MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu

MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian
Pemuliaan dan Genetik Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi
Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian telah
dilaksanakan pada bulan Februari sampai Juli 2012.
Materi
Sampel
Sampel darah yang digunakan berasal dari sapi lokal Indonesia yang terdiri
atas sapi Bali, Aceh, Pesisir, PO, dan Katingan. Sampel tersebut merupakan koleksi
Laboratorium Genetika Molekuler Ternak dengan jumlah seperti yang tertera pada
Tabel 2 berikut.
Tabel 2. Jumlah Sampel Sapi yang Digunakan
No
1
Ternak Sapi
Asal
Bali
BIB Bali
n
16
2
Aceh
Kab. Aceh Besar
12
3
Pesisir
Kab. Pesisir Selatan
29
4
PO
BIB Lembang
32
5
Katingan
Kalimantan Tengah
40
Total
129
Keterangan: n = jumlah individu
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan untuk mengambil sampel adalah alkohol 70%, es batu
dan kapas. Bahan yang digunakan untuk mengekstraksi DNA adalah sampel darah,
Destilation Water (DW), NaCl, Proteinase-K, 1 x STE (5M NaCl, 2M tris HCl, 0,2M
EDTA), SDS 10% (sodium dodesil sulfat), CIAA, ethanol absolute, ethanol 70%,
phenol, dan buffer TE 80% (tris EDTA). Bahan yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen FSHR dengan teknik PCR-RFLP adalah sampel DNA,
destilated water (DW), buffer, MgCl2, pasangan primer fragmen Gen FSHR|Alu-1,
enzim Taq polymerase, dNTP (deoxy Nucleotida Triphosfat). dan enzim restriksi
Alu-1 serta buffernya. Bahan yang digunakan adalah produk PCR, agarose, loading
dye, marker 100 pb, enzim restriksi Alu-1, 0,5 x TBE, dan Ethidium Bromide (EtBr).
Bahan yang digunakan untuk elektroforesis produk PCR adalah produk PCR,
agarose, loading dye, marker 100pb, 0,5 x TBE, dan Ethidium Bromide.
Alat yang digunakan untuk mengambil sampel adalah jarum venoject, tabung
vacutainer 10 ml dan termos. Alat yang diperlukan untuk mengekstraksi DNA
adalah tabung eppendorf 1,5 ml, satu set mikro pipet, tip, vortexmixer, autoclave,
microsentrifuge, rotary mixer, inkubator, dan freezer. Alat yang digunakan untuk
mengamplifikasi gen FSHR|Alu-1 adalah satu set pipet mikro, tip pipet, mesin
sentrifuse, mesin thermosycler, rak dan tabung eppendorf, dan vortex. Alat yang
digunakan untuk genotyping adalah tip pipet, mikropipet 10 P Gilson, gelas kimia,
gelas ukur, stirrer, microwave, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power supply
electrophoresis 100 volt, alat foto UV trans iluminator, dan sarung tangan. Alat yang
digunakan untuk elektroforesis fragmen DNA adalah tip pipet, mikropipet, gelas
kimia, gelas ukur, stirrer, microwave, gel tray, pencetak untuk sumur (comb), power
supply electrophoresis 100 volt, alat foto UV trans iluminator, dan sarung tangan.
Prosedur
Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel dilakukan pada sapi lokal Indonesia, yaitu sapi Bali,
Aceh, Pesisir, PO, dan Katingan. Sampel darah diambil melalui vena jugularis (pada
bagian leher sapi) dengan menggunakan jarum venoject pada tabung vaccutainer
yang ditambahkan ethanol absolute dengan perbandingan 1 : 2 dan disimpan dalam
lemari es hingga akan digunakan lebih lanjut. Sampel yang digunakan dalam
penelitian ini menggunakan data sekunder yang merupakan koleksi Laboratorium
Genetika Molekuler Ternak. Sampel diperoleh dari berbagai tempat di Balai
Inseminasi Buatan.
Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan metode yang dikemukakan
oleh Sambrook et al. (1989). Pengekstraksian DNA dimulai dengan persiapan
sampel terlebih dahulu. Sebanyak 200 µl sampel darah dimasukkan ke dalam tabung
1,5 ml dan ditambahkan 1000 µl DW (destilation water). Campuran sampel darah
10
dan DW dikocok atau divortex dan didiamkan selama lima menit, kemudian
disentrifuge selama lima menit dengan kecepatan 8000 rpm. Supernatan yang
terbentuk dibuang dan seperti proses sebelumnya diulangi kembali. Tahapan
selanjutnya adalah degradasi protein dalam DNA. Penambahan Proteinase-K
sebanyak 10 µl, 350 µl 1xSTE (sodium tris-EDTA) serta 40 µl 10% SDS (sodium
dodesil sulfat) ke dalam tip mix. Campuran tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu
55oC selama 2 jam sambil dikocok perlahan menggunakan alat pemutar.
Tahapan degradasi bahan organik dilakukan dengan cara menambahkan NaCl
sebanyak 40 µl 5M, larutan fenol 400 µl dan 400 µl CIAA (chloroform iso amil
alcohol), lalu dikocok pelan dalam suhu ruang selama satu jam. Bagian akhir dari
tahapan ekstraksi DNA adalah presipitasi DNA. Proses ini dilakukan dengan
sentifugasi larutan hasil degradasi bahan organik dengan kecepatan 12.000 rpm
selama lima menit sehingga terbentuk fase DNA. Sebanyak 40 µl dari fase DNA
yang terbentuk diambil dan dipindahkan ke dalam tabung baru 1,5 ml. NaCl 5 M
sebanyak 40 µl dan ethanol absolute sebanyak 800 µl ditambahkan, kemudian
dihomogenkan dan didiamkan over night pada suhu -20oC. Molekul DNA yang
terbentuk selanjutnya dipisahkan dari ethanol absolute dengan cara disentrifugasi
pada kecepatan 12.000 rpm selama lima menit dan supernatan yang diperoleh
dibuang, kemudian ditambahkan kembali 800 µl ethanol absolute dan kembali
disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 rpm selama lima menit. Endapan molekul
DNA diperoleh dengan cara membuang bagian supernatan yang terbentuk. Endapan
tersebut kemudian didiamkan sampai kering dan disuspensikan dalam 100 µl 80%
buffer TE (tris EDTA).
Amplifikasi DNA
Amplifikasi dilakukan menggunakan metode PCR-RFLP. 1 µl sampel DNA,
10,85 µl DW, 0,3 µl primer, 0,05 µl taq polymerase, 1,5 µl buffer, 0,3 µl dNTP dan
1 µl MgCl2 dicampurkan sebagai mix untuk mengamplifikasi DNA. Tahapan
Amplifikasi invitro berlangsung sebanyak 35 siklus dengan menggunakan mesin
thermocycler. Kondisi suhu yang terjadi yakni pada saat pra-denaturasi 94oC selama
lima menit, 35 siklus dengan tahapan masing-masing siklus terdiri dari denaturasi
94oC selama 45 detik, anneling pada suhu 60oC selama 45 detik dan ekstensi pada
11
suhu 72oC selama satu menit. Tahap selanjutnya adalah ekstensi akhir 72 oC selama
lima menit.
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen FSHR|Alu-1 berdasarkan
Houde et al. (1994) adalah forward: 5’-CTG CCT CCC TCA AGG TGC CCC TC3’; dan reverse: 5’-CCC CCT AAG ACA TTT AGC CCA GAACT-3’ (Gambar 3).
1
61
121
181
241
301
Forward
atctctgcct ccctcaaggtgcccctcatc actgtgtcca agtcaaagatcctcctggtc
ctgttctacc ccatcaactcctgtgccaac cccttcctct atgccatcttcaccaagaac
ttccgcaggg atttcttcattctgctgagc aagtttggct gctatgaagtgcaagcccag
AC|CTataggt cagaaacctcatccactgcc cacaactttc atccaaggaacggccactgc
cccccAG|CTcccagggttactaatggttcc aattacacac ttatccccctaagacattta
gccaagaact aaaacacaat
Reverse
Keterangan :
AG|CT
Alel C
Alel G
: primer forward
: primer reverse
: situs pemotongan enzim Alu-I
: mempunyai basa C pada posisi basa ke 193
: mempunyai basa G pada posisi basa ke 193
Gambar 3. Posisi penempelan primer pada sekuen Posisi Penempelan Primer (cetak
tebal) pada sekuen gen FSHR|Alu-1 (gene bank accses code: L22319.1).
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari primer yang
digunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA
target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH)
pada ujung 3’ yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Perancangan primer
dapat dilakukan berdasarkan urutan DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan
protein yang dituju. Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database
GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju belum diketahui
maka perancangan primer dapat didasarkan pada hasil analisis homologi dari urutan
DNA atau protein yang telah diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang
terdekat (Handoyo et al., 2001).
Elektroforesis
Tahapan proses elektroforesis produk PCR dilakukan dengan pembuatan gel
agarose 1% terlebih dahulu, dengan cara melarutkan agarose sebanyak 0,30 g
dengan larutan 0,5 x TBE 30 ml. Larutan tersebut kemudian dipanaskan dalam
microwave selama lima menit dan distirer dengan menambahkan 2,5 µl EtBr.
Larutan yang masih cair dituangkan ke dalam cetakan gel dan sisir cetakan
12
ditempatkan di bagian tepian gel, lalu dibiarkan mengeras. Apabila gel sudah
mengeras, sisir cetakan gel diangkat sehingga terbentuk sumur-sumur. Tahapan
berikutnya, sebanyak 5 µl produk PCR dicampur dengan 1 µl loading dye
(bromothymol blue 0,01%, xylene cyanol 0,01% dan gliserol 50%) menggunakan
mikropipet dan dimasukkan masing-masing ke dalam sumur gel. 2 µl marker
dicampur dengan loading dye dan diletakkan di posisi paling kiri sumur yang
berfungsi sebagai penanda. Gel tersebut kemudian diletakkan ke dalam gel tray
elektroforesis yang berisi larutan buffer dan dialiri listrik 100 volt sekitar 30 menit.
Molekul DNA yang bermuatan negatif pada pH netral akan bergerak (bermigrasi) ke
arah positif. Gel agarose diangkat setelah proses elektroforesis selesai yang ditandai
dengan garis biru yang telah mendekati ambang batas sumur gel. Hasil panjang pita
DNA diamati dengan menggunakan sinar ultraviolet. Tahapan ini dilakukan dengan
menarik garis lurus antara posisi pita dari masing-masing sampel DNA yang ingin
diukur dengan posisi pita DNA marker.
Genotyping
Genotyping dilakukan dengan teknik analisis Restriction Fragment Lenght
Polymorphism (RLFP). Tahapan awal proses ini adalah mencampurkan produk PCR
sebanyak 5 µl ke dalam tabung 0,5 ml kemudian ditambahkan 0,2 µl enzim restriksi
Alu-1. Mix tersebut kemudian diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC.
Sampel DNA yang telah dipotong dengan enzim restriksi selama proses
inkubasi dikeluarkan dari inkubator, kemudian masing-masing tip ditambahkan
loading
dye
sebanyak
1
µl.
Masing-masing
sampel
tersebut
kemudian
dielektroforesis kembali dengan tegangan 100 volt sekitar 30 menit pada gel
agarose. Sampel DNA yang telah selesai dielektroforesis kemudian diangkat dan
diamati panjang pita DNA yang terbentuk menggunakan sinar ultraviolet. Panjang
pita yang terlihat dibandingkan dengan penanda marker untuk mengetahui
panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel dibandingkan dengan marker untuk
menentukan genotipe pita DNA. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai
satu tipe atau alel yang bersifat homozigot.
13
Rancangan dan Analisis Data
Keragaman genotipe pada masing-masing sampel dapat dilihat dari pita-pita
yang ditemukan. Masing-masing sampel dianalisis menggunakan pendekatan nilai
frekuensi genotipe, frekuensi alel, dan nilai heterozigositas.
Frekuensi Genotipe dan Alel
Frekuensi genotipe dan alel gen FSHR|Alu-1dihitung berdasarkan rumus (Nei
& Kumar, 2000) :
Frekuensi genotipe adalah Xii =
Keterangan :
xii
= frekuensi genotipe ke-ii
nii
= jumlah individu bergenotipe ii
N
= jumlah individu sampel
Frekuensi alel adalah Xi =
Keterangan :
xi
= frekuensi alel ke-i
nii
= jumlah individu bergenotipe ii
nij
= jumlah individu bergenotipe ij
N
= jumlah individu sampel
Heterozigositas
Pendugaan nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan
(He) dihitung menggunakan rumus Weir (1996) :
∑
Keterangan :
Ho
= heterozigositas pengamatan (populasi)
nij
= jumlah individu heterozigot
N
= jumlah individu yang diamati
∑
Keterangan :
He
= nilai heterozigositas harapan
xi
= frekuensi alel
q
= jumlah alel
14