pendahuluan - IPB Repository

17
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Begomovirus dilaporkan telah menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi
dengan luas serangan yang tinggi pula. Serangan Begomovirus di Indonesia yaitu
pada pertanaman cabai pertama kali dilaporkan pada tahun 1999 di daerah Jawa
Barat oleh Hidayat et al. (2006). Selanjutnya Sulandari et al. (2006) melaporkan
bahwa kejadian penyakit pada pertanaman cabai yang disebabkan oleh
Begomovirus berlangsung sejak awal tahun 2000 dan telah menyebabkan
kehilangan hasil yang tinggi di beberapa daerah yaitu: Daerah Istimewa
Yogyakarta, Jawa Tengah dan Jawa Barat. Kehilangan hasil pada cabai besar saat
itu mencapai 100% dan pada cabai kecil 50-70%. Hingga saat ini Begomovirus
masih menjadi patogen penting yang menyebabkan kehilangan hasil yang tinggi
pada pertanaman cabai di Indonesia. Begomovirus penyebab penyakit pada
tanaman cabai di beberapa daerah di Indonesia tersebut selanjutnya disebut
Pepper Yellow Leaf Curl Indonesia Virus (PYLCIV).
Begomovirus merupakan anggota Famili Geminiviridae yaitu pada
Subkelompok III (ICTVdB 2006). Begomovirus merupakan anggota geminivirus
dengan jumlah spesies yang paling melimpah yaitu lebih dari seratus spesies
dengan tanaman dikotil sebagai inangnya dan ditularkan oleh vektor kutu kebul
Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Secara morfologi, Begomovirus
memiliki partikel yang tidak beramplop, berbentuk ikosahedral simetri dan
ditemukan selalu berpasangan atau geminate (kembar), dengan ukuran partikel
masing-masing sekitar 15-30 nm (Fauquet 2005). Asam nukleat Begomovirus
berupa utas tunggal DNA (ssDNA). Genom berbentuk sirkuler dan ditemukan
dalam bentuk monopartit (terdiri dari satu genom) atau bipartit (terdiri dari dua
genom) (ICVdB 2006; Van Regenmortel et al. 2000; Voyles 2002).
Diketahui bahwa Begomovirus memiliki keragaman genetik yang tinggi.
Santoso (2008) melaporkan adanya keragaman genetik di antara isolat-isolat
Begomovirus yang berasal dari daerah-daerah di Jawa dan Sumatera melalui
analisis teknik PCR-RFLP. Selanjutnya berdasarkan analisis filogenetik diketahui
bahwa isolat-isolat Begomovirus terbagi menjadi tiga kelompok berbeda. Isolat
Brastagi, Bogor, Sragen, Ketep dan Boyolali berkerabat dekat dengan ToLCV-
18
Java (Tobacco Leaf Curl Virus-Java), isolat Malang dan Blitar berkerabat dekat
dengan AYVV-China (Ageratum Yellow Vein Virus-China) sedangkan isolat
Kaliurang berkerabat dengan TYLCV-China (Tomatto Yellow Leaf Curl VirusChina) atau ToLCV-Laos (Tobacco Leaf Curl Virus-Laos). Trisno (2010) juga
melaporkan mengenai keragaman genetik 11 isolat Begomovirus pada tanaman
cabai di Sumatera Barat yang terbagi menjadi tiga kelompok. Keragaman genetik
yang tinggi ini di duga karena adanya kejadian rekombinasi genetik di antara
isolat-isolat Begomovirus. Sifat penularan Begomovirus melalui vektor dengan
penularan secara tunggal atau bersamaan dengan strain yang berbeda maupun
geminivirus lainnya pada tanaman inang yang sama maupun berkerabat dekat
turut menentukan peluang terjadinya rekombinasi genetik yang tinggi antar isolatisolat Begomovirus. Implikasi dari keragaman genetik yang tinggi ini menjadi
bahan pertimbangan bagi para pemulia tanaman untuk merakit tanaman yang
tahan terhadap Begomovirus, yaitu untuk merakit varietas yang tahan terhadap
beberapa isolat Begomovirus atau merakit beberapa varietas tahan untuk isolat
Begomovirus tertentu. Selain itu informasi mengenai keragaman genetik ini
bermanfaat dalam pengembangan metode deteksi Begomovirus yang tepat dan
cepat.
Beberapa metode deteksi geminivirus yang telah dikembangkan antara lain:
teknik PCR (Polymerase Chain Reaction) dan RFLP-PCR (Restriction Fragment
Length Polymorphism-PCR), uji serologi dengan metode ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) dan teknik hibridisasi DNA yang menggunakan pelacak
DNA (DNA probe). Teknik PCR merupakan metode yang umum digunakan
untuk mendeteksi dan mengidentifikasi virus (Yuwono 2006; Aidawati et al.
2005; Palmer et al. 1998). Amplifikasi geminivirus, umumnya menggunakan
primer universal yaitu PAL1v 1978 dan PAR1c 715 dengan ukuran fragmen DNA
yang diharapkan sebesar 1,6 kb (Rojas et al. 1993; Rusli 2000; Sudiono 2001).
Selain itu dapat juga digunakan primer spesifik yaitu AV1 yang akan
mengamplifikasi daerah penyandi gen protein selubung (coat protein) dengan
ukuran fragmen 780 bp (Santoso 2008; Meliyansah 2010; Fauziah 2010). Metode
deteksi dengan teknik RFLP-PCR, dengan prinsip dasar PCR dan enzim restriksi,
selain mampu mendeteksi keberadaan geminivirus juga mampu menunjukkan
19
perbedaan strain antar virus sehingga dapat digunakan untuk menelusuri
hubungan genetik dan keragaman virus (Gilbertson et al. 1993), seperti yang
dilakukan oleh Sudiono et al. (2004) yang menemukan adanya 2 strain
Begomovirus yang berbeda yang menyerang cabai di Jawa Barat. Teknik ELISA
merupakan teknik deteksi virus berdasarkan pada pengujian serologi. Beberapa
keunggulan teknik ELISA yaitu memberikan hasil pengujian yang sensitif,
mampu menyajikan data kuantitatif dan prosedur ELISA dapat dibuat otomatisasi
(Agrios 2005). Akan tetapi teknik ini memiliki kelemahan yaitu penyediaan
antigen yang spesifik membutuhkan alokasi waktu yang lama dengan biaya yang
tidak murah. Khususnya untuk geminivirus, sampai saat ini ketersediaan
antiserum dan stabilitasnya masih menjadi faktor penghambat utama untuk
memanfaatkan teknik ini sebagai alat deteksi yang efektif dan efisien. Hal tersebut
disebabkan oleh sifat fisik dan kimia partikel virus yang membuatnya sulit untuk
dimurnikan dalam bentuk yang stabil, sifat imunogenik dari virion yang lemah,
homologi protein selubung terutama bagi virus-virus yang ditularkan oleh B.
tabaci (Roberts et al. 1984). Teknik deteksi geminivirus berbasis asam nukleat
dengan prinsip hibridisasi menggunakan pelacak DNA telah banyak digunakan
untuk menjawab kelemahan dari teknik deteksi PCR maupun ELISA. Prinsip
teknik deteksi ini yaitu terjadinya komplementasi asam nukleat antara asam
nukleat pelacak dengan genom virus. Beberapa kelebihan teknik deteksi ini
dibandingkan dengan teknik deteksi geminivirus lainnya yaitu tingkat spesifisitas
yang tinggi, relatif mudah dan pelaksanaannya cepat dengan jumlah sampel yang
banyak (Aidawati 2006; Rubio et al. 2003). Selain spesifisitas yang tinggi, teknik
ini mampu menunjukkan korelasi positif antara akumulasi DNA virus yang
dideteksi dengan intensitas gejala (Rom et al. 1993; Rubio et al. 2003).
Pelacak DNA yang digunakan dalam teknik deteksi hibridisasi dapat
bersifat universal maupun spesifik terhadap Geminivirus. Spesifisitas pelacak
DNA memegang peranan sangat penting dalam pengembangannya sebagai alat
deteksi yang efektif dan efisien. Semakin spesifik pelacak DNA yang digunakan
akan menambah keakuratan hasil deteksi (Keller & Manak 1992).
Aidawati
(2006) telah menggunakan teknik deteksi hibridisasi dot-blot menggunakan
pelacak DNA yaitu klon partial DNA Tobacco Leaf Curl Virus (TobLCV), yang
20
mencakup sebagian daerah ORF V1 yang menyandikan protein selubung dan
ORF C1 yang menyandikan gen replikasi, yang dilabel dengan digoxigenin, yang
bersifat universal terhadap geminivirus dan mampu mendeteksi keberadaan
geminivirus pada sap tanaman hingga faktor pengenceran 10-2. Untuk menjawab
kebutuhan akan teknik deteksi berbasis pada uji asam nukleat dengan teknik
hibridisasi Dot-Blot yang efektif dan efisien, maka dalam penelitian ini telah
dikonstruksi suatu pelacak DNA yang bersifat spesifik terhadap Begomovirus
dengan memanfaatkan gen protein selubung Begomovirus.
Gen protein selubung Begomovirus yang disandikan oleh ORF AV1 pada
DNA A Begomovirus merupakan daerah genom yang berfungsi sebagai
pembentuk selubung protein, penularan dengan vektor serta untuk pergerakan
virus. Selain itu gen protein selubung memiliki daerah genom yang mempunyai
runutan susunan DNA dengan derajat kesamaan yang tinggi (conserved) antar
anggota geminivirus. Oleh karena sifatnya tersebut, daerah genom tersebut banyak
digunakan sebagai dasar pemilihan primer untuk mengamplifikasi DNA
geminivirus dalam pengembangan teknik deteksi dan identifikasi Begomovirus
(Morin et al. 2000; Astier et al. 2001; Fraquet et al. 2005; Santoso 2008). Teknik
deteksi yang dikembangkan dalam penelitian ini diharapkan kelak bermanfaat
sebagai alat deteksi penyakit yang disebabkan oleh geminivirus khususnya
Begomovirus sekaligus juga bermanfaat untuk menyeleksi genotipe tanaman yang
rentan, resisten maupun toleran terhadap Begomovirus.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi, mengkarakterisasi dan
memperoleh klon rekombinan gen protein selubung (coat protein) Begomovirus
yang akan digunakan sebagai pelacak DNA pada pengembangan sistem deteksi
penyakit tanaman yang disebabkan oleh Begomovirus.