abstract - IPB Repository

ABSTRACT
YESSY VELINA. Detection and Cloning of α-Glucosidase Inhibitor Gene of
Streptomyces sp. BWA 65 and Its Potential as an Anti Hyperglycemic in Mice
(Mus musculus). Supervised by YULIN LESTARI and MIN RAHMINIWATI.
Diabetes mellitus is a metabolic disorder characterized by the presence of
hyperglycemia due to defective insulin secretion, defective insulin action or both.
One therapeutic approach for treating diabetes is to decrease the post-prandial
hyperglycemia. This is done by preventing the absorption of glucose through the
inhibition of the carbohydrate-hydrolysing enzymes α-glucosidase and α-amylase
in the digestive tract. Actinomycetes have been known as source of
commercialized acarbose, an α-glucosidase inhibitor. Acarbose is keto analog
moieties of the C7N aminocyclitols. Sedoheptulose 7-phosphate is converted into
2-epi-5-epi-valiolone via the activity of sedoheptulose 7-phosphate cyclase, at the
first step of the biosynthesis of C7N aminocyclitol. This research aimed to detect
and clone sedoheptulose 7-phosphate cyclase gene and to investigate the
capability of crude α-glucosidase extract from Streptomyces sp. BWA 65 in
lowering blood glucose levels in mice. Detection of sedoheptulose 7-phosphate
cyclase gene was done by using Polymerase Chain Reaction (PCR) with designed
primers C7N aminocyclitol. The primer used was designed on the basis of the
known sequence of sedoheptulose 7-phosphate cyclase (acbC) from that of
Actinoplanes sp. SE50/100 which was then cloned by T-Vector pMD20. The in
vivo experiment was conducted by using thirty mice, by the oral glucose tolerance
test (OGTT) and induction of streptozotocin diabetes methods. The result showed
that there was similarity of nucleotide series sedoheptulose 7-phosphate cyclase of
Streptomyces sp. BWA 65 wich have 100 % sequence similiarity with DNA
fragment of sedoheptulose 7-phosphate cyclase Actinoplanes sp. complete
acarbose (acb) gene cluster, strain SE50/110, accses number Y18523.4 reported in
the GenBank analysis through Blast Program. The result indicated that the
designed primer was able to amplify the sedoheptulose 7-phosphate cyclase
acarbose although the accomplishment in amplifying the gene was still up to 300
bp. The result for in vivo experiment by oral glucose tolerance test (OGTT)
showed that α-glucosidase extract from Streptomyces sp. BWA 65 had potency
about 75 percent in decreasing blood glucose levels postprandial compare to
acarbose and for induction of streptozotocin diabetes showed that α-glucosidase
extract from Streptomyces sp. BWA 65 had an effect in decreasing blood glucose
levels diabetic mice hyperglycemia better than the acarbose concentration
examined. The in vivo experiment indicated that α-glucosidase inhibitor from
Streptomyces sp. BWA 65 had potential as antidiabetic in mice.
Keywords: Diabetes mellitus, Streptomyces sp. BWA 65, inhibitor α-glucosidase
sedoheptulose 7-phosphate cyclase, kadar glukosa darah, mencit.
RINGKASAN
YESSY VELINA. Deteksi dan Kloning Gen Inhibitor α-Glukosidase
Streptomyces sp. BWA 65 serta Potensinya sebagai Anti Hiperglikemik pada
Mencit (Mus musculus). Dibimbing oleh YULIN LESTARI dan MIN
RAHMINIWATI.
Diabetes melitus (DM) menjadi masalah penting dunia dengan jumlah
penderita yang terus meningkat, termasuk di Indonesia. Badan Kesehatan Dunia
(WHO) memprediksi bahwa jumlah penderita diabetes di dunia akan meningkat
dari 171 juta di tahun 2000 menjadi 366 juta di tahun 2030. DM adalah penyakit
yang terkait dengan gangguan metabolisme yang ditandai dengan hiperglikemia
akibat tidak ada sekresi insulin dari sel beta pankreas dan akibat dari resistensi
reseptor terhadap insulin. Salah satu cara pengobatan DM adalah dengan
menurunkan kadar glukosa darah setelah makan. Hal ini dapat dilakukan dengan
menghindari penyerapan glukosa dengan cara menghambat enzim penghidrolisis
karbohidrat yaitu enzim α-glukosidase. Aktinomiset diketahui dapat menghambat
aktivitas enzim α-glukosidase dengan menghasilkan inhibitor α-glukosidase
berupa acarbose. Inhibitor α-glukosidase acarbose berasal dari produk alami
mikrob yang dihasilkan oleh Actinoplanes sp. SE50/100 dari produk C7N
aminocyclitol. Sedoheptulosa 7-fosfat akan diubah menjadi 2-epi-5-epi valiolone
oleh enzim sedoheptulosa 7-fosfat siklase pada langkah awal biosintesis C7N
aminocyclitol.
Penelitian ini bertujuan mendeteksi gen sedoheptulosa 7-fosfat siklase dan
mengkaji kemampuan senyawa bioaktif inhibitor α-glukosidase yang dihasilkan
oleh Streptomyces sp. BWA 65 dalam menurunkan kadar glukosa darah mencit
secara in vivo. Deteksi gen dilakukan dengan menggunakan Polymerase Chain
Reaction (PCR) dengan primer didesain berdasarkan susunan sekuen
sedoheptulose 7-fosfat siklase (acbC) yang telah diketahui pada Actinoplanes sp.
SE50/100. Hasil produk PCR kemudian diklon ke dalam vektor plasmid pMD20.
Pengujian aktivitas antihiperglikemik in vivo dilakukan menggunakan 30 mencit
yang dibagi ke dalam 5 kelompok perlakuan, yaitu kelompok 1 sebagai kontrol
positif diberikan acarbose, kelompok 2 sebagai kontrol negatif yang diberi
akuades, dan kelompok 3 sampai dengan 5 diberi diberikan 3 dosis perlakuan
ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 masing-masing 0.036 mg/30 g BB
(P1), 0.36 mg/30 g BB (P2), 3.6 mg/30 g BB (P3).
Hasil amplifikasi dengan PCR yang telah didesain untuk mendeteksi gen
sedoheptulosa 7-fosfat siklase pada Streptomyces sp. BWA 65 menghasilkan pita
spesifik dan ukuran fragmen DNA sekitar 300 bp. Sekuen nukleotida gen
sedoheptulosa 7-fosfat siklase Streptomyces sp. BWA 65 menunjukkan kemiripan
identitas 100 % dengan gen acbC di Actinoplanes sp. SE50/110 complete
acarbose (acb) gene cluster, strain SE50/110 dengan nomor akses Y18523.4 yang
terdapat di pusat data GenBank.
Hasil uji in vivo menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat Streptomyces sp.
BWA 65 dapat menurunkan kadar glukosa darah mencit postprandial
hiperglikemik. Tes toleransi glukosa oral (TTGO) menunjukkan bahwa perlakuan
berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95% dengan penurunan Area Under Curve
(AUC) tertinggi terjadi pada P3 sebesar 24.71%. Hal ini menunjukkan bahwa
ekstrak etil asetat Streptomyces sp. BWA 65 memiliki kemampuan sebagai
inhibitor α-glukosidase dan mampu menekan kenaikan kadar glukosa darah
sesaat. Aktivitas antihiperglikemik dengan induksi streptozotosin, menunjukkan
bahwa perlakuan berbeda nyata pada taraf kepercayaan 95%. Ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65 memiliki kemampuan menurunkan kadar glukosa
hiperglikemik dengan penurunan kadar glukosa darah tertinggi terjadi pada P1
sebesar 26%. Hasil uji in vivo menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat
Streptomyces sp. BWA 65 berpotensi sebagai antidiabetes pada mencit.
Kata kunci:
Diabetes mellitus, Streptomyces sp. BWA 65, inhibitor αglukosidase, sedoheptulose 7-fosfat siklase, kadar glukosa darah,
mencit.