Laporan Praktikum X

Laporan Praktikum X
Transformasi DNA dengan vektor
Agrobacterium tumefaciens
Nama
: Cokhy Indira Fasha
NIM
: 10699044
Kelompok
:7
Tanggal Praktikum : 29 Oktober 2001
Tanggal Laporan
: 5 November 2001
Asisten
: Rizki Ali Akbar
Departemen Biologi
Institut Teknologi Bandung
2001
Laporan Praktikum X
Transformasi DNA dengan vektor Agrobacterium tumefaciens
I. Pendahuluan
A. Latar Belakang
Di alam telah ditemukan bakteri Agrobacterium tumefaciens yang memiliki plasmid-Ti dan
dapat mentransfer DNA asing ke dalam sel tanaman (umumnya dikotil). Fenomena ini telah
mendasari pemikiran mengenai teknik rekayasa genetika melalui bakteri Agrobacterium tumefaciens
sebagai vektor. Teknologi ini merupakan pondasi dalam produksi tanaman transgenik.
B. Tujuan
Memanfaatkan Agrobacterium tumefasciens sebagai vektor dalam transformasi DNA
C. Teori dasar
Bakteri Agrobacterium tumifasciens, bakteri gram-negatif yang berbentuk batang, menyebabkan
penyakit crown-gall pada tanaman dimana ketika tanaman terekspos Afribacterium, sel tanaman
normal ditransformasi menjadi sel tumor berbentuk gall oleh proses yang melibatkan transfer gen
dari bakteri ke tamanan.
Sel tumor yang diinduksi oleh Agrobacterium dapat ditandai oleh beberapa hal. Pertama, tidak
seperti kebanyakan sel tanaman normal, sel tumor ini dapat dipisahkan dari gall dan tumbuh tidak
terbatas dalam kultur yang tidak mengandung faktor tumbuh dan tanpa keberadaan bakteri
Agrobacterium tumefaciens. Selanjutnya, sel ini mensintesis berbagai macam unsur kimia yang tidak
biasa dihasilkan, yang dinamakan opines; Turunan asam amino ini dapat dikatabolisme dan
digunakan oleh bakteri Agrobacterium tumefaciens.
Kemampuan Agrobacterium tumefaciens untuk menginduksi tumor terkait dengan DNA plasmid
besar yang dinamakan Ti (Tumor-Inducing) dimana pada plasmid ini terdapat T-DNA(transferred
DNA) yang bergabung dengan genom inti dari sel tanaman. Bakteri dapat menginfeksi tanaman
yang suseptibel hanya pada site luka, dimana sel tanaman mensekresikan, secara tidak normal,
komponen fenolik yaitu acetosyringone. Komponen ini diproduksi sebagai respon dari luka dan
dikenali oleh bakteri sebagai tempat terjadinya infeksi dan mengaktivasi rangkaian reaksi dari
bakteria yang menyebabkan terjadinya eksisi dari T-DNA dari plasmid Ti dan terjadinya transfer gen
ke genom sel inang. Setelah terintegrasi dengan kromosom sel inang, T-DNA ditranskripsi dan
ditranslasi oleh sel inang untuk memproduksi tiga kelas protein, yaitu :
1. Enzim yang menyebabkan tanaman untuk memproduksi opine yang spesifik.
2. Indole-acetic acid (IAA)
3. Sitokinin
IAA dan sitokinin berfungsi dalam regulasi pertumbuhan tanaman sehingga kenaikan konsentrasi
keduanya menyebabkan terjadinya pertumbuhan yang terus berlanjut dan pembelahan sel tanaman
secara terus menerus.
II. Cara Kerja
Semua prosedur kerja dilakukan pada kondisi steril. Pada eksplan daun dibuat potongan secara
in-vitro dengan menggunakan pengebor gabus lalu potongan daun ini dimasukkan ke dalam medium
YEP cair yang telah diinokulasi dengan bakteri Agrobacterium tumefaciens.dan dikocok dalam
selang waktu 3,5 - 5,5 jam. Potongan daun selanjutnya dimasukkan ke dalam larutan antibiotik
selama 15 menit dan dikeringkan pada kertas Whatman no.1 steril. Daun kemudian ditanam pada
medium WPM atau MS tanpa zat pengatur tumbuh. Kultur dipelihara di ruang Kultur pada suhu 2325OC dengan pencahayaan terus menerus. Pembentukan kalus “crown-gall” diamati setiap minggu
selama empat minggu.
III. Data Pengamatan
Data pengamatan yang didapatkan :
Kelompok Waktu Infeksi
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
5,5
3,5
5
5
4,5
4,5
4,5
3
3,5
3,5
Jumlah Crown Gall Jumlah Kontaminasi
Keterangan
+
Bakteri
Jamur
0
5
2
0
Tidak tumbuh
0
6
0
0
Tidak tumbuh
0
9
0
2
Tidak tumbuh
0
5
0
2
Tidak tumbuh
3
4
0
1
0
8
0
8
Tidak tumbuh
0
8
0
0
Tidak tumbuh
0
7
0
0
Tidak tumbuh
0
7
0
0
Tidak tumbuh
5
3
0
1
Tumbuh pada minggu II
IV. Pembahasan
Percobaan ini mencoba melihat teknik inokulasi bakteri Agrobacterium tumefaciens kepada
tanaman serta mencoba melakukan kultur jaringan dari hasil inokulasi tersebut. Bakteri ini
merupakan salah satu perekayasa genetik alami, dimana terjadinya rekayasa ini ialah karena proses
insersi dari T-DNA dari plasmid Ti yang dimiliki oleh sel bakteri. Secara kimia, proses ini dapat
digambarkan sebagai berikut :
 Agrobacterium tumefaciens menempel pada permukaan sel tumbuhan yang mengalami luka.
Sel tumbuhan mengeluarkan suatu sinyal luka, sejenis asetosyringone. Sinyal tadi dikenali
oleh gen Vir A yang terdapat pada membran Agrobacterium tumefaciens.
 Vir A dengan ikatan sinyalnya menaktivasi vir G. Aktivitas vir G mengaktifkan gen Vir D
dan E. Vir D memotong pada tempat yang spesifik dari plasmid Ti, yaitu “left border” dan
“right border”. Antara “left border” dan “right border” inilah terdapat T-DNA. T-DNA akan
ditransfer ke dalam sel tumbuhan yang kemudian berintegrasi dengan DNA inti sel
tumbuhan.
 T-DNA ini mengkode protein yang memproduksi hormon dan opine. Hormon akan
menolong pertumbuhan jaringan yang telah bertransformasi sehingga terbentuk crown gall.
Kanker tersebut memberikan keuntungan pada bakteri dengan berlebihnya nutrisi yang
diperoleh.
Dari data didapatkan hasil yang kurang memuaskan, dimana crown gall yang terbentuk sedikit.
Pembentukan crown gall ini dipengaruhi oleh :
 periode terjadinya infeksi




besar permukaan luka
konsentrasi bakteri dalam larutan
suhu dan pH
pengadukan
Pada percobaan ini variabel yang diukur adalah periode infeksi. Dari data yang didapatkan
pertama kalinya terjadi infeksi ialah pada periode infeksi 3,5 jam. Jadi pada waktu kurang dari 3,5
jam, diperkirakan tumbuhan belum terinfeksi oleh Agrobacterium tumefaciens.Tentu saja
kesimpulan ini masih sangat kasar, karena data yang didapatkan hanya dua buah yaitu pada waktu
3,5 dan 5,5 jam saja, sedangkan perlakuan pada periode lainnya tidak ditemukan adanya crown gall.
Untuk mendapatkan kesimpulan lebih tepat, diperlukan data yang lebih baik.
Selain itu, ada juga kemungkinan bahwa tumbuhan yang sebenarnya sudah terinfeksi tidak dapat
tumbuh karena medium nutrisi yang kurang baik, baik ketersediaan nutrisinya maupun faktor fisik
dan kimia lainnya. Lalu, ada juga kemungkinan tempat penyimpanan yang kurang baik sehingga
mempengaruhi pertumbuhan, dimana dalam hal ini yang mempengaruhi adalah suhu dan cahaya.
Pada percobaan kelompok kami, sebenarnya potongan daun pada minggu II sudah mulai meregang
ke atas, tetapi selanjutnya tidak ada perubahan sampai minggu IV.
Pada beberapa kultur juga terjadi kontaminasi oleh bakteri dan jamur. Pada kontaminasi
Agrobacterium tumefaciens, hal ini menunjukkan bahwa pencucian dengan antibiotik setelah infeksi
kurang baik sehingga bakteri ini masih terdapat pada tanaman. Selain bakteri Agrobacterium
tumefaciens, kontaminasi yang terjadi disebabkan oleh pengaruh eksternal. Pada saat melakukan
percobaan, mungkin saja praktikan berbicara atau melakukan hal-hal yang dapat membawa spora
jamur atau bakteri ke dalam botol kultur.
V. Kesimpulan
1. Pada transformasi dapat dimanfaatkan Agrobacterium tumefasciens sebagai vektor dalam
transformasi DNA dengan mekanisme alaminya yaitu insersi T-DNA yang berasal plasmid Ti
dari ke dalam sel tumbuhan.
2. Periode infeksi minimal Agrobacterium tumefasciens ke sel tumbuhan yang dapat menghasilkan
crown gall adalah 3,5 jam.
3. Kontaminasi terjadi karena masuknya organisme lain ke medium kultur in vitro.
VI. Daftar Pustaka
1.
2.
3.
4.
Albert, B. et al. 1994. Biologi Molekuler Sel, 2nd ed. Gramedia. Jakarta
Albert, B. et al. 1989. Molecular Biology of The Cell, 2nd ed.Garland Publishing, Inc. New York
Campbell, N. A. 1996. Biology 4th ed. Addison Wesley Longman. Singapore.
Karp, G. 1996. Cell and Molecular Biology: Concepts and Experiment. John Willey and Sons,
Inc. New York.