Gunting Molekuler untuk Modifikasi Gen secara Terarah

TALEN: Gunting Molekuler untuk Modifikasi Gen secara Terarah - 10-09-2013
BB Biogen, Bogor - http://biogen.litbang.deptan.go.id
TALEN: Gunting Molekuler untuk Modifikasi Gen secara
Terarah
Artikel - Rabu, Oktober 09, 2013
http://biogen.litbang.deptan.go.id/index.php/2013/10/talen-gunting-molekuler-untuk-modifikasi-gen-secara-terarah/
Genom dikendalikan sebagian besar oleh protein-protein penempel DNA yang bekerja secara spesifik sekuen. Prinsip-prinsip yang mendasari penempelan saat
ini sedang dieksploitasi untuk menghasilkan sarana-sarana yang bisa digunakan untuk mengedit genom secara terarah. Pada dasarnya, ini melibatkan dua
tahap. Pertama, enzim nuklease direkayasa supaya memotong sekuen yang diinginkan dalam genom, yang menghasilkan terputusnya sekuen utas-ganda.
Kedua, kemampuan sel untuk memperbaiki terputusnya sekuen tersebut dieksploitasi untuk menghasilkan modifikasi yang diinginkan pada lokasi genomik
tersebut.
Reparasi terputusnya sekuen terjadi melalui satu dari dua cara: ujung-ujung yang terputus mungkin
bergabung kembali melalui proses yang rawan kesalahan yang disebut nonhomologous end-joining
(NHEJ), atau cetakan eksternal digunakan untuk mereparasi terputusnya sekuen tersebut melalui reparasi
yang dikendalikan oleh kesamaan sekuen atau homology-directed repair (HDR). Reparasi melalui NHEJ
menghasilkan sisipan atau delesi beberapa basa yang dapat menghasilkan mutasi gen atau bahkan
kehilangan fungsi gen secara lengkap. Sebaliknya, untuk membuat perubahan sekuen yang terkontrol,
sebagai contoh untuk mengoreksi mutasi yang ada, HDR harus dieksploitasi. Ini dicapai dengan
memasukkan DNA homolog yang di dalamnya memiliki perubahan basa yang diinginkan ke dalam sel
yang sama di mana enzim nuclease dimasukkan; DNA ini melayani sebagai cetakan untuk reparasi
melalui rekombinasi homolog.
Ada 3 klas utama untuk enzim nuklease yang direkayasa, yaitu: Meganucleases, Zinc finger nucleases
(ZFNs), dan Transcription activator–like effector nucleases (TALENs). Meganucleases memotong DNA
dengan sangat spesifik pada situs target genomik yang panjang. Jika enzim-enzim dari klas ini yang
terdapat di alam akan digunakan untuk modifikasi genom, situs target harus terlebih dahulu dimasukkan
ke dalam lokasi genom yang diinginkan. Memperluas aplikasi meganucleases ke gen-gen endogen target
memerlukan pengembangan enzim-enzim baru, yang sudah berhasil dilakukan pada beberapa kasus.
ZFNs terdiri dari sebuah domain penempel DNA, yang diturunkan dari protein-protein faktor transkripsi
zinc-finger, yang berdampingan dengan domain nuklease dari enzim restriksi Fok-1. Seperti nuklease
induknya, ZFNs harus membentuk dimer supaya bisa memotong DNA. Domain penempel DNA, yang
dapat didesain untuk menempel lokasi genomik target manapun, adalah rangkaian tandem zinc fingers
Cys2His2, yang masing-masing mengenali 3 nukleotida pada sekuen target DNA. Dengan
menghubungkan bersama beberapa fingers (3 sampai 6 fingers sudah digunakan untuk masing-masing
monomer pada penelitian-penelitian yang sudah dipublikasikan), pasangan-pasangan ZFN dapat didesain
untuk menempel ke sekuen genomik yang panjangnya 18-36 nukleotida. Ketika dua momoner ZFN
menempel, pada orientasi yang terbalik, dengan jarak optimal 5-7 basa, nuklease dimer yang dihasilkan
akan memotong DNA di antara situs-situs penempelan tadi. TALENs memiliki keseluruhan arsitektur
yang mirip dengan ZFNs, dengan perbedaan utama pada domain penempel DNA yang berasal dari
protein TAL effector, yaitu faktor transkripsi dari bakteri patogen tanaman.
Domain penempel DNA dari sebuah TALEN merupakan rangkaian tandem dari ulangan-ulangan asam
amino, masing-masing panjangnya sekitar 34 asam amino. Ulangan-ulangan ini sangat mirip satu sama
page 1 / 3
TALEN: Gunting Molekuler untuk Modifikasi Gen secara Terarah - 10-09-2013
BB Biogen, Bogor - http://biogen.litbang.deptan.go.id
lain, mereka berbeda hanya pada dua posisi (asam amino ke-12 dan 13, yang disebut repeat variable
diresidue, atau RVD). Masing-masing RVD memiliki preferensi untuk menempel ke satu dari 4
nukelotida yang mungkin, yang berarti bahwa masing-masing ulangan TALEN menempel ke satu pasang
basa tertentu. Penempelan DNA dari TAL effector secara mekanik kurang dipahami dibanding
protein-protein zinc-finger, tetapi pengkodean TALEN yang nampaknya lebih sederhana sangat
menguntungkan untuk desain nuklease yang direkayasa. TALENs juga memotong dalam bentuk dimer,
memiliki sekuen target yang relatif panjang (terpendek yang sudah dilaporkan adalah 13 nukleotida per
monomer, atau 26 nukleotida) dan nampaknya memerlukan persyaratan yang lebih longgar dibanding
ZFNs untuk panjang jarak antara situs-situs penempelan.
Contoh Penggunaan TALEN
Hasil penelitian yang dipublikasikan oleh Li et al. (2012) di jurnal Nature Biotechnology merupakan
contoh penggunaan TALEN untuk mutagenesis terarah pada padi. Hasil penelitian sebelumnya
menunjukkan bahwa bakteri Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), patogen penyebab penyakit hawar
daun pada padi, ketika menginfeksi mengeluarkan TAL effector AvrXa7 atau PthXo3 yang menempel
secara spesifik pada cis element yang terdapat pada promoter dari gen-gen kepekaan pada padi, salah
satunya adalah OsSWEET14 yang menyandi sucrose-efflux transporter. Penempelan effector ini
mengaktifkan transkripsi dari OsSWEET14, sehingga gula dikeluarkan dari sel tanaman untuk memenuhi
kebutuhan nutrisi patogen dan meningkatkan keganasan patogen. Li dan kawan-kawan mendesain
TALEN untuk menginduksi mutasi pada cis element yang menjadi target penempelen dari effector
AvrXa7 atau PthXo3. Dengan pendekatan ini, mereka berhasil mendapatkan tanaman yang memiliki
sisipan atau delesi pada cis element tersebut, seperti dibuktikan dengan sekuensing, yang tahan terhadap
Xoo. Karena OsSWEET14 terletak di kromosom 11, sementara TALEN yang diintroduksikan bisa
terintegrasi di kromosom yang lain, akibat segregasi genetik didapatkan tanaman generasi T1 yang
memiliki mutasi pada cis element dari OsSWEET14 namun tidak lagi memiliki TALEN. Tanaman yang
demikian bisa dikelompokkan sebagai mutan biasa (seperti mutan EMS) yang tidak harus mengikuti
prosedur pengkajian keamanan hayati untuk pelepasannya.
Potensi Pemanfaatan TALEN
Jasa pembuatan TALEN untuk mentarget gen tertentu sesuai keinginan pemesan sudah tersedia secara
komersial, yaitu oleh perusahaan Life Technologies (GeneArt® Precision TALs) atau Cellectis
Bioresearch (TALEN™).
Jika kita ingin menggunakan TALEN untuk perbaikan fenotipe melalui mutagenesis, kita harus tahu gen
apa yang akan dimutasi atau level ekspresinya diubah supaya dihasilkan fenotipe yang diharapkan.
Dengan demikian yang perlu didorong adalah penelitian penemuan gen (gene discovery), apakah melalui
pemetaan genetik yang dilanjutkan dengan isolasi gen berbasis peta genetik (map-based cloning) atau
melalui analisis mutan sisipan. Hal lain yang perlu disadari adalah perbaikan sifat melalui mutagenesis
terarah untuk gen endogen suatu tanaman bersifat terbatas.
Tanaman transgenik tetap tidak bisa dihindari jika perbaikan sifat tertentu memerlukan introduksi gen
dari spesies lain, seperti gen ketahanan terhadap hama penggerek batang jagung yang berasal dari
Bacillus thuringiensis. Teknologi TALEN masih bermanfaat untuk tujuan ini. Sebagai contoh dari
penelitian sebelumnya kita mendapatkan informasi bahwa lokasi tertentu pada genom sangat
menguntungkan untuk ekpresi transgen yang kita introduksikan. Kita bisa memesan TALEN untuk
memotong lokasi tersebut. Kemudian kita lakukan transformasi genetik dengan memasukkan dua
page 2 / 3
TALEN: Gunting Molekuler untuk Modifikasi Gen secara Terarah - 10-09-2013
BB Biogen, Bogor - http://biogen.litbang.deptan.go.id
T-DNA, yaitu satu yang mengandung TALEN dan satunya yang mengandung transgen yang ingin kita
integrasikan ke lokasi tersebut. Supaya terjadi rekombinasi homolog, sekuen transgen harus diapit oleh
sekuen yang homolog dengan sekuen pada lokasi genom yang menjadi target. Karena sebagian besar
event yang diperoleh akan memiliki integrasi transgen pada lokasi yang kita inginkan, kita cukup
memproduksi sedikit event (< 20), yang tentunya lebih ringan dibanding menggunakan teknologi
transformasi genetik konvensional yang memerlukan jumlah event > 500.
Pemanfaatan lain dari TALEN adalah untuk menambahkan transgen baru ke lokus yang sama
(berdampingan dengan) transgen yang sebelumnya sudah diintroduksikan supaya kedua transgen selalu
diwariskan bersama pada progeni (tidak memisah karena segregasi genetik). Penggabungan lebih dari
satu sifat (stacking) ini, misalkan ketahanan hama dan toleran herbisida, sekarang menjadi kecenderungan
dari benih-benih transgenik yang dikomersialkan oleh perusahaan-perusahaan benih transnasional.
Kecenderungan yang lain adalah rekayasa sekaligus banyak gen (multigene engineering) untuk
memodifikasi satu lintasan biokimia utuh atau untuk menghasilkan perubahan radikal seperti padi C4.
TALEN akan sangat bermanfaat untuk melayani proyek-proyek ini karena bisa membantu supaya banyak
gen tersebut terintegrasi pada lokus yang sama (Dr. K. Rudi Trijatmiko)
Sumber:
1. de Souza N. 2012. Primer: genome editing with engineered nucleases. Nature Methods 9(1):27.
2. Li T, Liu B, Spalding MH, Weeks DP, Yang B. 2012. High-efficiency TALEN-based gene editing
produces disease-resistant rice. Nature Biotechnology 30(5):390-392.
_______________________________________________
PDF generated by BB Biogen, Bogor
page 3 / 3
Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)