BAB III METODE PENELITIAN Metode penelitian ini dilakukan

BAB III
METODE PENELITIAN
Metode penelitian ini dilakukan secara deskriptif meliputi pengambilan dan
pengolahan sampel,pembuatan simplisia, isolasi senyawa fukoidan, identifikasi
senyawa fukoidan hasil isolasi dengan menggunakan spektrofotometer UV dan
FTIR serta pengujian sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach.dengan
menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dan dianalisis dengan
model analisis probit.
3.1 Alat dan Bahan
3.1.1 Alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboratorium, desikator, lemari pengering, lemari pendingin (Toshiba), oven
listrik (Stork), penangas air, kain flannel,termometer, blender (Panasonic MX101SG1), spatula, kaca arloji, botol timbang dangkal bertutup, neraca kasar
(Salter\And EW3000B), neraca analitis (Vibra AJ), sentrifugasi (Hitachi
CF16RXII), spektrofotometer UV dan FTIR (Shimadzu), pipet tetes, aluminium
foil, vial, bejana penetasan telur Artemia salina Leach, lampu 14 watt (Hannochs).
3.1.2 Bahan
Bahan yang digunakan adalah talus rumput laut coklat Sargassum
ilicifolium (Turner) C.Agard, telur Artemia salina Leach, garam laut.Bahan kimia
yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah berkualitas proanalisis yaitu asam
klorida, etanol 96% (hasil destilasi), dan air suling.
Universitas Sumatera Utara
3.2 Pengumpulan dan Pengolahan Bahan Tumbuhan
3.2.1 Pengumpulan bahan tumbuhan
Pengumpulan bahan tumbuhan dilakukan secara purposif, yaitu tanpa
membandingkan dengan daerah lain. Umur tumbuhan yang diambil tidak
diperhitungkan.Tumbuhan yang digunakan adalah talus rumput laut coklat
Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard yang diperoleh dari pantai Poncan,
Kotamadya Sibolga, Provinsi Sumatera Utara.
3.2.2 Identifikasi Tumbuhan
Identifikasi tumbuhan dilakukan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Pusat
Penelitian Oseanografi, Jakarta, Indonesia oleh Windy (2016).Hasil identifikasi
tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman41.
3.2.3 Pengolahan bahan tumbuhan
Talus rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard
dibersihkan dari kotoran dan sisa-sisa karang yang melekat lalu dicuci dengan air
mengalir sampai bersih, ditiriskan dan disebar di atas kertas agar airnya terserap,
lalu ditimbang berat basahnya 20 kg.Tumbuhan dikeringkan dengan cara dianginanginkan di udara terbuka. Selanjutnya dikeringkan di lemari pengering pada suhu
±40oC hingga rapuh (diremas menjadi hancur), kemudian disortasi kering dan
diperoleh berat 2,4 kg, lalu diblender sampai menjadi serbuk.Serbuk simplisia
disimpan dalam kantong plastik.Bagan kerja penelitian dapat dilihat pada
Lampiran 2, halaman 42.
Universitas Sumatera Utara
3.3 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian
dilaksanakan
pada
bulan
April
hingga
November
di
Laboratorium Farmakognosi dan Laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara, Medan.
3.4 Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan pemeriksaan bentuk, ukuran,
warna, bau dan rasapada rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner)
C.Agard.
3.5 Pembuatan Pereaksi
Proses pembuatan pereaksi meliputi pereaksi asam klorida 1 N dan
perekasi asam klorida 0,1 N.
3.5.1 Pereaksi asam klorida 1 N
Sebanyak 85 ml asam klorida pekat cukupkan dengan air hingga 1000 ml
(Ditjen POM RI., 1995).
3.5.2 Pereaksi asam klorida 0,1 N
Diencerkan 8,5 ml asam klorida pro analis dicampurkan dengan akuades
dan dicukupkan hingga 1000 ml (Ditjen POM RI., 1995).
3.6 Isolasi Senyawa Fukoidan
Timbang 50 g serbuk rumput laut coklat, dimasukkan kedalam gelas beker
1000 ml. Selanjutnya diekstraksi dengan 500 ml larutan asam klorida 0,1 N pada
Universitas Sumatera Utara
suhu 100 oC selama 4 jam sambil dilakukan pengadukan setiap 10 menit. Disaring
dengan menggunakan kain flanel lalu diperas, diperoleh filtrat.Filtrat yang
diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan
dipisahkan dari filtrat dengan cara enap tuang. Selanjutnya filtrat ditambah etanol
96% dengan perbandingan (1:1) hingga terbentuk endapan, dan disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Endapan dikumpulkan di
atas kaca arloji dan dikeringkan di dalam oven pada suhu 50oC (Junaidi, et al.,
2009).Bagan kerja prosedur isolasi senyawa fukoidan dapat dilihat pada Lampiran
3, halaman 43.
3.7 Penetapan Susut Pengeringan
Sebanyak 1 g serbuk isolatfukoidan ditimbang dan dimasukkan ke dalam
botol timbang dangkal bertutup yang telah dipanaskan pada suhu 105oC selama 30
menit dan telah ditara.Serbuk diratakan dalam botol timbang dengan
menggoyangkan botol hingga merupakan lapisan setebal 5-10 mm. Kemudian
dimasukkan ke dalam oven, tutupnya dibuka dan dikeringkan pada suhu 105oC
hingga bobot tetap.Sebelum setiap pengeringan, dibiarkan botol dalam
keadaantertutup dingin dalam desikator hingga suhu kamar. Susut pengeringan
dihitungterhadap bahan awal (Ditjen POM RI, 1995).
3.8 Identifikasi Senyawa Fukoidan
Identifikasi isolat senyawa fukoidan rumput laut coklat meliputi analisis
senyawa fukoidan secara spektrofotometri UV dan spektrofotometri FTIR.
Universitas Sumatera Utara
3.8.1 Analisis secara spektrofotometri UV
Senyawa fukoidan hasil isolasi diidentifikasi secara spektrofotometri UV.
Prosedur kerja dilakukan dengan menimbang 20 mg senyawa isolat fukoidan,
dilarutkan dengan asam klorida 0,1 N dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml,
lalu dicukupkan hingga garis tanda. Diukur serapannya pada bilangan gelombang
200-400 nm. Kemudian dibandingkan dengan senyawa baku fukoidan.
3.8.2 Analisis secara spektrofotometri FTIR
Isolat fukoidan diidentifikasi secara spektrofotometri FTIR. Prosedur kerja
dilakukan dengan cara mencampurkan 1 mg serbuk isolat fukoidan dengan 10 mg
KBr digerus di dalam mortar, ditekan hingga diperoleh
pelet
kemudian
dimasukkan ke dalam alat spektrofotometer FTIR,diukur serapannya pada
bilangan gelombang 4000-400 cm-1.Kemudian dibandingkan dengan senyawa
baku fukoidan.
3.9 Pengujian Sitotoksik
Pengujian dilakukan terhadap fukoidan hasil isolasi dari talus rumput laut
coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard menggunakan larva Artemia salina
Leach dengan metode Brine Shrimp Lethality Test.
3.9.1 Pembuatan air laut buatan
Bahan yang digunakan dalam pembuatan air laut buatan adalah garam laut
tanpa yodium sebanyak 38 gram dalam 1000 ml air suling (Sahgal, et al., 2010).
Dilarutkan garam laut tanpa yodium dalam beker gelas sampai terlarut sempurna
kemudian di masukkan ke dalam labu tentukur 1000 ml dan ditambahkan air
suling sampai 1000 ml.
Universitas Sumatera Utara
3.9.2 Penetasan telur Artemia salina Leach
Disiapkan bejana penetasan yang mempunyai dua bagian bersekat.Sekat
dalam wadah tersebut di lubangi agar larva dapat berpindah dari tempat yang
gelap ke tempat yang terang.Masukkan air laut buatan kedalam bejana.Telur
Artemia salinaLeach ditaburkan secara berhati-hati (Indiastuti, et al., 2008).
Bagian wadah yang berisi telur tersebut ditutup dengan aluminium foilsedangkan
bagian wadah yang tidak ditempati telur diterangi dengan sinar lampu 14 watt
untuk menghangatkan suhu dalam penetasan. Setelah 48 jam, diambil larva udang
yang akan diuji dengan pipet tetes (Juniarti dan Yuhemita, 2009).
3.9.3 Pengujian brine shrimp lethality test
Disiapkan larutan uji yang terdiri dari isolat senyawa fukoidan dengan
konsentrasi: 1000, 100, dan 10 µg/ml, disiapkan 3 vial untuk masing-masing
konsentrasi larutan uji sehingga semuanya menjadi 9 vial dan 1 vial untuk kontrol.
Larutan induk I dibuat dengan menimbang 50 mg isolat lalu dilarutkan dengan air
suling sampai 5 ml sehingga diperoleh konsentrasi 10.000 µg/ml. Dipipet 0,5 ml
larutan induk I lalu diencerkan sampai 5 ml sehingga diperoleh larutan induk II
dengan konsentrasi 1000 µg/ml. Dipipet 0,5 ml larutan induk IIlalu diencerkan
sampai 5 ml sehingga diperoleh konsentrasi 100 µg/ml. Dipipet 0,5 ml dari larutan
konsentrasi 100 µg/ml lalu diencerkan sampai 5 ml sehigga diperoleh konsentrasi
10 µg/ml. Dimasukkan larutan uji ke masing-masing vial. Dimasukkan sedikit air
laut buatan ke dalam masing-masing vial.Dimasukkan 10 ekor larva Artemia
salina Leach, lalu ditambahkan air laut buatan sampai 5 ml. Kemudian semua vial
diletakkan di bawah cahaya lampu. Setelah 24 jam dihitung jumlah larva yang
mati (Mclaughlin dan Lingling, 1988). Selain itu, pembuatan kontrol pada air laut
Universitas Sumatera Utara
juga telah dilakukan. Dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina Leach ke dalam
vial dan dicukupkan sampai 5 ml air laut buatan tanpa penambahan isolat. Data
dianalisis dengan metode analisis probit untuk menentukan LC 50 .Bagan uji
sitotoksik dapat dilihat pada Lampiran 4, halaman 44.
3.10 PerhitunganLC 50
Uji sitotoksik dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test
menggunakan larva Artemia salina Leach terhadap larutan isolat fukoidan
sehingga diperoleh suatu data yang kemudian diolah dengan menggunakan model
analisis probit untuk menentukan nilai LC 50.
Pengukuran dilakukan dengan menghitung jumlah Artemia salina Leach
yang mati sebanyak 50 % dari total larva uji (10 ekor pada vial). Kemudian nilai
LC 50 dihitung dengan memasukkan angka probit (50 % kematian larva uji).Efek
sitotoksik dihitung dari persen kematian larva Artemia salina Leach dan
persamaan regresi linear (Rahma, et al., 2013).
a. Rumus persen kematian
% kematian =
Jumlah larva mati
x 100%
jumlah larva uji
b. Persamaan regresi linier.
y = a + bx
Keterangan:
y = Nilai probit
x = log konsentrasi
a = Intercept (garis potong)
b = Slope (kemiringan dari garis regresi linier)
Universitas Sumatera Utara
LC 50 adalah nilai antilog x yang saat y = 50%. Apabila pada kontrol ada larva
yang mati, maka persen kematian ditentukan dengan rumus Abbot:
% kematian =
T-K
x100%
10
Keterangan :
T = jumlah larva uji yang mati
K = jumlah larva kontrol yang mati
10 = jumlah larva uji
Perhitungan LC 50 fukoidan hasil isolasi dari talus rumputSargassum
ilicifolium (Turner) C. Agard dapat dilihat pada lampiran 11, halaman 56.
3.11Analisis Data Sitotoksik
Ada banyak cara untuk menentukan nilai LC 50 . Salah satu cara yaitu
dengan metode probit. Untuk menghitung LC 50 berdasarkan metode probit,
berikut merupakan langkah pembuatan perhitungan LC 50 , yaitu :
1. Mempunyai tabel probit
2. Menentukan nilai probit dari % kematian tiap kelompok hewan uji
3. Menentukan log dosis tiap-tiap kelompok
4. Menentukan persamaan garis lurus hubungan antara nilai probit dengan log
dosis, y = a+bx
5. Masukkan nilai 5 (probit 50% kematian hewan coba) pada persamaan garis
lurus, pada nilai y. Nilai LC 50 dihitung dari nilai antilog x pada saat y = 5.
Ekstrak dikatakan bersifat toksis jika harga LC 50 < 1000 ppm, sedangkan untuk
senyawa murni jika LC 50 < 200 ppm berpotensi antikanker (Meyer, et al., 1982).
Universitas Sumatera Utara
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1Hasil Identifikasi Tumbuhan
Hasil identifikasi tumbuhan dilakukan di Pusat Penelitian Oseanografi
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Jakarta, Indonesia adalah rumput
laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard, suku Sargassaceae. Hasil
identifikasi tumbuhan dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 41.
4.2 Hasil Pemeriksaan Makroskopik
Pemeriksaan karakterisasi rumput laut Sargassum ilicifolium (Turner) C.
Agard secara makroskopik dilakukan untuk memperoleh identitas simplisia.Hasil
pemeriksaan makroskopik rumput laut coklatyaitu rumput laut coklat memiliki
warna coklat, mempunyai bau khas, daun berbentuk lonjong kecil dengan
tepibergerigi, dan batang kecil berwarna coklat.Hasil pemeriksaan makroskopik
yang dilakukan terhadap simplisia rumput laut coklat yaitu simplisia berwarna
coklat tua.Hasil pemeriksaan makroskopik rumput laut coklat dapat dilihat
padaLampiran 5, halaman 45.
4.3Hasil Isolasi Senyawa Fukoidan
Isolasi senyawa fukoidan dari 550 g simplisia rumput laut coklat
Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agardmemperoleh isolat sebanyak 19,86 g
(Rendemen 3,61%). Fukoidan yang diperoleh berwarna coklat tua dan berbau
khas.Perhitungan persen rendemen fukoidan pada Lampiran 8, halaman 51.
Universitas Sumatera Utara
4.4. Hasil Penetapan Susut Pengeringan
Penetapan susut pengeringan dilakukan untuk menunjukkan jumlah air
yang terkandung dalam senyawa fukoidan.Penetapan susut pengeringan dilakukan
untuk memberikan batasan kandungan air yang masih dapat ditolerir untuk
menjaga stabilitasnya. Hasil rata-rata penetapan susut pengeringan senyawa
fukoidan adalah 19,32%. Perhitungan susut pengeringan isolat senyawa fukoidan
dari rumput laut coklat dapat dilihat pada Lampiran 8, halaman 51.
4.5Hasil Identifikasi Senyawa Fukoidan
4.5.1 Identifikasi secara spektrofotometri UV
Identifikasi senyawa isolat fukoidan dan bakufukoidan dilakukan secara
Spektrofotometri UV. Spektrum ultraviolet fukoidan hasil isolasi dari rumput laut
coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard memberikan panjang gelombang
maksimum 203,81 nm. Kurva serapan dan panjang gelombang maksimum
senyawa fukoidan hasil isolasi identik dengan senyawa baku fukoidan. Spektrum
ultraviolet dari senyawa isolat dan baku fukoidan dapat dilihat pada Gambar 4.1
dan Gambar 4.2
Gambar 4.1 Spektrum ultraviolet isolat fuko idan
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.2 Spektrum ultraviolet bakufukoidan
4.5.2 Identifikasi secara spektrofotometri FTIR
Spektrum inframerah senyawa isolat fukoidan dari rumput laut coklat
Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard dan bakufukoidan dapat dilihat pada
Gambar 4.3 dan Gambar 4.4
Gambar 4.3 Spektrum inframerah isolat fukoidan
Universitas Sumatera Utara
Gambar 4.4. Spektrum inframerah baku fukoidan
Monosakarida, ikatan glikosidik, gugus fungsional yang terdapat pada
polisakarida termasuk fukoidan dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri
FTIR (Shanti, et al., 2014). Identifikasi puncak-puncak serapan dibandingkan
antara senyawa isolat fukoidan dengan baku fukoidan menunjukkan adanya
sedikit perbedaan. Pada bilangan gelombang 3421,72 cm-1 menunjukkan adanya
pita melebar dan spesifik yang merupakan vibrasi regang untuk gugus O-H, pada
fukoidan baku juga terletak pada bilangan gelombang 3421,72 cm-1. Terdapat pita
kecil pada bilangan gelombang 2927,94 cm-1 menunjukkan gugus C-H pada
cincin piranoid, sedangkan pada senyawa baku fukoidan terletak pada bilangan
gelombang 2935,66 – 2959,66 cm-1. Pada bilangan 1238,30 cm-1 menunjukkan
adanya gugus S=O asimetris dan vibrasi C-O, sedangkan pada baku fukoidan
terletak pada bilangan gelombang 1246,02 cm-1 (Synytsya, et al., 2010). Sampel
yang mempunyai pita lebar pada bilangan gelombang 1220- 1260 cm-1
menunjukkan keberadaan gugus ester sulfat (S=O), ciri dari fukoidan (Dzul, et al.,
Universitas Sumatera Utara
2014). Bilangan gelombang 1072,42 cm-1 pada baku fukoidan menunjukkan
vibrasi regang gugus S=O simetris. Pada fukoidan isolat, bilangan gelombang
1022,27 cm-1 menunjukkan adanya gugus C-O, sedangkan pada baku fukoidan
terletak pada bilangan gelombang 1041,56 cm-1. Bilangan gelombang dibawah
1500 cm-1 merupakan daerah sidik jari (finger print). Kegunaan terpenting dari
daerah sidik jari (finger print) setiap senyawa memberikan pola yang berbeda
pada daerah ini (Yadav, 2005).
Berdasarkan puncak serapan yang diperoleh dibandingkan dengan baku
pembanding menunjukkan bahwa bahan yang diisolasi dari talus rumput laut
coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard adalah senyawa fukoidan.
Pergeseran spektrum disebabkan karena fukoidan isolat dan baku diperoleh dari
spesies rumput laut coklat yang berbeda Puncak serapan senyawa isolat fukoidan
dan baku fukoidan dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Hasil spektrofotometri FTIR senyawa isolat dan baku fukoidan
Sargassum ilicifolium (Turner) C. Agard
No
Bilangan gelombang (cm-1)
Isolat Fukoidan
Baku Fukoidan
1
2
3421,72
2927,94
3421,72
2935,66 – 2959,66
3
1238,30
5
6
1022,27
< 1500
1246,02
1041,56
< 1500
Gugus Fungsi
Gugus O-H
Gugus C-H
Gugus S=O asimetris
dan C-O
Gugus C-O
Daerah sidik jari
3.6 Hasil Uji Sitotoksik
Hasil uji sitotoksik dapat diketahui dari jumlah kematian larva Artemia
salina Leach disebabkan adanya pengaruh dari pemberian isolat fukoidan dari
Universitas Sumatera Utara
rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard pada konsentrasi 10,
100, dan 1000 µg/ml. Selain itu, dibuat kontrol negatif berupa air laut dan larva
tanpa penambahan isolat. Hal ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh air laut
maupun faktor lain terhadap kematian larva. Sehingga dapat dipastikan bahwa
kematian larva hanya karena penambahan isolat. Percobaan ini dilakukan dengan
3 kali pengulangan dengan tujuan agar mendapat data yang lebih baik dan lebih
akurat.
Berikut adalah data persen kematian larva Artemia salina Leach dengan
pemberian isolat fukoidan rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner)
C.Agard.
Tabel 4.2 Persen kematian larva Artemia salina Leach dengan pemberian isolat
fukoidan
Isolat fukoidan
Konsentrasi (µg/ml)
10
100
1000
Kontrol negatif (air laut)
Kematian larva Artemia salina Leach
P1
P2
P3
% kematian
1
1
2
13.33
3
2
3
26.67
3
2
5
33.33
0
0
0
0
Hasil Artemia salina Leach yang mati karena penambahan isolat fukoidan
yang telah dilakukan dengan 3 kali pengulangan. Konsentrasi 10 µg/ml
menunjukkan persen kematian larva Artemia salina Leach 13,33%, pada
konsentrasi 100 µg/ml persen kematian larva 26,67%, pada konsentrasi 1000
µg/ml persen kematian larva 33,33% dan kontrol negatif persen kematian larva
adalah 0%.
Total kematian diperoleh dengan menjumlahkan kematian larva pada
setiap konsentrasi. Rata-rata kematian diperoleh dari total kematian dibagi total
Universitas Sumatera Utara
larva yang digunakan tiap konsentrasi. Persentase kematian didapat dengan
mengalikan rata-rata kematian dengan 100.
Tabel 4.2 menunjukkan bahwa adanya hubungan antara konsentrasi
penambahan isolat fukoidan dengan total kematian larva. Semakin tinggi
konsentrasi yang diberikan akan meningkatkan kematian larva. Artemia salina
Leach yang digunakan pada percobaan yaitu larva yang berusia 48 jam atau
berada pada fase instar II-III karena pada usia ini Artemia salina paling sensitif
terhadap bahan uji (Hamidi, et al., 2014).
Kematian larva diamati setelah 24 jam pemberian isolat. Berdasarkan
kriteria standar larva dikatakan mati apabila larva tidak bergerak selama 10 detik
observasi (Krishnakumar, et al., 2007).
Harga LC 50 yang diperoleh dari uji sitotoksik senyawa fukoidan hasil
isolasi rumput laut coklat Sargassum ilicifolium (Turner) C.Agard adalah 13658,4
µg/ml. Ekstrak dikatakan bersifat toksik atau memiliki aktivitas biologi terhadap
Artemia salina Leach apabila memiliki harga LC 50 < 1000 µg/ml (Meyer, et al.,
1982). Harga LC 50 menunjukkan bahwa fukoidan hasil isolasi tidak memiliki sifat
sitotoksik terhadap larva Artemia salina Leach sehingga tidak dapat dijadikan
sebagai obat antikanker.
Universitas Sumatera Utara
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang dilakukan dapat diperoleh kesimpulan
sebagai berikut:
a.
Senyawa fukoidan dari isolasirumput laut coklat Sargassum ilicifolium
(Turner) C.Agard mempunyai persen rendemen 3,61%.
b.
Senyawa fukoidan hasil isolasi dari rumput laut coklat Sargassum ilicifolium
(Turner) C.Agard pada konsentrasi 10 µg/ml, 100 µg/ml, dan 1000 µg/ml
memiliki LC 50 sebesar 13658,4 µg/ml, sehingga tidak memiliki sifat
sitotoksik terhadap Artemia salina Leach dengan metode Brine Shrimp
Lethality Test.
5.2 Saran
Disarankan kepada peneliti selanjutnya untuk melakukan penelitian
mengenai efek farmakologi senyawa fukoidan Sargassum ilicifolium (Turner)
C.Agard.
Universitas Sumatera Utara