan utamanya adalah ikan, krustasea dan cephalopoda (Heemstra and
Randall 1999)
2.1.2. Habitat
Ikan kerapu bebek terse bar luas di Pasifik Bara!, mulai Jepang bagian
selatan sampai Palau, Guam, Kaledonia Barn, kepulauan Australia bagian selatan
serta Laut India bagian timur dari Nicobar sampai Broome. Di Indonesia, ikan
kerapu bebek banyak ditemukan di wilayah perairan Teluk Banten, Ujung Kulon,
Kepl.1R.lUall
Rial.l,
Kepulauan
Seribl.l,
Kepulauan
Karimunjawa,
Madura,
Kalimantan dan Nusa Tenggara (Heemstra & Randall 1993).
Menurut Kuiter (1992), ikan kerapu bebek tergolong ibn kamivora, hidup
soliter dan banyak terdapat di daerah terumbu karang serta muara sungai. Utoyo
et al. (1999) menyatakan bahwa ikan ini hidup secara soliter pada daerah terurnbu
karang yang berasosiasi dengan jenis Porites sp., Acropora sp., Foliosa, Sponge,
Pinctada dan Tridacna. Kerapu bebek banyak dijumpai pada perairan berbatu
karang, atau karang berlurnpur dengan kedalaman 40 sampai 60 meter. Ikan ini
menghin<lari pengaruh matahari langsung dengan
membuat naungan sebagai
tempat bersembunyi. Dalam siklus hidupnya, ikan kerapu bebek muda hidup di
perairan karang dengan kedalaman 0,5-3 meter, kemudian saar dewasa menuju ke
perairan lebih dalam, dimana perpindahan ini biasanya terjadi pada siang dan
senja hari. Tell.lf dan larva kerapu bebek bersifat pelagis, sedangkan kerapu muda
hingga dewasa bersifat demersal (Tampubolon dan Mulyadi 1989) Ikan ini
5
termasuk dalam kelompok stcnohaline sehingga mampu beradaptasi pada
lingkungan perairan yang berkadar garam rendah (Breet & Groves 1979).
2.2. Hormon Pertumbuhan
2.2.1. Hormon dan Sistem Regulasi
Horman adalah bahan kimia pembawa sinyal yang dibentuk dalam sel-sel
khusus pada kelenjar endokrin. Hormon disekresikan ke dalam darah kemudian
disalurkan ke organ-organ yang menjalankan fungsi-fungsi regulasi tertentu
secara fisiologik dan biokimia. Sel kelenjar yang khusus mensintesis harmon dari
prekursomya dapat menyimpan dan mensekresikannya ke dalam aliran darah
sesuai kebutuhan. Horman dan metaboliknya dikeluarkan melalui sistem ekskresi,
kebanyakan melalui ginjal. Sel-sel sasaran pada organ sasaran memiliki reseptor
yang dapat mengikat hormon, sehingga informasi yang diperoleh dapat diteruskan
ke sel-sel dan akhimya menghasilkan suatu respon (Kooiman & Rohm 2001).
Pesan hormon disampaikan pada sel-sel sasaran menurut dua prinsip yang
berbeda. Hormon lipofilik masuk ke dalam sel dan bekeIja pada inti sel,
sedangkan hormon hidrofilik bekeIja pada membran sel. Horman steroid dan
tiroksin termasuk dalam kelompok hormon lipofilik. Horman ini menembus
membran sel dan berikatan pada suatu reseptor spesifik di dalam sel sasaran.
Kelompok hormon hidrofilik merupakan harmon yang tersusun dari asam amino,
semua peptida dan proteohormon. Hormon-hormon hidrofilik berikatan pada
bagian luar sel sasaran pada reseptor spesifik yang difiksasi di dalam membran sel
(Kooiman & Rohm 2001).
Hormon pertumbuhan merupakan salah satu kelompok harmon hidrofilik
karena harmon ini merupakan suatu polipeptida. Horman peptide tersusun atas
asam-asam amino. Horman ini mengikat permukaan sel reseptor, sehingga tidak
masuk ke dalam sel (Gambar 2). Komplek yang dihasilkan akan mengaktifkan
enzim yang mengkatalis sintesis AMP siklik dari ATP. AMP siklik mengaktifkan
enzim lain yang tidak aktif. AMP siklik merupakan pembawa pesan kedua
(second messenger), sedangkan hormon adalah pembawa pesan pertama
(http://facultv.clin(ol1cc.sUI1\ .cd 11).
6
Luar sel
dalam sel
~
pA TP
honnon peptida _
reseptor
-'r--.~ cAMP _
Gambar 2. Mekanisme keIja hormon peptida U:,
enzim non aktif
enzim aktif _
reaksi
kimia
.!"elL
2.2.2. Sekresi Hormon Pertumbuhan (GH)
Hormon pertumbuhan (GH) atau disebut juga somatotropin merupakan
hormon polipeptida yang diJepaskan dari adenohipofisa yang menginduksi hati
agar mensintesis somatomedin yang berperan langsung dalam pertumbuhan, baik
pertumbuhan tulang, otot maupun sel-sel yang lain. Hormon ini menunda
katabolisme asam-asam amino dan memacu inkorporasinya ke dalam proteinprotein tubuh. Kerja somatototropin dipermudah oleh hormon pankreas, korteks
adrenal dan tiroid yang bekelja bersama-sama dalam memacu metabolisme lemak
dan karbohidrat (Calduch-Giner et a1. 2000; Walsh 2002). Walsh (2002)
menyatakan bahwa hormon ini memacu retensi tubuh berbagai mineral dan
elemen esensial lain untuk pertumbuhan normal. Selain itu GH mempunyai
peranan penting dalam adaptasi terhadap air laut, reproduksi dan fungsi imun
(Calduch-Giner et a1. 2000). Hormon somatotropin mempunyai peranan yang
penting pada proses transfer asam amino ekstraseluller melintasi membran sel,
khususnya ke dalam sel-sel otot dan menahan asam amino tersebut tetap di dalam
sel. Menurut Matty (1985), GH mampu meningkatkan nafsu makan, konversi
pakan,
sintesis
protein,
menurunkan
kehilangan
nitrogen,
merangsang
metabolisme lemak, oksidasi dan memacu sintesis dan pelepasan insulin.
GH merupakan protein pituitari dengan berat molekul 22 kDa dan
konservatif akibat aksi pleitropik selarna evolusi vertebrata (Calduch-Giner et a1.
2000). Ganong (1983) menambahkan bahwa GH merupakan salah satu hormon
7
polipeptida yang disekresikan oleh somatotroph pada bagian anterior kelenjar
pituitari. Price & Wilson (1995) dan Walsh (2002) mengemukakan bahwa sekresi
GH dari pituitari diatur oleh regulator hipotalarnik yaitu
GHRF (Growth
Hormone Releasing Factor). Pelepasan GH dapat dirangsang oleh kondisi
hiplogikemia dan asarn amino seperti arginina (Price & Wilson 1995). Pelepasan
horrnon ini diharnbat oleh faktor hipotalamik kedua yaitu horrnon penghambat
pelepasall GH atau yang dikenal dengan somatostatin.
5-HT
'--------J:'
SRIF
1
Penghambat
Aa~
~
'\
~
~
-I
~
>;a
Somatotroph
~
-
U
Stimulasi
CCK : kolesistokinin; DA : dopamin; GRF : GH-releasing factor; GnRH : Gonadotropinreleasing homlOne; NPY : neuropeptide Y: NE : norepinephrine; 5-HT : serotonin; SRIF :
somatostatin; TRH : thyrotropin releasing hormone).
Garnbar 3. Model pengaturan neuroendokrin multifaktor sekresi horrnon
pertumbuhan (GH) pada ikan mas dan koki. (Peter & Marchant
1995).
Peter & Marchant (1995) mengemukakan bahwa sekresi GH terjadi oleh
pengaruh multifaktor, baik yang bersifat memacu ataupun mengharnbat. Hal ini
digarnbarkan secara ringkas pada Gambar 3. Pemacu utama sekresi hormon
pertumbuhan yaitu GHRF, cGnRH-Il dan dopamin. Hasil pengujian secara in
vitro menunjukkan potensi stimulasi GH oleh kolesistokinin (CCK), neuropeptide
Y (NPY) dan horrnon pelepas tirotropin (Tyrolropin Releasing Hormone ITRH).
Sedangkan somatostatin, norepineprin dan serotonin menghambat sekresi GH
secara langsung. Norepineprin dan serotonin dapat mendorong sekresi GH secara
tidak langsung melalui aksi stimulasi pada GnRH yang kemudian menstimulasi
sekresi GH.
8
Faktor-faktor
ekstrinsik
seperti
photoperiod
dan
temperatur
dapat
mempengaruhi kandungan GH pada pituitari yellow perch (Robert et al. 2004).
Pada Eurasians perch (Perca fluviatilis) kandungan GH pituitari mencapai level
maksimum di bulan Mei/Juni saat photoperiod terpanjang (Swift & Pickford
1965). Jourdan et al. (2000) menambahkan bahwa photoperiod (18:6 atau 24:0
L:D) mampu meningkatkan pertumbuhanjuvenil Eurasian perch.
2.2.3. Aksi Hormon Pertumbuhan
Walsh (2002) menyatakan bahwa GH mengenali efek anaboliknya dengan
pengikatan ke reseptor permukaan sel spesifik. Reseptor tersebut terdiri dari 3
bagian, yaitu : pengikatan ligand ekstraseluler, transmembran dan efektor
intraseluler. Bentuk potongan bagian ujung reseptor GH, tepatnya bagian
pengikatan ligand ekstraseluler ditemukan pada serum. Serum protein ini mampu
mengikat GH dan berperan penting dalam tubuh. Reseptor GH telah terdeteksi
pada banyak jaringan. Setelah tahap larva, lokasi pengikatan GH spesifik telah
terdeteksi pada beberapa jaringan ekstra hepatik rainbow trout (seperti : testis,
otot, otak, insang, jaringan adipose, limpa dan tulang rawan) (Perez-Sanchez et 01.
1991, Yao et 01. 1991). Pengukuran reseptor GH (GHRs) pada hepatik, tingkat
sirkulasi GH dan IGFs merupakan parameter yang berguna untuk memonitor
status nutrisi dan performan pertumbuhan (Peter & Marchant 1995). CalduchGiner et of. (2000) menambahkan bahwa hati merupakan target jaringan
terpenting untuk aksi langsung GH. Meskipun demikian, pada ikan maupun
vertebrata yang lebih tinggi, pengikatan GH banyak teljadi di jaringan seperti
testis, otot, insang, jaringan adipose, limpa, sistem saraf pusat dan sel
haemopoetik.
Aksi somatogenik GH dimediasi oleh IGF-I, meskipun demikian efek
langsung GH adalah terhadap pertumblli1.an jaringan. GH dan IGF-I bertindak
bersama-sama untuk memacu pertumbuhan setelah penetasan (post-natal) di mana
GH memulai diferensiasi stem cell, dan IGF-I sebagai media clonal expansion
(Issakson et 01. 1985). Selain itu fungsi GH dimediasi oleh protein kinase (Ralph
et al. 1990). Peter & Marchant (1995) mengemukakan bahwa IGF-I menstimulasi
9
sintesis proteoglikan tulang rawan (cartilage), dimana GH bergantung pada IGF-I
dalam aksi ini.
Produksi GH
Ekstrapituitari
Produksi GH Pituitari
(Sistemiklaksi endokrin)
.........
Efek Iangsung
........
······Bfek tdk langsung
Aksi 10kal
(autokri nlparakrin)
..•......
'.
-'-
........
....
IGFs
Liver
-'.....
....'.
".
-. .'...
~
Pertumbuhan
Jaringan
Gambar 4. Aksi autokrinlparakrin dari honnon pertumbuhan (GH) (PerezSanchez & Le Bail 1999).
Honnon pertumbuhan mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan jaringan,
baik secara langsung maupun tidak (Gambar 4). Honnon ini berpengaruh utama
pada hati, yang selanjutnya menstimulasi sintesis somatomedin atau insulin-like
growth factor-l (IGF-I). Pada tahap awal perkembangan vertebrata, aksi
somatogenik GH mempunyai efek langsung yang lebih besar dari IGFs hepatik.
Efek sistem yang dimediasi oleh IGFs hepatik secara luas dipengaruhi oleh
manipulasi lingkungan dan makanan (Perez-Sanchez & Le Bail 1999). Laju
perturnbuhan pada ikan budidaya mungkin distimulasi oleh faktor neuroendokrin
yang
ditambahkan ke
pakan, preparasi rekombinan GH, atau dengan
memproduksi transgenik GH ikan (Peter & Marchant 1995).
2.3. Teknologi DNA Rekombinan
Teknologi DNA rekombinan (kloning gen) merupakan penyisipan ke vektor
DNA (umumnya plasmid) untuk membentuk molekul DNA baru yang
diperbanyak pada sel inang (Glick & Pasternak 2003). Kloning gen dapat
dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu : (a) isolasi asam nukleat (gen), (b)
penyisipan gen ke dalam sistem vektor untuk membentuk vektor rekombinan, (c)
10
introduksi vektor rekombinan yang membawa slslpan ke dalam sel inang
(Suharsono,2000b).
2.3.1. Isolasi asam nokleat (gen)
Oen dapat diisolasi dengan berbagai eara yaitu (Suharsono, 2000b) :
a. Pemotongan dengan enzim restriksi
Oen yang sudah diketahui ukuran dan situs restriksinya dapat diisolasi seeara
langsung dari gel setelah dilakukan pemotongan DNA dan migrasi di dalam gel.
Untuk gen yang berada pada organisme dengan genom besar d:::pat dilakukan
dengan pembuatan pustaka genom. Genom suatu individu dipotong dengan enzim
restriksi, disisipkan ke vektor kemudian vektor rekombinan diintroduksikan ke sel
mango
b. Pembuatan eDNA
eDNA atau DNA komplementer adalah DNA yang dibuat berdasarkan mRNA
(messenger RNA). mRNA dapat di ubah menjadi eDNA dengan menggunakan
enzim reverse trancriptase.
C.
Transposon.
Transposon merupakan molekul DNA yang bisa
berpinda.~
temp at di sepanjang
kromosom. Apabila transposon menyisip pada suatu gen, maka gen tersebut tidak
dapat diekspresikan karena adanya mutasi. Oen yang bertanggung jawab terhadap
sifat yang mengalarni mutasi ini bisa diisolasi menggunakan pelaeak berupa
molekul transposon.
2.3.2. Kloning Vektor
Vektor merupakan pembawa molekul DNA sisipan dalarn pengkJonan gen
ke dalam sel inang. Beberapa jenis vektor yang dapat digunakan dalarn kloning
gen yaitu plasmid, fage, kromosom buatan dari kharnir (YAC
=
yeast artificial
chromosome) dan kosmid (cosmid). Penggunaan vektor sangat tergantung dari
tujuan pengklonan. Pembuatan pustaka eDNA dapat menggunakan plasmid
scbagai vcktomya, scdangkan pustaka genom yang mengandung fragmen besar
biasanya mcnggunakan fage, eosmid atau YAC (Suharsono, 2000b).
11
2.3.3. Introduksi Vektor
Vektor rekombinan diintroduksikan ke dalam sel inang agar dapat
mengalami replikasi (penggandaan). Bertambalmya jumlah vektor rekombinan
menyebabkan DNA yang tersisip juga mengalami replikasi. Introduksi vektor
rekombinan dapat dibedakan menjadi 2 macam yaitu transformasi dan transfeksi.
Istilah transformasi digunakan apabila vektor yang digunakan adalah plasmid,
sedangkan transfeksi menggunakan vektor virus dan turunarmya.
Keberhasilan transformasi sangat dipengaruhi oleh sifat kompeten bakteri
dalam pengambilan molekul DNA asing (Glick & Pasternak 2003). Sifat
kompeten dapat terjadi secara alami pada beberapa bakteri, seperti pada genus
Bacillus atau Streptococcus yang mempunyai mekanisme pengikatan dan
pengambilan molekul DNA secara efisien (Suharsono 2000a). Sifat kompeten
tidak dimiliki pada Eschericia coli, sehingga perlu dilakukan induksi dengan
beberapa bahan kimia dan kejutan suhu. Sel pada fase mid-log disuspensikan pada
kalsium klorida (CaCh), kemudian dipertahankan pada suhu -70°C hingga
diperJukan. Pada saat dilakukan
transformasi, sel yang membeku dicairkan
(thawing) di atas es dan dilakukan kejutan suhu 42°C selama 1-2 menit. DNA
dapat masuk ke dalam bakteri melalui pori-pori dinding dan membran yang
terbuka. Bahan kimia lain yang digunakan adalah Mg atau detergen (triton-X)
(Suharsono 2000b). Metode lain dalam transformasi adalah menggunakan kejutan
listrik yang dikenal dengan elektroporasi (Sambrook et al. 1989). Kejutan listrik
pada tegangan tertentu dalam waktu singkat dapat membuka pori-pori membran
sel inang.
2.3.4. Seleksi
Sel inang (bakteri) yang membawa DNA sisipan dapat diketahui dengan
penanda seleksi, yaitu berupa sifat ketahanan terhadap antibiotika. Bakteri yang
membawa vektor rekombinan (mengandung DNA sisipan) akan resisten terhadap
antibiotik tf!rtentu dan yang bukan vektor rekombinan akan mati. Sel inang yang
membawa vektor rekombinan yang membawa DNA sisipan atau tidak, dapat
diseleksi dengan penambahan X-gal dan IPTG pada media tumbuh, sehingga
memberikan koloni berwarna biru dan putih (Suharsono 2000b). Gen lacZ pada
vektor kIoning yang menyandi
~-galactosidase
akan mengubah molekul x-gal dari
12
tidak berwarna menjadi molekul berwama biru. Gen laeZ diinduksi oleh IPTG
(isopropil thiogalaktosida). Apabila gen lacZ tersisipi oleh molekul DNA lain,
maka lacZ tidak dapat diekspresikan, sehingga sel yang mengandung sisipan tidak
mampu merubah X-gal menjadi berwama biru. Dengan penambahan IPTG pada
media yang mengandung antibiotik, maka dapat diseleksi : (1) sel yang
mengandung plasmid, (2) sel yang mengandung plasmid dan sisipan pada daerah
lacZ, dan (3) sel mengandung plasmid dengan sisipan bukan pada daerah lacZ.