ISOLASI DAN PEMURNIAN PROTEIN INHIBITOR

2
TINJAUAN PUSTAKA
Kapang Endofit
Endofit adalah mikroorganisme yang
hidup di dalam tanaman tingkat tinggi. Bacon
dan White (2000) menyebutkan bahwa endofit
merupakan mikroorganisme yang hidup
berkoloni di dalam jaringan tumbuhan tanpa
menyebabkan efek negatif terhadap tumbuhan
tersebut. Mikroorganisme yang hidup pada
jaringan tumbuhan ini memilki hubungan
simbiosis. Mikroorganisme yang banyak
ditemukan hidup sebagai endofit adalah
bakteri dan kapang.
Endofit
diperkirakan
menghasilkan
metabolit yang karakteristiknya mirip dengan
tumbuhan inangnya. Schuzt et al. (2002)
menjelaskan bahwa metabolit yang dihasilkan
dipengaruhi oleh lingkungan dan tingkatan
organisme tertentu. Pemilihan tumbuhan yang
akan
diisolasi
endofitnya
harus
mempertimbangkan beberapa hal. Pertama,
tumbuhan tersebut berasal dari lingkungan
yang unik dan mempunyai kemampuan untuk
bertahan hidup. Kedua, tumbuhan tersebut
memiliki sejarah etnobiologi yang digunakan
sebagai obat dari penyakit tertentu. Ketiga,
ketersediaan tumbuhan bersifat endemik
karena dikaitkan dengan lingkungan tempat
tumbuhnya sehingga diduga menghasilkan
metabolit aktif untuk mempertahankan
kelangsungan hidup. Keempat, tumbuhan
yang hidup di dalam lingkungan dengan
keragaman tinggi sehingga kemungkinan
memiliki endofit dengan keragaman yang
tinggi pula (Strobel & Daisy 2003).
Mikroorganisme yang hidup sebagai
endofit salah satunya adalah kapang. Isolat
CgKTm 5 F merupakan kapang endofit yang
diisolasi dari tanaman temu putih. Endofit ini
termasuk ke dalam kelompok kapang dengan
morfologi bulat (Gambar 1). Temu putih
(Curcuma zedoaria) dapat dijadikan sebagai
obat antivirus (Chungsamarnyart et al. 2007).
Kapang
endofit
CgKTm
5F
Gambar 1 Kapang endofit CgKTm 5 F.
Suhu optimal yang dibutuhkan untuk
pertumbuhan kapang berkiksar 25-30oC. Pada
umumnya kapang dapat tumbuh pada kisaran
pH 2-8.5, akan tetapi pertumbuhannya akan
lebih baik pada kondisi pH rendah. Nilai pH
optimum untuk pertumbuhan kapang berkisar
antara 6-7 (Fardiaz 1992).
Virus Hepatitis C
Virus hepatitis C (HCV) ditemukan
pertama kali pada tahun 1989 dengan nama
virus hepatitis non-A dan non-B. Virus ini
termasuk kedalam genus Hepacivirus dan
famili Flaviviridae. Genom HCV terdiri atas
utas tunggal RNA sense positif yang
berukuran sekitar 9.6 kilobasa (kb). Virus ini
berbentuk
bulat,
berpelindung,
dan
berdiameter sekitar 50-60 nm (Gambar 2)
(Tellinghuisen 2007).
Genom HCV terdiri dari open reading
frame (ORF) tunggal yang mengkodekan
poliprotein tunggal.
Poliprotein tersebut
merupakan prekusor bagi 3000 jenis asam
amino. Poliprotein ini akan diubah menjadi
sekitar 10 jenis protein yang berbeda dan
terbagi dalam dua kelompok besar protein
virus, yaitu protein struktural (protein inti, E1,
E2, dan p7) dan protein nonstruktural (NS)
(NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B)
(Lauer &Walker 2001).
Protein struktural dari HCV terletak pada
daerah N terminal. Protein inti diperlukan
untuk perakitan partikel virus baru (virion)
dalam bentuk nukleokapsid. Protein inti
berperan sebagai modulator metabolisme lipid
dan hepatokarsinogenesis. Protein pelindung
envelope 1 (E1) mempunyai bobot molekul
sekitar 30-35 kDa, sedangkan protein
pelindung envelope 2 (E2) sekitar 70-75 kDa.
Pelindung tersebut banyak mengandung
glikoprotein. Kedua pelindung ini mempunyai
tingkat mutasi yang sangat tinggi dan bersifat
sangat spesifik terhadap antibodi. Pada E2
terdapat region yang berfungsi unuk mengikat
pada cluster of diffrerentiation 81 (CD81),
yaitu reseptor untuk HCV. Protein p7
berperan dalam pengaturan kanal ion
(Tellinghuisen 2007).
Protein nonstruktural (NS) terdiri dari
NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B.
Protein nonstruktural berperan dalam replikasi
virus. Protein NS2 mempunyai aktivitas
protease. Protein NS3 mempunyai dua
aktivitas utama, yaitu serin protease dan
NTPase atau helikase. Protein NS4A berperan
sebagai kofaktor serin protease NS3,
sedangkan NS4B belum diketahui fungsinya
secara jelas. NS5A merupakan fosfoprotein
3
yang fungsinya belum diketahui secara jelas.
Protein ini bersifat hidrofilik dan sangat
sensitif
terhadap
interferon.
NS5B
mempunyai peranan dalam aktivitas RNAdependent
RNA
polimerase
(RdRp)
(Tellinghuisen 2007).
Virus hepatitis C menyerang sel hati atau
limfosit B. Virus ini menyebabkan penyakit
hepatitis C yang dalam jangka panjang
mengakibatkan peradangan hati, sirosis, dan
kanker hati. Penyakit ini sulit dideteksi karena
gejala yang ditimbulkan mirip dengan
penyakit yang lain, seperti mual, nafsu makan
berkurang, mudah lelah, timbul kekuningan
(mata, kulit), dan urin berwarna gelap.
Umumnya penyakit ini terdeteksi apabila
sudah mencapai tingkat akut, sekitar 30-80%
infeksi (Sy & Jamal 2006).
Pelindung glikoprotein
Inti
membuka ikatan hidrogen pada dupleks RNA.
Enzim akan bergerak sepanjang arah 3’-5’
dalam memisahkan kedua untai RNA dan
berperan dalam proses translasi, pembentukan
poliprotein, dan memutus interaksi RNA
dengan protein (Gambar 3) (Utama et al.
2000).
RNA helikase berperan penting dalam
replikasi virus dapat dijadikan target dalam
pencarian obat HCV. Target pencarian obat
dapat dilakukan dengan menghambat salah
satu aktivitas dari RNA helikase tersebut.
Penghambatan dilakukan dengan mencari
inhibitor RNA helikase sehingga proses
replikasi virus menjadi terhambat (Megawati
2008). Aktivitas ATPase dari RNA helikase
lebih mudah digunakan sebagai target
pencarian obat antivirus. Hal tersebut
dikarenakan substrat yang digunakan, yaitu
ATP, bersifat lebih stabil (Tellinghuisen
2007).
5’
3’
5’
3’
RNA
Pengikatan RNA
RNA helikase
5’
RNA virus
Pelindung virus
3’
5’
3’
Hidrolisis ATP
± 60 nm
RNA helikase
Pi
Gambar
2
Struktur virus hepatitis
(Moradpour et al. 2007).
C
5’
ADP
3’
3’
Pembukaan ikatan
RNA Helikase
Helikase adalah enzim yang berperan
dalam membuka untai ganda nukleotida
(DNA atau RNA) menjadi untai tunggal.
RNA helikase merupakan enzim yang
membuka ikatan dupleks RNA sense positif
dengan antisense negatifnya menjadi untai
tunggal. Enzim ini pertama kali ditemukan
pada Escherichia coli. Enzim ini bekerja
secara katalitik dengan memutus ikatan
hidrogen yang terjadi antara kedua untai
tersebut (Kadare & Haenni 1997).
RNA helikase yang terdapat pada virus
hepatitis C (HCV) dikodekan oleh protein
NS3 RNA helikase (Ceng et al. 2007). Enzim
ini juga memiliki aktivitas ATPase dan
pengikatan terhadap untai RNA. Mekanisme
kerja dari RNA helikase pertama-tama adalah
mengikat untai RNA pada ujung 3’. ATP
akan terikat pada sisi aktif enzim tersebut dan
dihidrolisis oleh RNA helikase menjadi ADP
dan fosfat anorganik. Energi yang dilepaskan
digunakan oleh RNA helikase untuk
ATP
5’
RNA helikase
dupleks RNA
Gambar 3 Mekanisme RNA helikase (Utama
et al. 2000).
Sodium Dodecylsulphate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis (SDS PAGE)
Elekroforesis adalah teknik pemisahan
yang
memisahkan
analit
berdasarkan
kemampuannya bergerak dalam medium
konduksi yang biasanya berupa larutan bufer
dan akan memberikan respons setelah
ditambahkan medan listrik. Suatu zat yang
bermuatan jika diberi potensial, maka zat
tersebut akan berpindah sepanjang medium
yang kontinu ke arah katode atau anode sesuai
dengan muatan yang dibawanya (Harvey
2000).
Elektroforesis SDS-PAGE termasuk ke
dalam kelompok elektroforesis zona/wilayah,
yaitu kelompok elektroforesis yang dibedakan
berdasarkan
medium
penyangganya.
Elektroforesis SDS-PAGE menggunakan gel
4
buatan sebagai medium penyangga. Gel yang
digunakan terbentuk dari polimerisasi
akrilamida dengan N, N’-metilena bis
akrilamida sehingga terbentuk ikatan silang
karena polimerisasi akrilamida sendiri hanya
menghasilkan ikatan linear yang tidak
membentuk gel kaku (Girindra 1993).
Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat pada
suhu kamar dengan adanya katalis dan
inisiator. Katalis dan inisiator yang umum
digunakan
ialah
N,
N’,
N’,
N’tetrametilenadiamina (TEMED) dan amonium
persulfat (APS) sebagai sumber radikal bebas
yang akan menginisiasi pembentukan polimer
(Caprette 2005). Pada metode ini, digunakan
natrium dodesil sulfat (SDS) dan βmerkaptoetanol. SDS merupakan detergen
anionik
yang
bersama
dengan
βmerkaptoetanol dan pemanasan menyebabkan
rusaknya struktur tiga dimensi protein
menjadi konfigurasi acak. Hal ini disebabkan
oleh pecahnya ikatan disulfida yang
selanjutnya tereduksi menjadi gugus-gugus
sulfidril.
Umumnya
analisis
dengan
elektroforesis protein menggunakan gel
poliakrilamida dengan konsentrasi yang sesuai
dengan bobot proteinnya (Tabel 1).
Pergerakan partikel di dalam medium
bergantung pada ukuran partikel dan ukuran
medium penunjang. Ukuran pori dari gel akan
ditentukan
oleh
konsentrasi
gel
poliakrilamida.
Protein
yang
besar
mempunyai mobilitas yang lebih lambat
dibandingkan dengan kompleks protein yang
lebih kecil. Bobot molekul protein dapat
ditentukan dengan kalibrasi menggunakan
standar protein yang sudah diketahui bobot
molekulnya (Rybicki et al. 1996). Teknik
elektroforesis gel banyak digunakan baik di
bidang kimia maupun biokimia, karena teknik
ini memiliki banyak keuntungan, diantaranya
memiliki daya resolusi tinggi, sederhana, dan
mudah dibawa (Girindra 1993).
Tabel 1 Variasi konsentrasi gel berdasarkan
bobot protein
% gel
Bobot protein (kDa)
7
50 – 500
10
20 – 300
12
10 – 200
15
3 – 100
Sumber: Laemmli (1970)
Kromatografi Gel Filtrasi
Kromatografi adalah metode pemisahan
yang dapat digunakan untuk memisahkan
suatu komponen dari komponen lainnya atau
memisahkan komponen dari sekumpulan
komponen lainnya. Metode ini merupakan
teknik yang efektif dan dapat digunakan untuk
memisahkan komponen yang sulit dipisahkan
dengan metode lain (Wilson & Walker 1994).
Kromatografi gel filtrasi merupakan teknik
pemisahan yang berdasarkan pada ukuran dan
atau bentuk dari partikel analit. Pemisahan
tersebut dilakukan menggunakan matriks yang
berpori. Masing-masing molekul memiliki
tingkatan yang berbeda untuk melewati pori
tersebut (molekul yang lebih kecil memilki
kemampuan lebih tinggi untuk melewati pori
tesebut dibandingkan dengan molekul yang
lebih besar), sehingga
menyebabkan
pemisahan analit. Batasan pemisahan dari
sebuah ukuran yang dipisahkan merupakan
indikasi bobot molekul, umumnya untuk tipe
polimer, dari analit tersebut (Hagel 1998).
Ukuran protein yang dapat dipisahkan oleh
beberapa matriks gel dapat dilihat pada Tabel
2.
Pemisahan molekul yang terjadi yaitu
molekul yang memiliki ukuran besar akan
terelusi oleh fase gerak dari kolom
kromatografi dan akan keluar paling awal
melalui ruang antar matriks dengan laju alir
yang tinggi. Molekul yang berukuran kecil
akan terelusi ke dalam fase diam oleh fase
gerak dengan laju alir yang rendah, sehingga
akan keluar dari kolom paling akhir (Wilson
& Walker 1994). Ilustrasi pemisahan protein
yang terjadi pada kromatografi kolom
ditunjukkan pada Gambar 4.
Tabel 2 Ukuran protein minimum yang dapat
dipisahkan oleh matrik gel
Tipe gel
Sephadex G-10
Bio-Gel P-2
Sephadex G-25
Bio-Gel P6DG
Sephadex G-50
Bio-Gel P-30
Sumber : Hagel (1998)
Batas ekslusi
M
Radius
r
(Å)
700
7
1800
10
5000
14
6000
15
30000
25
40000
28
Larutan
protein
Matriks
gel
Tinggi
kolom
kolom
Gambar 4 Kromatografi gel filtrasi
(Anonim 2010).