9 3 METODOLOGI Waktu dan Tempat Penelitian ini

9
3 METODOLOGI
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan mulai April 2012 sampai dengan Agustus 2012 di
Laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan
Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Badan Penelitian dan
Pengembangan Pertanian.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah populasi BC3F4 dari persilangan
antara padi japonica cv. Nipponbare transgenik dan padi indica kultivar Ciherang.
Ciri-ciri padi Ciherang disajikan pada Lampiran 1. Primer HPT-F (5’
GATGCCTCCGCTCGAAGTAGCG
3’)
dan
primer
HPT-R
(5’
GCATCTCCCGCCGTGCAC3’) digunakan untuk mengidentifikasi adanya gen
hpt. Primer 35S - F (5’ GAGAGAAAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCAAA 3’)
dan primer CsNitr1-L-R (5’ ATAGATGATGGAGGCGATGG 3’) digunakan
untuk mengetahui gen CsNitr1-L yang difusikan dengan promoter 35S CaMV
menggunakan polymerase chain reaction (PCR). Primer Aktin-F (5’
TCCATCTTGGCATCTCTCA
3’)
dan
Primer
Aktin-R
(5’
GTACCCGCATCAGGCATC 3’) digunakan untuk mengamplifikasi aktin
sebagai kontrol internal tanaman padi untuk mengetahui keberadaan DNA genom.
Posisi primer HPT, 35S dan CsNitr1 disajikan pada gambar 4.
Gambar 4. Peta daerah T-DNA plasmid pIG121HM. RB = right border;
PNOS= promoter nopaline sythase; NPTII = neomycin
phosphotransferase II; TNos = terminator nopaline sythase untuk
gen target; CsNitr1-L = nitrit reduktase; P35S = promoter 35S
CaMV; hpt = hygromisin phosphotransferase; LB = left border;
10
Metode Penelitian
Seleksi kecambah transgenik dengan higromisin
Biji padi dikeringkan di dalam inkubator pada suhu 45 °C selama 2 hari.
Biji-biji tersebut kemudian disterilisasi dengan perendaman dengan etanol 70%
selama 1 menit dan pada larutan pemutih/bleach 30% (konsentrasi akhir sodium
hypochlorite NaOCl 2%) + tween selama 1 jam. Biji kemudian dibilas dengan
akuades steril sebanyak lima kali. Biji yang telah disterilkan kemudian
ditumbuhkan di media MS0 yang mengandung 50 mg/l antibiotik higromisin
selama tiga minggu untuk mendapatkan tanaman yang tahan higromisin. Sebagai
kontrol terhadap efektifitas media seleksi, padi non transgenik ditanam di media
selektif yang sama dengan media untuk tanaman transgenik.
Bibit yang tumbuh dipindahkan ke cawan petri baru dengan media air
selama 1 minggu kemudian bibit dipindah ke media tanam berupa bak kecil yang
berisi tanah selama 2 minggu. Selanjutnya bibit ini dipindah ke media ember yang
berisi tanah, yang telah dianalisis terlebih dahulu untuk mengetahui kandungan Ntotal. Tanah yang digunakan sebagai media tumbuh adalah 10 kg/ember. Setiap
ember ditanami satu bibit.
Perlakuan pupuk
Tanaman transgenik dan non transgenik yang telah dipindah ke ember
diberi pupuk dasar 100 kg TSP dan 100 kg/ha KCl tiap hektar, pada saat tanam.
Pupuk urea diberikan sebagai perlakuan dengan empat taraf yaitu 0, 50, 100 dan
150 kg/ha. Urea di berikan 3 kali yaitu 25% pada saat tanam, 25% berumur 4
MST dan 50% memasuki primordia akhir. Percobaan setiap genotipe pada setiap
dosis pemupukan terdiri dari dua bibit.
Analisis fenotipe
Fenotipe yang diamati meliputi tinggi tanaman, jumlah tanaman tiap
rumpun, berat kering tanaman, hari mulai berbunga, panjang malai, berat 100 biji,
jumlah biji per malai dan berat biji tiap rumpun. Data yang diperoleh kemudian
dianalisis dengan uji beda nyata. Tinggi tanaman diukur mulai dari titik tumbuh
hingga leher malai, yang dilakukan di akhir penelitian (panen) terhadap satu
tanaman yang paling tinggi dalam satu rumpun. Jumlah anakan tiap rumpun
dihitung ketika tanaman memasuki masa reproduktif ditandai dengan keluarnya
malai dengan menghitung semua tanaman dalam satu rumpun dikurangi dengan
tanaman induk. Umur berbunga dihitung dari saat tanam sampai dengan tanaman
menghasilkan malai.
Panjang malai diukur dari pangkal malai sampai dengan ujung malai
dengan mengambil 3 malai tiap rumpun kemudian di rata-ratakan. Berat seratus
biji dihitung berdasarkan rata-rata dari tiga kali penimbangan dari 100 biji yang
diambil secara acak untuk tiap rumpun. Berat biji tiap rumpun diukur dengan
menimbang seluruh biji yang dihasilkan tanaman dalam satu rumpun. Jumlah biji
per malai dihitung berdasarkan rata-rata dari 3 malai tiap rumpun yang diambil
secara acak.
11
Rancanan percobaan
Percobaan ini terdiri dari 4 macam dosis pemupukan yaitu 0, 50, 100 dan
150 kg/ha. Masing-masing percobaan pemupukan menggunakan rancangan acak
kelompok dengan satu perlakuan dan dua ulangan. Perlakuan terdiri dari lima
genotipe. Masing-masing perlakuan terdiri dari dua tanaman. Adapun rumus
matematikanya adalah sebagai berikut:
Yij = µ + τi + Bj + єij
Dimana :
Yij : Pengamatan Faktor genotipe taraf ke-i, faktor pemupukan taraf kej dan
kelompok ke-k
µ : Rataan Umum
τi : Pengaruh Faktor genotipe pada taraf ke-i
Bj : Pengaruh Kelompok pada taraf ke-j
єij : Pengaruh galat pada faktor genotipe taraf ke-i dan kelompok ke-j
Pengolahan data dilakukan terhadap pengaruh genotipe untuk masingmasing dosis pemupukan dan tidak dilakukan pengolahan antar dosis pemupukan.
Isolasi DNA tanaman
Isolasi DNA tanaman padi menggunakan prosedur CTAB (Doyle & Doyle
1990) yang dimodifikasi. DNA diisolasi dari tanaman padi setelah dipindah ke
bak kecil. Sebanyak 0,5 g daun padi digerus dengan nitrogen cair hingga
membentuk serbuk kemudian ditambahi 600 µl larutan buffer CTAB (CTAB,
PVP, ß-merkaptoetanol) dan 1/10 volume Na asetat di dalam tabung mikro.
Selanjutnya tabung mikro yang berisi suspensi sel dan DNA diinkubasi pada suhu
65°C selama 30 menit dan diinkubasi di dalam es selama 5 menit. Setelah itu, 1x
vol chloroform-isoamil alkohol (24:1) ditambahkan kedalam suspensi tersebut,
kemudian dibolak-balik agar tercampur dan dilanjutkan dengan sentrifugasi
11.000 g selama 15 menit. Cairan yang terdapat di atas dipindahkan ke tabung
mikro baru kemudian ditambahi dengan 1/10 volume Na asetat, 2/3 volume
isopropanol dingin dan 2 x volume etanol absolute (98%) lalu di bolak-balik
sebentar agar tercampur, kemudian diinkubasi di es selama 15 menit. Tabung
disentrgifugasi lagi dengan kecepatan 11.000 g. Cairan dibuang dan endapan yang
terbentuk ditambahi dengan etanol 70% kemudian disentrifugasi kembali dengan
kecepatan 11.000 g selama 5 menit. Endapan yang ada dikeringkan dengan vakum
5 menit, lalu dilarutkan dengan 50 µl buffer TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA)
dan diberi perlakuan 1µl RNAse (100 µg/µl). Suspensi DNA kemudian diinkubasi
37 °C selama 30 menit. Kualitas dan kuantitas DNA yang diisolasi selanjutnya
diukur dengan nanodrop.
12
Analisis gen hpt dan CsNitr1-L dengan PCR
DNA yang telah diisolasi selanjutnya dianalisis dengan PCR
menggunakan metode Sambrook dan Russel (1989). Reaksi PCR terdiri dari 100
ɳg DNA, 7,5 µl Readymix PCR kit 2G, 0,75 DMSO, 0,75 µl primer forward (10
µM), 0,75 µl primer reverse (10 µM), dan 4,25 µl ddH2O steril dengan total
volume 15 µl. Kondisi PCR yang digunakan untuk analisis gen hpt adalah pra
PCR 94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 30 detik, annealing 65°C
selama 30 detik, extention pada suhu 72°C selama 30 detik. Seluruh rangkaian
dilakukan selama 35 siklus dan diakhiri dengan pasca PCR pada suhu 72°C
selama 5 menit. Kondisi PCR yang digunakan untuk analisis gen CsNitr1-L
adalah pra PCR 95°C selama 4 menit, denaturasi pada suhu 94°C selama 1 menit,
annealing pada suhu 55°C selama 45 detik, extention pada suhu 72°C selama 1
menit. Seluruh rangkaian dilakukan sebanyak 30 siklus, diakhiri dengan pasca
PCR pada suhu 72°C selama 5 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose
1 % pada voltase 75 volt selama 45 menit. Selanjutnya gel direndam dengan
larutan etidium bromida (0,5 mg/l) selama 10 menit dan di air selama 7 menit.
Visualisasi pita DNA di gel dilakukan di bawah UV transiluminator dengan Gel
Doc.