AKTIVITAS SITOTOKSIK FRAKSI NON POLAR EKSTRAK

 AKTIVITAS SITOTOKSIK FRAKSI NON POLAR
EKSTRAK ETANOLIK KULIT BATANG SIRSAK
(Annona muricata Linn.) TERHADAP SEL T47D
SKRIPSI
Oleh:
AULIA HANDAYANI
K 100 080 015
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
SURAKARTA
2012
1
2
AKTIVITAS SITOTOKSIK FRAKSI NON POLAR EKSTRAK
ETANOLIK KULIT BATANG SIRSAK (Annona muricata Linn.)
TERHADAP SEL T47D
CYTOTOXIC ACTIVITY OF FRACTION NON POLAR EXTRACT
ETHANOLIC SKIN STEM SOURSOP (Annona muricata Linn.) ON CELL
T47D
Peni Indrayudha, Haryoto dan Aulia Handayani
Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Surakarta
Jl. A. Yani Tromol Pos I Pabelan Kartasura, Surakarta
ABSTRAK
Daun sirsak (Annona muricata L.) secara empiris digunakan untuk
mengobati kanker. Penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak etil asetat daun
sirsak mempunyai efek sitotoksik pada sel U-937 dengan nilai IC50 = 7,8 ± 0,3
µg/mL. Penelusuran atau skrining kandungan kimia dan aktivitasnya pada kulit
batang sangat diperlukan untuk mengetahui efek sitotoksik fraksi non polar
ekstrak etanolik kulit batang sirsak terhadap sel T47D dan kandungan senyawa
yang tersari.
Ekstrak etanol diperoleh dari ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96%,
kemudian fraksi heksan diperoleh dengan metode KCV. Uji sitotoksik
menggunakan metode MTT dengan berbagai seri konsentrasi fraksi sebesar
125,00; 62,50; 31,25; 15,62; dan 7,81 µg/mL. Pembacaan absorbansi
menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 595 nm. Data yang
diperoleh berupa absorbansi, digunakan untuk menghitung % sel hidup yang
selanjutnya digunakan dalam menentukan nilai IC50. Analisis kualitatif kandungan
senyawa dengan kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fase diam silika gel
GF254 dan fase gerak n-heksan PA : etil asetat PA (9 : 1).
Hasil penelitian yang diperoleh menunjukkan bahwa fraksi non polar
ekstrak etanolik kulit batang sirsak tidak memiliki efek sitotoksik terhadap sel
T47D. Konsentrasi tertinggi pada 125 µg/mL menunjukkan % sel hidup =
114,94%. Hasil analisis KLT menunjukkan adanya senyawa saponin, polifenol,
flavonoid, dan minyak atsiri.
Kata Kunci : Annona muricata L., sel T47D, metode MTT, sitotoksik, ekstrak
etanolik kulit batang sirsak
ABSTRACT
Leaves of the soursop (Annona muricata L.) is empirically used to treat
cancer. Previous research suggests ethyl acetate extract of the soursop is leaves
has a cytotoxic effect on U-937 cells with IC50 values = 7.8 ± 0.3 mg/mL. Search
or screening of chemical content and activities on the bark is needed to determine
1
the cytotoxic effect of non polar fraction of bark ethanolic extract to T47D cells
and the soursop compound content.
Ethanol extracts obtained from extraction using 96% ethanol by
maceration method, then hexane fraction obtained by the method of VLC.
Cytotoxic test using the MTT method with various concentrations of the fraction
by 125.00: 62.50: 31.25: 15.62, and 7.81 µg/mL. Absorbance readings using an
ELISA reader at a wavelength of 595 nm then was used to calculate % living cells
was then used to determine IC50 values. Qualitative content analysis of
compounds with thin layer chromatography (TLC) using GF254 silica gel as
stationary phase and n-hexane PA : PA ethyl acetate (9 : 1) as mobile phase.
The results show that the non polar fraction of ethanolic extract of the
bark of the soursop was no cytotoxic effect on T47D cells. The highest
concentration at 125 µg/mL showed % living cells values = 114.94%. TLC
analysis results indicate the presence of saponin, polyphenols, flavonoids, and
essential oils.
Keywords: Annona muricata L., T47D cells, MTT method, cytotoxic, soursop bark
ethanolic extract
PENDAHULUAN
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang frekuensi
kejadiannya paling tinggi di antara kanker-kanker jenis lain yang sering
menyerang wanita. Penderita kanker payudara di Indonesia sebanyak 12,10%,
terbanyak kedua setelah kanker leher rahim (19,18%) (Tjindarbumi dan
Mangunkusumo, 2002). Upaya pencegahan atau pengobatan kanker lebih penting
mengingat frekuensi kejadian cukup tinggi (Nurrochmad et al., 2011).
Secara umum, pengobatan kanker dilakukan dengan cara pembedahan,
penyinaran, kemoterapi, imunoterapi, dan hormon (Mangan, 2003). Bahan alam
juga memiliki pengaruh yang sangat besar terhadap penemuan senyawa pemusnah
sel kanker (Syarief et al., 2005), salah satu tanaman yang berpotensi sebagai anti
kanker adalah sirsak. Fraksi kloroform ekstrak etanol dari daun srikaya yang
berasal dari genus yang sama memberikan aktivitas sitotoksik dengan nilai LC50
4,5467 µg/mL terhadap sel HeLa (Djajanegara, 2009). Terdapatnya aktivitas pada
ekstrak yang disari dengan pelarut non polar yaitu heksana, maka penelitian ini
dilakukan untuk mengetahui efek sitotoksik kulit batang sirsak yang difraksinasi
menggunakan pelarut heksan terhadap sel T47D dan untuk mengetahui senyawa
yang tersari dalam fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak.
2
METODE PENELITIAN
I.
Bahan dan Alat
1) Bahan
a. Kulit batang sirsak yang diambil dari tanaman sirsak yang terdapat di
Desa Lopait Kecamatan Tuntang Semarang, Jawa Tengah.
b. Heksan
c. Sel T47D (koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran
UGM), RPMI (Gibco), FBS, antibiotik penicillin-streptomisin dan
fungizone,
akuades,
natrium
bikarbonat,
larutan
MTT
(3-(4,5
dimethytiazol-2-yl), 2,5-diphenyl tetrazolium bromide), PBS, SDS 10%
(Sigma), HCl 1N, DMSO 100%.
d. Bahan untuk uji kualitatif kandungan senyawa secara kromatografi lapis
tipis, pelat silika gel GF254 (fase diam), n-heksan PA, etil asetat PA (fase
gerak), FeCl3 (deteksi polifenol), sitroborat (deteksi flavanoid), vanilin
H2SO4 (deteksi minyak atsiri), dragendrof (alkaloid), dan libermanbourchad (deteksi steroid saponin dan terpenoid saponin).
2) Alat
a. Peralatan dalam pembuatan serbuk: kain hitam, blender, dan pengayak
serbuk
b. Peralatan yang digunakan dalam penyarian: peralatan gelas, penangas air,
alat timbang, seperangkat alat maserasi, dan rotary evaporator
c. Alat yang digunakan dalam uji sitotoksik: tangki nitrogen cair,
mikroskop fase kontras (Olympus), sentrifuge, inkubator CO2, Laminair
Air Flow, ELISA reader, haemocytometer, tabung conical steril, tissue
culture flask, plate micro 96 sumuran, mikropipiet, vorteks, timbangan
elektrik, kamera digital Sony DSC-W130 (8,1 megapixel).
d. Peralatan dalam uji kualitatif kandungan senyawa secara kromatografi
lapis tipis : kertas saring, cawan porselin, lampu UV, pipa kapiler, bejana
elusi, dan alat gelas.
3
II.
Jalan Penelitian
1). Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman sirsak dilakukan di Laboratorium Biologi
Farmasi Fakultas Farmasi UMS, untuk memastikan tanaman yang diteliti
adalah tanaman yang dimaksud dengan mencocokkan keadaan morfologi
tanaman berdasarkan kunci-kunci determinasi dalam buku Flora of Java
karangan Backer dan Van den Brink (1965).
2). Pengumpulan Bahan dan Pembuatan Serbuk
Simplisia kulit batang sirsak yang digunakan dalam penelitian ini
diambil dari tanaman yang sehat dan segar dari Desa Lopait Kecamatan
Tuntang Semarang yang diambil pada bulan Desember 2010. Kulit batang
tersebut dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan
ditutupi kain hitam, setelah kering simplisia tersebut diblender dan diayak.
3). Preparasi Ekstrak dan Fraksinasi
Serbuk kering simplisia kulit batang sirsak ditimbang sebanyak
1,72 kg kemudian dimasukkan ke alat maserasi dan dimaserasi dengan
pelarut etanol 96% sebanyak 7,5 kali simplisia dalam wadah tertutup rapat
dan terlindung cahaya, disimpan selama 1 x 24 jam sambil sesekali diaduk.
Kemudian ekstrak disaring menggunakan corong buchner. Maserasi
dilakukan berulang sebanyak 2 kali. Filtrat etanol yang didapatkan
dipekatkan dengan menggunakan rotary evaporator dan dilanjutkan dengan
penangas air sehingga diperoleh ekstrak kental yang kemudian difraksinasi.
Fraksinasi ekstrak etanol kulit batang sirsak dilakukan dengan metode
kromatografi cair vakum (KCV) dengan fase diam silica GF 60 254 yang
telah diaktifkan 1500C selama 1 jam. Fase diam dimasukkan ke dalam
kolom ± 175 gram. Pada bagian atas fase diam, dituangkan sampel yang
telah diimpregnasi menggunakan silika impreg yang telah diaktifkan 1500C
selama 1 jam. Sampel diimpregnasi dengan cara mencampurkan sampel
dengan silika dengan perbandingan 1 : 2. Selanjutnya dimasukkan kertas
saring pada bagian atasnya, dengan tujuan untuk menjaga agar fase diam
4
tidak berubah letak karena penuangan eluen. Adapun eluen yang digunakan
dalam fraksinasi ditunjukkan pada Tabel 1.
Tabel 1. Eluen yang digunakan dalam fraksinasi
Eluen
Volume eluen
(mL)
Jumlah
elusi
Heksan
Etil asetat
Etanol
9
1
-
150
3X
8
2
-
150
4X
7
3
-
150
4X
6
4
-
150
3X
-
-
10
150
2X
Kemudian eluen dituangkan, dan proses kromatografi dijalankan.
Hasil elusi (eluen) ditampung dalam botol flakon. Tiap eluen ditotolkan
pada KLT dan dikembangkan dengan menggunakan eluen n-heksan PA :
etil asetat PA (8 : 2), diamati profil yang terbentuk, eluen dengan profil yang
sama disatukan sebagai satu fraksi, fraksi-fraksi diuapkan dari pelarutnya
dengan rotary evaporator, fraksi heksan diuji aktivitas antikankernya.
4). Sterilisasi
Sterilisasi laminar air flow cabinet
a.
Sterilisasi LAF dilakukan dengan menyalakan lampu ultraviolet 30
menit sebelum digunakan. Permukaan tempat kerja disterilkan terlebih
dahulu dengan disemprot etanol 70%.
b.
Sterilisasi alat
Sterilisasi alat-alat gelas yang akan digunakan dalam penelitian ini
disterilkan dengan autoclave 1210C selama 15-20 menit.
5). Preparasi Sel Kanker Payudara (T47D)
Sel yang cukup, mediumnya dibuang kemudian ditambah PBS,
ditambah tripsin 0,05%, setelah itu diinkubasi. Selanjutnya ditambah media
secukupnya, dipindah dalam tabung konikal. Kepadatan sel T47D dapat
diketahui dengan cara mengambil 10 µL suspensi sel dan dihitung
menggunakan haemocytometer.
5
6). Pembuatan Larutan Uji
Fraksi non polar ekstrak etanolik 96% kulit batang sirsak sebanyak
10 mg dilarutkan dalam 100 µL DMSO sehingga diperoleh sampel induk
sebesar 100.000 µg/mL. Selanjutnya dibuat 7 seri kadar dari larutan sampel
induk dalam media RPMI.
7). Uji Sitotoksik menggunakan Metode MTT
Stok yang telah dibuat tujuh seri konsentrasi yaitu 1000 µg/mL;
500 µg/mL; 250 µg/mL; 125 µg/mL; 62,5 µg/mL; 31,25 µg/mL; 15,625
µg/mL dimasukkan ke dalam microplate 96 sumuran, dengan volume 100
µL/sumuran. Sel diinkubasi dalam inkubator 5% CO2 selama 24 jam pada
suhu 370C. Kemudian ditambah MTT pada masing-masing sumuran
sebanyak 110 µL selanjutnya diinkubasi selama 3,5 jam. Setelah itu reaksi
dihentikan dan penambahan SDS 10% sebanyak 100 µL/sumuran untuk
melarutkan formazan. Hasilnya dibaca dengan ELISA reader pada panjang
gelombang 595 nm.
8). Uji Kandungan Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis
Fraksi non polar kulit batang sirsak dilarutkan dalam pelarut yang
sesuai. Larutan sampel ditotolkan pada plat KLT, kemudian totolan dielusi
dengan berbagai fase gerak yang sesuai, kemudian dikeringkan. Setelah itu
di bawah sinar UV 254 nm dan 366 nm. Tahap akhir uji KLT, permukaan
plat disemprot dengan berbagai pereaksi semprot.
9). Analisis Data
Data uji sitotoksik yang didapat dihitung dengan menggunakan rumus :
% sel hidup =
Abs perlakuan – Abs kontrol media
x100%
Abs kontrol sel – Abs kontrol media
% sel hidup yang diperoleh dari masing-masing konsentrasi dibuat
persamaan regresi linier yang berasal dari log konsentrasi vs % sel hidup.
Hasilnya kemudian disubstitusi ke dalam persamaan y = Bx + A dengan
nilai y = 50 dan dianti-logaritma untuk mendapatkan nilai IC50.
6
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1.
Hasil Fraksinasi Ekstrak Etanol Kulit Batang Sirsak
Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak etanol dengan rendemen
sebesar 4,04%. Hasil fraksinasi diperoleh fraksi non polar (Gambar 1).
A
1
A B
2
S
C
B
3
4
5
C Gambar 1. Fraksi non polar (A) ekstrak etanolik kulit batang sirsak diperoleh dari
penggabungan dua kali fraksinasi. B dan C menunjukkan fraksi semi polar dan polar.
2.
Deteksi Kandungan Senyawa dalam Fraksi Non Polar Ekstrak Etanolik Kulit
Batang Sirsak
Deteksi dilakukan terhadap senyawa saponin, polifenol, flavonoid,
minyak atsiri, dan alkaloid. Hasil deteksi menunjukkan adanya kandungan
senyawa saponin, polifenol, flavonoid, dan minyak atsiri. Hasil tersebut tidak
menunjukkan adanya senyawa alkaloid (Gambar 2).
7
Rf = 0,33
A
B
C
D
E
F
G
Gambar 2. Hasil KLT Fraksi Non Polar Ekstrak Etanolik Kulit Batang Sirsak dengan Fase
Gerak n-Heksan:Etil Asetat (9:1) dan Fase Diam Silika Gel GF. Hasil Deteksi Menunjukkan
Kandungan Saponin, Polifenol, Flavonoid, dan Minyak Atsiri
Keterangan :
A
: Deteksi UV 254 nm
B
: Deteksi UV 366 nm
C
: Deteksi pereaksi semprot Liberman-Bourchad di bawah UV 366 nm (deteksi
saponin)
D
: Deteksi pereaksi semprot FeCl3 secara visual (deteksi polifenol)
E
: Deteksi pereaksi semprot Sitroborat di bawah UV 366 nm (deteksi flavonoid)
F
: Deteksi pereaksi semprot Vanilin-H2SO4 secara visual (deteksi minyak atsiri)
G
: Deteksi pereaksi semprot Dragendroff di bawah UV 366 nm (deteksi alkaloid)
3.
Hasil Uji sitotoksik
A
B
Gambar 3. Sel kontrol (A) dan sel perlakuan fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang
sirsak konsentrasi 125 µg/mL (B). Hasil menunjukkan sel relatif hidup.
(
sel hidup
sel mati )
Hasil
menunjukkan
perubahan
konsentrasi
tidak
mempengaruhi
perubahan % sel hidup karena kemungkinan terjadi kontaminasi dan memicu
pertumbuhan sel T47D. Salah satu faktor yang dapat menyebabkan kontaminasi
8
yaitu kurangnya menjaga sterilitas dalam melakukan uji sitotoksik sehingga
bakteri dan jamur dapat tumbuh di dalam media. Hal ini menunjukkan bahwa
fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak tidak mempunyai efek
sitotoksik terhadap sel T47D.
Hasil relatif berbeda dengan hasil sebelumnya. Pengujian bullatacin yang
merupakan salah satu Annonaceous acetogenin diperoleh % sel hidup sebesar
0,15% pada konsentrasi 1 µg/mL dan 1% pada konsentrasi 1 x 10-9 µg/mL terhadap
sel MCF-7/Adr. Kenaikan konsentrasi ekstrak berbanding terbalik dengan % sel
hidup (McLaughlin et al., 1999).
Tabel 1. Hasil uji sitotoksik fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak terhadap
sel T47D
Konsentrasi
(µg/mL)
125,00
62,50
31,25
15,62
7,81
Log konsentrasi
% sel hidup
2,09
1,79
1,49
1,19
0,89
114,94
116,63
112,21
108,84
109,68
Konsentrasi Fraksi vs % Sel Hidup
118
116,63
% Sel Hidup
116
114,94
114
112,21
112
110
109,68
108
108,84
% sel hidup
106
104
7,81
15,62
31,25
62,5
125
Konsentrasi Fraksi µg/mL
Gambar 4. Grafik Hubungan Konsentrasi Fraksi Non Polar Ekstrak Etanolik Kulit Batang
Sirsak dengan Persentase Sel Hidup T47D
Flavonoid merupakan senyawa polifenol yang dikenal memiliki aktivitas
antikanker yang berperan dalam mekanisme sitotoksik dengan menginduksi
program kematian sel (apoptosis) (Srisadono, 2008).
9
Menurut Pinto (2005), sari buah sirsak menghasilkan tannins. Tannins
merupakan salah satu jenis polifenol. Polifenol menghambat terjadinya
karsinogenesis dengan cara menghambat faktor pertumbuhan, aktifasi AP
(activator protein) -1, dan MAP (mitogen-activated protein) kinase sehingga
menurunkan perkembangbiakan dari sel kanker. Selain itu polifenol juga
menghambat metabolisme asam arakidonat yang menyimpang dari kebiasaan
sehingga meningkatkan apoptosis (Lambert, 2005). Tidak semua flavonoid dan
polifenol di kulit batang sirsak bersifat aktif, sehingga fraksi non polar ekstrak
etanolik kulit batang sirsak tidak toksik terhadap sel T47D.
Hal ini mungkin disebabkan juga karena minyak atsiri yang terkandung
dalam fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak mengandung minyak
atsiri yang tidak berefek sitotoksik antara lain β-caryophyllene, epi-α-cadinol, αcadinol yang berasal dari ekstrak etanol daun sirsak (Sausa, 2010). Tidak
tersarinya alkaloid pada fraksi non polar dimungkinkan menjadi penyebab tidak
aktifnya fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang sirsak sehingga tidak
memiliki aktivitas sitotoksik. Alkaloid-alkaloid dalam tanaman sirsak seperti
aporphine dan (-) roemerine merupakan senyawa yang telah dibuktikan
bertanggung jawab terhadap aktivitas sitotoksik (Pinto, 2005).
KESIMPULAN DAN SARAN
KESIMPULAN
1.
Fraksi non polar ekstrak etanolik kulit batang Annona muricata L. tidak
memiliki efek sitotoksik poten terhadap sel T47D.
2.
Hasil komatografi lapis tipis (KLT) menunjukan bahwa fraksi non polar
ekstrak etanolik kulit batang Annona muricata L. terdapat senyawa
saponin, polifenol, flavonoid, dan minyak atsiri.
SARAN
1.
Penelitian dengan menjaga sterilitas dalam melakukan uji sitotoksik.
2.
Penelitian dengan fraksinasi yang berbeda untuk memperoleh hasil yang
lebih baik.
10
UCAPAN TERIMA KASIH
Kepada LPPM melalui Program Hibah Penelitian Kompetitif.
DAFTAR ACUAN
Backer, C. A. D. & Brink, R. C. B. D. D., 1965, Flora of Java (Spermatophytes
Only), NVP Noordhaff, Groningen the Netherlands.
Djajanegara, I. & Wahyudi, P., 2009, Pemakaian Sel HeLa dalam Uji Sitotoksitas
Fraksi Kloroform dan Etanol Ekstrak Daun Annona sqamosa. Jurnal
Ilmu Kefarmasian Indonesia, Vol. 7, No. 1, hal. 7-11.
Lambert, J. D., Hong, J., Yang, G., Liao, J., & Yang, C. S., 2005, Inhibition of
carcinogenesis by polyphenols: evidence from laboratory investigations,
Am J Clin Nutr, 81(suppl):284S–91S.
Mangan, Y., 2003, Cara Bijak Menaklukan Kanker, 3-6, Agro Media Pustaka,
Jakarta.
McLaughlin, J. L., Alali, F. Q., & Liu, X. X., 1999, Annonaceous Acetogenins :
Recent Progress, Journal of Natural Products, 62, 504-540.
Nurrochmad, A., Lukitaningsih, E., & Meiyanto, E., 2011, Anti cancer activity of
rodent tuber (Thyphonium flagelliforme (lodd.) Blume on human breast
cancer t47d cells, International Journal of Phytomedicine, Vol. 3, 138146.
Pinto, A. C. Q., Cordiero, M. C. R., Andrade, S. R. M., Ferraira, F. R., Filgueiras,
H. A. C., Alves, R. E., & Kinpara, D. I., 2005, Annona spesies,
International Centre for Underutilized Crops, University of Southampton,
Southampton.
Sausa, O. V., Vieira, G. D. V., Pinho, J. J. R. G., Yamamoto, C. H., & Alves, M.
S., 2010, Antinociceptive and Anti-Inflammatory Activities of the
Ethanol Extract of Annona muricata L. Leaves in Animal Models,
International Journal of Molecular Sciences, 11, 2067-2078.
Srisadono, 2008, Skrining Awal Ekstrak Etanol Daun Sirih (Piper betle Linn)
Sebagai Antikanker dengan Metode Brine Shrimp Lathaly Test (BLT),
Karya Ilmiah, Fakultas Kedokteran, Universitas Diponegoro.
Syarief, W. R., Aisyah, C., Elviana, E., & Fidiasari, E. R., 2005, Farmakognosi
dan Fitoterapi, EGC, Jakarta.
11
Tjindarbumi, D. & Mangunkusumo, R., 2002, Cancer in Indonesia, Present and
Future, Jpn J Clin Oncol., 32 (Supplement 1), S17-S21
12