analisis filogenetik daerah d-loop dna mitokondria manusia pada

KO-192
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
ANALISIS FILOGENETIK DAERAH D-LOOP DNA MITOKONDRIA
MANUSIA PADA POPULASI PAPUA MELALUI PROSES MARKOV
Epiphani I.Y. Palit,1,*) Alvian Sroyer,1) dan Hendrikus M.B. Bolly2)
1)
Bidang Biostatistika, Jurusan Matematika, Faklutas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Cenderawasih,
Jayapura, Papua
2) Bagian Biokimia, Fakultas Kedokteran, Universitas Cenderawasih
Disajikan 29-30 Nop 2012
ABSTRAK
Kemajuan teknologi biologi molekuler pada saat ini, serta tersedianya informasi sekuen DNA mitokondria (mtDNA) secara
keseluruhan, telah memungkinkan berkembangnya beragam analisis terkait aplikasi dan manfaat dari penemuan mutasi-mutasi
nukleotida tersebut. Dalam era genomik, konsep dasar mengenai penggunaan sekuen DNA mitokondria khususnya pada daerah
D-loop dalam studi filogenetik sangat berkembang karena adanya fakta perubahan nukleotida menurut satuan waktu, sehingga
dapat dikatakan bahwa studi filogenetik ini mengikuti proses Markov dalam kajian ilmu biostatistika. Dalam asumsi ilmu
biostatistika yakni basa nukleotida yang ada pada spesies saat ini tergantung pada basa nukleotida spesies leluhurnya. Studi
filogenetik dengan menggunakan DNA mitokondria manusia didasarkan pada pola pewarisan maternal yang haploid dan
hipervariabilitas pada daerah D-Loop. Dalam riset ini, tujuan yang dicapai adalah menetapkan jenis-jenis mutasi yaitu perubahan
nukleotida yang terjadi pada sekuen nukleotida mtDNA berdasarkan urutan rCRS (revised-Cambridge Reference Sequence) dan
menghitung intensitas perubahan nukleotida, serta dengan menggunakan rantai Markov kontinu dan dengan bantuan metode
Bayes menentukan filogenetik untuk dilihat hubungan kekerabatannya. Di sini, kami laporkan bahwa studi filogenetik yang
dilakukan ini membangun suatu pohon filogenetik untuk melihat hubungan kekerabatan dari beberapa sekuen DNA mitokondria
manusia yang berasal dari populasi Papua. Analisis filogenetik dilakukan melalui proses Markov dengan menggunakan metode
rantai Markov kontinu dan bantuan metode Bayes. Ruang keadaan untuk rantai Markov kontinu adalah basa nukleotida sebagai
pembawa sifat keturunan yakni A, G, C, dan T, dengan indeks parameternya adalah waktu perubahan basa nukleotida dari spesies
leluhur sampai spesies pada waktu sekarang. Dari hasil analisis filogenetik DNA mitokondria yang berasal dari populasi Papua
diperoleh kesimpulan mengenai filogenetik atau hubungan kekerabatan yang paling dekat atas individu-individu tersebut. Hasil
riset ini membuka peluang berkembangnya riset bioetnoantropologi dan genetika populasi modern berbasis analisis filogenetik
DNA. Metode yang dikembangkan ini akan membuka bidang baru dalam studi biostatistika ke depan karena memanfaatkan
elemen mutasi mtDNA pada individu pada suatu populasi tertentu.
Kata Kunci: Filogenetik, DNA Mitokondria Manusia, dan Proses Markov
I. PENDAHULUAN
Penggunaan proses markov dalam proses stokastik
sudah banyak dilakukan pada beberapa bidang, yaitu:
biologi
molekular,
biogeografi,
ekologi,
fisiologi,
bioinformatika, dan sebagainya [1]. Pada bidang biologi
molekular, penelitian-penelitian yang dilakukan didukung
oleh Human Genome Project (HGP) di bawah badan National
Institutes of Health (NIH), Amerika Serikat. Data-data yang
digunakan dalam pengembangan penelitian-penelitian di
bidang biologi molekuler ini dapat diperoleh dari GenBank.
GenBank merupakan salah satu konsorsium bioteknologi
dunia yang merupakan wadah bagi para peneliti untuk
mempublikasikan sekuen basa nukleotida dan protein
sebagai hasil proses translasi basa nukleotida yang
ditemukan melalui kerja di laboratorium. GenBank saling
bekerjasama dan bertukar informasi tentang sekuen terbaru
dengan dua pusat database yang lain yaitu European
Molecular Biology Laboratory (EMBL) yang didirikan oleh
European Bioinformatics Institute (EBI) dan the DNA Data Bank
of Japan (DDBJ) [2-3]. Penggunaan teknik-teknik komputasi
dalam penelitian-penelitian di bidang biologi molekuler,
merupakan salah satu kajian dalam ilmu bioinformatika
yaitu pengembangan aplikasi pada proses stokastik dalam
mengkaji sekuen.
DNA terdapat dalam sel setiap individu, terutama pada
inti sel. Selain itu DNA juga terdapat dalam organel sel yang
lain yaitu mitokondria yang disebut dengan DNA
mitokondria (mtDNA). Hasil-hasil riset mtDNA manusia
dengan sifat-sifatnya yang khas, telah banyak dimanfaatkan
dalam berbagai disiplin ilmu, antara lain studi tentang
KO-193
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
evolusi, genetika populasi, bioinformatika, penyakit genetik,
dan ilmu kedokteran forensik. Informasi yang signifikan
dalam riset yang berhubungan dengan mtDNA yaitu bahwa
urutan/sekuen nukleotida pada daerah D-loop mtDNA
merupakan daerah hipervariabel karena didalamnya
mtDNA mudah mengalami mutasi. Genom mitokondria
yang terdapat pada suatu daerah D-Loop memiliki dua
daerah hipervariabel yaitu Hipervariabel 1 (HV1) dan
Hipervariabel 2 (HV2). Daerah HV1 bersifat sangat variabel
dan mempunyai laju evolusi yang lebih cepat dibandingkan
daerah HV2. Sifat yang hipervariabel tersebut selama ini
dihubungkan
dengan
perbandingan
urutan
dan
mutasi/perubahan nukleotida mtDNA antar individu,
etnis/suku, dan usia [5].
Studi filogenetik dengan menggunakan mtDNA
didasarkan pada pola pewarisan maternal yang haploid dan
hipervariabilitas pada daerah D-Loop. Dalam studi
Gambar 1.
filogenetik, untuk membangun suatu pohon filogenetik
dapat menggunakan sekuen DNA (Felsenstein, 1981),
sedangkan penelitian lainnya, dalam studi filogenetiknya
menggunakan sekuen mtDNA yaitu sekuen-sekuen mtDNA
Human, Chimpanzee, Gorilla, dan Orangutan [7]. Pemikiran
dasar penggunaan sekuen DNA/mtDNA dalam studi
filogenetik adalah bahwa terjadi perubahan basa nukleotida
menurut satuan waktu, sehingga dapat dikatakan bahwa
studi filogenetik ini mengikuti proses Markov, yaitu basa
nukleotida yang ada pada spesies sekarang tergantung pada
basa nukleotida pada spesies ancestralnya/leluhurnya.
Secara umum, DNA merupakan unit dasar informasi yang
mengkode organisme, selain itu pula menghasilkan
informasi yang banyak dan beragam, dengan demikian akan
ada banyak bukti tentang kebenaran suatu hubungan
filogenetik.
Pohon filogenetik dengan keempat spesies, dengan perubahan
basa nukleotida terjadi per satuan waktu.
Keberhasilan
dalam analisis
filogenetik sangat
tergantung pada akurasi proses penjajaran (alignment), yaitu
suatu proses untuk menentukan apakah suatu sekuen
mtDNA adalah homolog dengan yang lainnya. Analisis
homologi dapat dilakukan berdasarkan urutan CRS atau
rCRS
(revised-Cambridge
Reference
Sequence)
[8-9].
Penggunaan CRS dengan bantuan program DNASTAR yaitu
EditSeq dan SeqMan digunakan juga dalam menentukan
adanya mutasi atau perubahan basa yang terjadi pada setiap
sekuen nukleotida yang homolog.
Penelitian sebelumnya, dalam studi filogenetiknya
menggunakan rantai markov kontinu terhadap proses
perubahan basa nukleotida dari sekuen-sekuen mtDNA dan
untuk menentukan pohon filogenetiknya digunakan metode
Bayes [7]. Metode ini didasarkan pada peluang bersyarat di
mana data observasi diberikan, yang artinya data observasi
berpengaruh terhadap peluang terpilihnya suatu pohon
filogenetik.
Kajian filogenetik yang dilakukan ini membangun suatu
pohon filogenetik untuk melihat hubungan kekerabatan dari
beberapa sekuen mtDNA manusia pada populasi Papua
melalui proses Markov dengan menggunakan metode rantai
Markov kontinu dan dengan bantuan metode Bayes. Proses
perubahan basa nukleotidanya diasumsikan mengikuti
proses poisson dengan parameter jumlah mutasi/perubahan
basa nukleotida per satuan waktu. Sedangkan waktu dalam
KO-194
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
perubahan basa nukleotidanya akan mengikuti distribusi
eksponensial.
menentukan tingkat relatif dari perubahan masing-masing
basa nukleotida DNA di sepanjang sekuen.
II. METODOLOGI
E. Model matriks intensitas transisi (Q)
Pada saat ini terdapat beberapa model matriks intensitas
transisi untuk model Markov yang umum digunakan pada
sekuen-sekuen nukleotida dalam studi filogenetik dengan
kajian biostatistika. Model matriks intensitas transisi yang
digunakan dalam penelitian ini yaitu model HKY85 [10].
Model ini menyatakan bahwa terjadinya substitusi transisi
dan transversi adalah bias dan frekuensi dari tiap basa
nukleotida tidak sama. Parameter-parameter yang
A. Rantai Markov Diskrit
Pada umumnya diasumsikan bahwa ruang keadaan dari
suatu rantai markov adalah berhingga. Rantai markov
diskrit dalam studi filogenetika dengan penggunaan sekuen
DNA,
mempunyai
ruang
keadaan
diskrit
yang
direpresentasikan melalui basa-basa nukleotida A, G, C, dan
T
dengan
indeks
parameternya
adalah
jumlah
sekuen/spesies.
B. Rantai Markov Kontinu
Rantai Markov yang digunakan dalam penelitian ini
menggunakan kasus di mana ruang keadaan S
berhingga/diskrit yang direpresentasikan melalui basa-basa
nukleotida A, G, C, dan T dari suatu sekuen DNA. Karena
basa-basa nukleotida tersebut mengalami mutasi/perubahan
dalam satuan waktu, maka dalam analisis filogenetiknya
akan digunakan rantai Markov kontinu dengan waktu
sebagai indeks parameternya. Dalam studi filogenetik indeks
parameter waktu dapat digambarkan sebagai panjang
cabang dari suatu pohon filogenetik.
digunakan dalam model ini adalah
dan , di mana
merupakan faktor intensitas transisi basa nukleotida,
sedangkan
nukleotida. Parameter-parameter lainnya yaitu
( )
dengan suatu nilai
artinya per unit waktu mutasi terjadi dengan tingkat/rate .
Jumlah peristiwa mutasi yang terjadi merupakan suatu
D. Matriks intensitas transisi (Q)
Proses substitusi sekuen nukleotida DNA seperti yang
telah diuraikan pada proses poisson, dapat digeneralisasi
dengan menggunakan matriks Q, yaitu matriks yang
site/posisi basa sekuen nukleotida
…T G T C G…
spesies 2
…T G A C G…
spesies 3
…T C C G A…
spesies 4
k
l5
l6
j
i
l1
A
,
yang
DNA,
yang
pada
peluang posterior dari suatu pohon filogenetik ( ), yang
disesuaikan dengan matriks data observasi (X) dari sekuen
DNA
yang
telah
diurutkan
(alignment)
dengan
menggunakan rumus Bayes. Untuk mempermudah
pemahaman penggunaan metode Bayes pada analisis
filogenetik, dapat diperhatikan ilustrasi berikut ini, di mana
notasi-notasi penulisan yang digunakan pada ilustrasi dapat
disesuaikan dengan notasi-notasi penulisan.
( ) menyatakan peluang k
bilangan bulat. Misalkan
mutasi yang terjadi selama waktu t.
spesies 1
,
=
F. Metode Bayes pada analisis filogenetik
Dalam menentukan suatu pohon filogenetika
menggunakan karakter molekuler misalnya sekuen
dapat digunakan metode Bayes. Metode Bayes
digunakan dalam studi filogenetik berdasarkan
yang terjadi selama waktu t,
…T C A G G…
,
dan
yang masing-masing merupakan frekuensi basa
setimbang, yaitu peluang munculnya masing-masing basa
nukleotida pada setiap sekuen/spesies. Sedangkan rasio
tingkat substitusi transisi dan transversi dapat dihitung
C. Proses Poisson
Proses poisson dapat digunakan untuk menghitung
banyaknya mutasi
merupakan faktor intensitas transversi basa
l2
l3
T
Gambar 2. Contoh topologi pohon biner berpuncak
A
((1,2),(3,4))
l4
C
KO-195
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
Pada Gambar 2 notasi-notasi yang digunakan yaitu,
=
( , , ) dengan i dan j merupakan node-node internal dan
k merupakan root, node-node eksternalnya adalah basa-basa
nukleotida
A,
C,
G,
dan
T,
=
sedangkan
cabang dapat dihitung terpisah. Peluang transisi basa
nukleotida dari node ;
∈ { , , , } ke node-node
eksternal yang berupa basa nukleotida A dan T sebagai
berikut:
, , , , , merupakan panjang cabang. Oleh karena
setiap keturunan adalah saling bebas (sifat Markov), maka
peluang tiap node internal yang masing-masing memuat 2
( → | ) ( → | )= ( = ) ( )
( ) + ( = ) ( )
+ ( = ) ( )
( ) + ( = ) ( )
( )
Nilai-nilai peluang (
matriks peluang transisi.
)
( )
,
( )
( )
,
G. Proses penentuan filogenetik DNA mitokondria
manusia
Analisis mutasi basa nukleotida yang dilakukan
terdapat pada daerah HV1; Menghitung frekuensi basa
setimbang nukleotida A, C, G, dan T tiap urutan/sekuen
mtDNA, yaitu dengan mencari proporsi tiap basa nukleotida
masing-masing sekuen terhadap panjang sekuennya.
Hasilnya dinotasikan dengan πA, πG, πC, dan πT; Menghitung
jumlah mutasi/substitusi transisi dan transversi basa
nukleotida tiap urutan/sekuen mtDNA; Menghitung
intensitas mutasi/substitusi transisi (α) dan transversi (β)
basa nukleotida mtDNA tiap urutan/ sekuen, yang diperoleh
dengan menghitung proporsi mutasi transisi dan transversi
terhadap panjang sekuen; Membentuk matriks intensitas
substitusi
untuk model HKY85; Membentuk matriks
peluang transisi ( ) untuk model HKY85; Menentukan
Tabel 1.
( )
( )
, dan
( )
( )
( )
dapat dilihat pada
pohon filogenetik melalui metode Bayes melalui simulasi
Monte Carlo; Pohon filogenetik yang dipilih yaitu pohon
filogenetik yang mempunyai peluang posterior terbesar.
III. HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari hasil penjajaran sekuen individu manusia Papua
terhadap CRS dengan menggunakan program SeqMan
dapat dilihat bahwa posisi awal keempat sekuen pada
urutan 16041 dan posisi akhir keempat sekuen pada 16569
mtDNA. Frekuensi basa setimbang diperoleh dengan
mencari proporsi tiap basa nukleotida pada masing-masing
sekuen terhadap panjang sekuennya yang sudah homolog
dengan urutan CRS. Hasil perhitungannya dapat dilihat
pada Tabel 1 berikut ini:
Tabel perhitungan frekuensi basa nukleotida setimbang untuk model HKY85. Frekuensi basa setimbang
( , , , ) untuk HKY85
Papua 1
Papua 2
Papua 3
Papua 4
= 161
= 165
= 166
= 165
= 0,3043
= 0,3119
= 0,3138
= 0,3119
0,3043 + 0,3119 + 0,3138 + 0,3119 1,2419
=
=
= 0,3105
4
4
= 76
= 74
= 74
= 74
= 0,1437
= 0,1399
= 0,1399
= 0,1399
0,1437 + 0,1399 + 0,1399 + 0,1399 0,5634
=
=
= 0,1409
4
4
= 173
= 175
= 174
= 174
= 0,3270
= 0,3308
= 0,3289
= 0,3289
0,3270 + 0,3308 + 0,3289 + 0,3289 1,3156
=
=
= 0,3289
4
4
rCRS
= 165
= 0,3119
= 73
= 0,1380
= 175
= 0,3308
=
KO-196
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
= 119
= 0,2250
=
= 115
= 0,2174
= 115
= 0,2174
= 116
= 0,2193
0,2250 + 0,2174 + 0,2174 + 0,2193 0,8791
=
= 0,2198
4
4
Pada Tabel di atas nilai-nilai
,
,
, dan
relatif
sama untuk keempat sekuen. Sehingga untuk menduga
frekuensi basa setimbang dari tiap basa nukleotida dapat
digunakan nilai-nilai taksiran
,
,
, dan
perhitungan dengan menggunakan program
. Hasil
Matlab
= 116
= 0,2193
diberikan berikut (Tabel 2). Kemudian dari Tabel 2 dapat
dihitung intensitas mutasi/substitusi masing-masing basa
nukleotida. Hasil perhitungan dapat dilihat pada tabel
berikut (Tabel 3).
Tabel 2.
Jumlah dan jenis mutasi/substitusi pada empat sekuen populasi Papua.
Jenis Mutasi/Substitusi
Sampel
Banyaknya Mutasi
Transisi
Transversi
Papua 1
15
6
9
Papua 2
13
2
11
Papua 3
14
2
12
Papua 4
9
2
7
Intensitas mutasi/substitusi transisi (
Intensitas mutasi/substitusi
Transisi
Transversi
Sampel
Tabel 3.
Papua 1
Papua 2
Papua 3
Papua 4
( )
0.0113
0.0038
0.0038
0.0038
( )
0.0170
0.0208
0.0227
0.0132
) dan transversi ( ) pada empat sekuen populasi Papua.
Jenis mutasi/substitusi
Transisi
Transversi
6
2
2
2
9
11
12
7
Perhitungan taksiran untuk intensitas substitusi transisi adalah:
=
0.0113 + 0.0038 + 0.0038 + 0.0038 0.0227
=
= 0.0057
4
4
Sedangkan taksiran untuk intensitas substitusi transversi adalah:
Sehingga rasio intensitas
0.0170 + 0.0208 + 0.0227 + 0.0132 0.0737
=
= 0.0184
4
4
substitusi transisi ( ) dan transversi ( ) tiap sekuen dapat dihitung dengan
=
suatu nilai
(Tabel 4).
Tabel 4.
Rasio intensitas mutasi/substitusi transisi ( ) dan transversi ( ) pada empat sekuen populasi Papua.
Intensitas mutasi/substitusi
Sampel
Transisi ( )
Transversi ( )
Papua 1
0.0113
0.0170
0.6647
Papua 2
0.0038
0.0208
0.1827
Papua 3
0.0038
0.0227
0.1674
Papua 4
0.0038
0.0132
0.2879
=
KO-197
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
Selanjutnya dapat dihitung nilai taksiran dari rasio intensitas substitusi transisi dan transversi basa nukleotida yaitu dengan
menghitung rata-rata dari nilai
yang diperoleh dari Tabel 4, sebagai berikut:
0.6647 + 0.1827 + 0.1674 + 0.2879 1.3027
̂=
=
= 0.3257
4
4
Dari hasil yang diperoleh, selanjutnya dapat dibentuk taksiran matriks intensitas transisi/substitusi
berikut:
=
−0.1503 0.0019
0.1021
0.0463
0.0013 −0.1497 0.1021
0.0463
0.0723
0.1082 −0.1813 0.0008
0.0723
0.1082
0.0018 −0.1822
model HKY85, sebagai
Taksiran rata-rata tingkat substitusi basa nukleotida per satuan waktu adalah:
̂ =−
(−
+
) +
+
Menentukan pohon filogenetik
Tabel 5. Tabel simulasi Monte Carlo untuk mencari peluang posterior
Topologi
log (
| ℎ
)
( ℎ
)
( )
((1,2),(3,4))
((3,4),(1,2))
((1,3),(2,4))
((2,4),(1,3))
((2,3),(1,4))
((1,4),(2,3))
(((1,2),3),4)
(((1,2),4),3)
(((1,3),2),4)
(((1,3),4),2)
(((1,4),2),3)
(((1,4),3),2)
(((2,3),1),4)
(((2,3),4),1)
(((2,4),1),3)
(((2,4),3),1)
(((3,4),1),2)
(((3,4),2),1)
(
(
Didalam
|
|
ℎ
ℎ
-1626,0
-1628,2
-1618,2
-1643,9
-1603,5
-1596,7
-1640,6
-1648,7
-1633,9
-1669,3
-1634,1
-1656,7
-1607,2
-1571,0
-1599,0
-1578,8
-1641,9
-1584,7
simulasi
di
atas
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
0,055
digunakan
) +
)
−(
+
−(
+
= 0.1642
log
) , dikarenakan dalam perhitungan
) nilainya sangat kecil (mendekati
nol). Hasil perhitungan pada tabel di atas pada umumnya
menunjukkan adanya perubahan setiap
( ℎ
)
yang merupakan peluang awal (prior) dari nilainya yang
seragam 0,055. Sedangkan topologi pohon filogenetik yang
lebih sesuai dengan data yang diberikan yaitu topologi
(
(
ℎ
−(
|
|
)
0,055718515
0,055793903
0,055451230
0,056331898
0,054947502
0,054714485
0,056218816
0,056496381
0,055989226
0,057202286
0,055996079
0,056770519
0,055074291
0,053833817
0,054793300
0,054101102
0,056263364
0,054303278
+
)
)
pohon filogenetik yang mempunyai peluang posterior
terbesar. Pada Tabel 5 peluang posterior terbesar ada pada
topologi pohon filogenetik (((1,3),4),2) yang mempunyai nilai
peluang yang meningkat dari 0,055 yang merupakan
peluang prior menjadi 0,057202286 yang merupakan peluang
posteriornya. Hasil analisis pohon filogenetik dapat
diilustrasikan pada gambar berikut (Gambar 3).
KO-198
0377: Epiphani I.Y. Palit dkk.
Papua 1
Gambar 3.
Papua 3
Papua 4
Papua 2
Topologi pohon filogenetik yang terpilih dari hasil simulasi berdasarkan peluang posterior yang terbesar.
IV. KESIMPULAN
Berdasarkan analisis dan hasil pembahasan studi kasus
filogenetik DNA mitokondria manusia, dapat diambil
simpulan bahwa filogenetik DNA Mitokondria manusia
dapat dianalisis dengan menggunakan metode Bayes
melalui proses Markov yang dimungkinkan karena adanya
proses evolusi yang terjadi mulai dari spesies nenek
moyang/leluhur suatu individu sampai pada spesies yang
ada pada saat ini. Penentuan topologi filogenetik
berdasarkan peluang posterior yang terbesar dari hasil
simulasi Monte Carlo atau dikenal dengan istilah metode
MCMC (Markov Chain Monte Carlo) yang akan
memaksimalkan fungsi peluang gabungan dari data yang
diberikan. Dari hasil simulasi Monte Carlo pada umumnya
peluang posterior topologi pohon filogenetik menunjukkan
adanya peningkatan dari nilai
( ℎ
) yang
merupakan peluang awal (prior) dengan nilai seragam 0,055.
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
DAFTAR PUSTAKA
[1]
[2]
[3]
[4]
Cann, R.L., Stoneking, M., and Wilson, A.C. (1987),
Mitochondrial DNA and human evolution, Nature,
325, 31-36.
Ingman, M and Gyllensten, U, (2001), Analysis of the
complete human mtDNA genome: methodology and
inferences for human evolution. The American Genetic
Association. 92, 454-61.
MITOMAP, 2012. Mitochondrial DNA base
substitution disease. Melalui www.mitomap.org,
[November, 2012]
Albert, B., Bray, D.J., Watson, J.D., (1994), Molecular
Biology of the cell 3rd edition, New York: Garland
Publishing Inc.
[10]
Ngili, Y., Palit, E.I.Y., Bolly, H.M.B., and Ubyaan, R.,
(2012), Cloning and Analysis of Heteroplasmy in
Hypervariable Segment I (HVS1) D-loop in
Mitochondrial DNA of Human Isolates of Timika and
Wamena in Highlands of Papuan Province, Indonesia,
Journal of Applied Sciences Research, 8, pp. 2232-2240
Howard, M.T., and Karlin, S, (1994), An Introduction to
Stochastic Modeling, Revised Edition, Academic Press,
California
Yang, Z., and B, Rannala, (1997), Bayesian Phylogenetic
Inference Using DNA Sequence: A Markov Chain Monte
Carlo Method, Molecular Biology Evolution 14(7):717724
Anderson, S., Bankier, A.T., Barrell, B.G., de Bruijn,
M.H., Coulson, A.R., and Drouin, J. (1981), Sequence
and organization of the human mitochondrial
genome. Nature. 290: 457-65.
Andrews, R.M., Kubacka, I., Chinnery, P.F.,
Lightowlers, R.N., Turnbull, D.M., and Howell, N.
(1999), Reanalysis and revision of the cambridge
reference sequence for human mitochondrial DNA.
Nature Genetics, 23, 147.
Hasegawa, M., Kishino, H., and Yano, T, (1985),
Dating of The Human-Ape Splitting by a Molecular Clock
of Mitochondrial DNA, Molecular Evolution 22:160-174