Konstruksi vektor ekspresi gen untuk

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Padi merupakan komoditas pertanian yang banyak diusahakan oleh petani
di dunia. Bagi sebagian besar petani, padi mempakan pilihan utama untuk
diusahakan dalam upaya memenuhi kebutuhan pangan. Sejalan dengan makin
bertambahnya jurnlah penduduk, permintaan terhadap beras pun semakin
meningkat. Pada akhir-akhir ini produksi beras nasional mengalami p e n m a n
yang sangat berarti. Pada tahun 2000 produksi beras Indonesia sebesar 32.8 juta
ton sedangkan pada tahm 2001 produksi berm Indonesia sebesar 31.7 juta ton
(BPS & Ditjen BPTP 2002).
Konsep penggunaan Agrobacterium tumefaciem sebagai vektor untuk
merakit tanaman transgenik mempunyai prospek dan harapan. Beberapa tanaman
agronomi dan holtikultura yang memiliki nilai penting secara rutin ditransformasi
menggunakan bakteri hi. Sistem transformasi dengan Agrobacterium secara luas
telah digunakan untuk introduksi gen asing kedalam genom tanaman (Gelvin SB
1998). Introduksi gen asing ke dalam sel tanaman melalui proses transformasi
merupakan ide dari perakitan tanaman transgenik.
Keberadaan gen penyeleksi antibiotik atau resistensi herbisida yang
kondisinya terus menerus diekspresikan telah menimbulkan beberapa masalah
(Granger 2002). Pertama, munculnya kekhawatiran publik tentang terjadinya
resistensi dari organisme penggangu. Hal ini terjadi karena produk yang
diekspresikan terus menerus dapat berfungsi sebagai agen seleksi sehingga dapat
meningkatkan ketahanan bakteri terhadap antibiotik tertentu (dari penggunaan gen
penyeleksi antibiotik) dan gulma terhadap herbisida tertentu (dari penggunaan gen
penyeleksi herbisida). Kedua, ekpresi gen penyeleksi yang terus menerus mungkin
dapat mengganggu produksi karena surnber asam amino dipakai untuk
menghasilkan protein yang disandi oleh gen penyeleksi. Ketiga, keterbatasan agen
seleksi pada sistem seleksi yang efektif menjadi hambatan jika akan dilakukan
penyisipan gen
lain dengan menggunakan gen seleksi sebagai penanda
seleksinya. Adanya sistem seleksi positif, misalnya dengan menggunakan manosa
sebagai agen penyeleksi (Lucca et al. 2001) telah memberikan suatu pilihan
pengalihan penggunaan senyawa antibiotik dalam sistem seleksi.
Gen penyeleksi antibiotik selalu digunakan dalam sistim transformasi,
tetapi gen tersebut biasanya tidak dibutuhkan apabila tanaman transgenik telah
dihasilkan Gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik yang telah didapat
bukan hanya tidak dibutuhkan lagi, tetapi juga dapat menimbulkan masalah baru.
Sebagai contoh, gen resistensi antibiotik yang berbeda hams digunakan bila a&
penambahan gen wing ke dalam tanaman transgenik, tetapi sejumlah gen
penyeleksi antibiotik yang ada terbatas. Keamanan dari gen penyeleksi antibiotik
me~pakaIlmasalah dalam pemasaran produk rekayasa genetik.
Keberadaan gen penyeleksi antibiotik pada tanaman transgenik telah
menimbulkan keberatan antara lain berupa kekhawatiran terjadinya transfer gen
tersebut ke milcroorganisme dan kemunglunan terganggunya ekspresi gen yang
memillki peran penting, serta kesulitan untuk mengintroduksi gen lain karena
terbatasnya gen penyeleksi antibiotik yang dapat digunakan. Gen penyeleksi
dapat dieliminasi
dari tanaman transgenik
melalui seleksi pada generasi
berikutnya setelah proses segregasi. Gen penyeleksi &pat berpisah dari gen
sasaran bila kedua gen tersebut terletak pada kromosom yang berbeda atau
keduanya bebas. Terdapat beberapa metode yang dapat mengeliminasi keberadaan
gen penyeleksi antibiotik, antara lain melalui, ko-transfonnasi baik dengan
particle
bombardment
maupun dengan double T-DNA, site-specrfc
recombination (Mom & Hooykaas 1992, Zuo JR
et al. 2001), dan inm-
genomic translocation via transposable elements (Cotsafis et al. 2002). Pada
sistem ketransformasi, gen sasaran dipisahkan dari gen penyeleksi antibiotik.
Teknik ini dapat menjadi suatu teknik generik yang dapat diterapkan untuk semua
sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik.
Secara alami, beberapa isolat Agrobacterium memiliki lebih dari satu T-DNA,
dan tumor crown gall seringkali disebabkan karena ko-transformasi oleh beberapa
T-DNA (Hooykaas & Schilperoort 1992).
Selain gen sasaran yang diintroduksikan, T-DNA tidak mengintroduksi
DNA lain kecuali right border dan leji border dari Agrobacterium itu sendiri ke
dalam genom. Teknik ini dapat menjadi suatu teknik generik yang &pat
diterapkan untuk semua sistem transformasi tanaman dalam mengeliminasi gen
penyeleksi antibiotik. KO-transformasi menggunakan double T-DNA dilakukan
dengan memisahkan gen sasaran dan gen penyeleksi antibiotik pada T-DNA yang
berbeda. T-DNA adalah daerah DNA yang akan ditransfer dan telah diketahui
dibatasi oleh 25 pasangan basa pada masing-masing ujungnya yang dikenal
sebagai batas kiri (leji border) dan batas kanan (right border) (Hooykaas &
Schilperoort 1992). KO-transformasi dengan menggunakan Agrobacterium
melalui double T-DNA memungkinkan dihasilkannya tanaman transgenik tanpa
gen penyeleksi antibiotik setelah segregasi (Komari et al. 1996; Matthews et al.
2001; Zhou et al. 2003). Kegiatan transformasi gen melalui perantara alami
Agrobacterium tumefaciens telah menjadi kegiatan rutin pada banyak
laboratorium di Indonesia. Akan tetapi tanaman transgenik yang dihasilkan dari
sistem transformasi ini akan selalu mengandung gen penyeleksi antibiotik.
Introduksi gen asing kedalam tanaman tingkat tingg menggunakan teknik
Agrobacterium tumefaciens merupakan teknik yang sering digunakan &lam
biofogi molekuler dan rekayasa genetik tanaman. Walaupun metode ini pada
awalnya digunakan pada
tanaman dikotiledon, tetapi
sekarang telah
dikembangkan pada beberapa tanaman sereal seperti padi, jagung (Hiei et al.
1994). Salah satu keuntungan transfer gen dengan A. tumefaciens adalah efisiensi
transformasi yang tinggi.
Pada penelitian ini strategi yang dilakukan untuk mengintegrasikan gen
penyeleksi yang dapat bersegregasi dengan gen sasaran adalah: 1 ) double
T-DNA yang masing-masing membawa gen penyeleksi dan gen sasaran secara
terpisah, dan gen sasaran yang digunakan adalah gen cryIAb. 2 ) Dua T-DNA
berbeda inang, T-DNA yang satu membawa gen penyeleksi dan T-DNA lainnya
membawa gen sasaran pada masing-masing plasmid Gen sasaran yang digunakan
adalah gen penyandi asam salisilat yang dibawa oleh plasmid pCambia 1200 yang
telah dibuang gen penyeleksinya. Asam salisilat dipilih karena memililu potensi
dapat mempertinggi ketahanan tanaman terhadap stres biotik maupun abiotik.
Asam salisilat secara alami terdapat dalam tanaman dan terlibat dalam
beberapa fungsi fisiologis, seperti pembukaan stomata, induksi pembungaan, dan
memiliki peran penting &lam
mengatasi serangan patogen (Verbeme et al.
2000). Penelitian yang dilakukan Verbeme et al. (2000)pada tanaman tembakau
menunjukan bahwa gen-gen peningkat ekspresi asam salisilat (genpmsB clan gen
enC) yang berhasil disisipkan temyata dapat meningkatkan daya resistensi
tanaman tersebut terhadap patogen, namun tidak mempengamhi fenotip tanaman
tersebut. Kandungan asam salisilat pada tanaman padi berkorelasi positif dengan
tingkat ketahanan padi terhadap Pyricularia grisea (Silverman et al. 1995). Gengen yang bertanggung jawab dalam biosintesis asam salisilat dihasilkan oleh
Pseudomonm fluorescens (gen pmsB) dan Escherichia coli (gen enlC). Gen-gen
tersebut terlibat dalam jalur biosintesis asam salisilat yang dimulai dari
isochorismate sinthase oleh gen entC dan isochorismate pyruvate lyase oleh gen
pmsB untuk meningkatkan resistensi terhadap penyakit yang disebabkan oleh
cendawan (Mercado et al. 1989).
Penggerek batang m e ~ p d c a nsalah satu hama utama tanaman padi yang
kuantitas serangannya semakin meningkat. Penggerek batang me~p&aIIsalah
satu hama utama padi di Asia yang mengakibatkan kehilangan produksi sebesar
5 1 0 % (Pathak & Khan 1994) bahkan sampai 60-95% (Wunn et al. 1996).
Penanganan hama penggerek batang sampai saat ini masih tergantung pada
penggunaan pestisida. Gen cry adalah penyandi protein aktif anti serangga yang
diisolasi dari BaciIlw thuringiemis, yaitu bakteri yang menghasilkan suatu kristal
protein yang bersifat racun jika terhidrolisis dalam jaringan usus serangga
(Dekeyser et al. 1990). Ekspresi gen yang diisolasi dari B. thuringiensis ini pada
kultivar IR58 dan Basmati dapat meningkatkan ketahanan terhadap penggerek
batang kuning dan bergaris (Wunn et d.1996; Nayak et al. 1997). Wunn et al.
(1996) melaporkan tanaman padi yang mengekspresikan gen cyMb dapat
meningkatkan ketahanan terhadap hama penggerek batang sampai 100%.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk mengkonsbuksi vektor ekspresi gen yang
dapat mengeliminasi gen penyeleksi antibiotik dengan menggunakan Olyza sativa
sebagai tanaman model.