C 3 - WordPress.com

basic medical research
method
dr. Yudha Nurhantari, Ph.D.
Bagian Ilmu Kedokteran Forensik
Fakultas Kedokteran UGM
Tujuan Pembelajaran
• Mahasiswa mampu memahami
perkembangan metodologi riset biomedis,
meliputi :
• Isolasi DNA
• PCR
• Elektrophoresis
• Restriksi dan ligasi enzim
• sequencing
Pendahuluan
Struktur DNA
• Gula dan Phosphat
• ikatan hydrogen
• complementary strands
• Target PCR template
for synthesis
Sample collection
Kondisi sampel
•
•
•
•
•
Hindari kontaminasi : wadah, peralatan, dll
Label
Jaga sampel dari kerusakan/degradasi DNA
Pengawetan
Penyimpanan jaringan sampel
Ekstraksi DNA
•
•
•
•
•
Banyak metode:
Metode phenol-chloroform
Metode salting-out
Metode isotiocyanat
kit
transfer
DNA sol
PhenolChlorf.
Sampel
Lysis Buffer +Prot-ase
Phenol-chlorofom
centrifuge
DNA
protein
Ethanol
Garam
centrifuge
Menilai hasil ekstraksi DNA
• Spectrophotometer
• Electrophoresis
Hasil ekstraksi DNA
•
•
•
•
Jumlah DNA
Purity of DNA template
Hindarkan kontaminasi DNA lain
Penyimpanan
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Latar belakang :
• Terdapat 23 pasang kromosom pada manusia
• Ada banyak gen dalam kromosom
• Ratio fragment DNA of interest : seluruh total
DNA  kecil
• Bagaimana caranya ?
Figure 4-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
• Solusi: fragment DNA of
interest diperbanyak
• meniru replikasi DNA in vivo
•  Polymerase Chain
Reaction
• P Polymerase Chain Reaction
(Reaction (PCR)
PCR
•
•
penggandaan suatu
segmen DNA tertentu.
PCR mesin :
alat termocycle,
suhu berubah otomatis
siklus tertentu
Prinsip kerja:
• Denaturation
• Annealing
• Elongation
Denaturasi
0
94 C
Double strands
Single strand
Annealing
Primer F
Primer R
• Gene Bank  urutan DNA pada gen yang
akan diteliti
• Membuat primer pasangan komplementer
 akan menempel karena berdasarkan
pasangan komplmenternya
•  spesifitas tinggi karena berdasarkan urutan
gen sebenranya
• Gen bank : 3’......AATGGCTAGGTC....5’
•
5’.....TTACCGATCCAC.....5’
• Primer :3’........TTACCGATCCAG.....5’
Komponen reaksi PCR
• DNA template :
bahan yang akan dianalisa
• 1 pasang primer (Forward&Reverse):
menempel specific pada template
• d-NTP mix ( dATP,dCTP,dGTP,dTTP ):
bahan baku sintesis nucleotida
• PCR buffer  aktivitas enzyme, primertemplate specificity
• DNA polymerase  sintesa DNA
• H20
Primers
Specific hybridization to the template:
- annealing temperature
- 20-25 bases, 50% G-C  52-580 C
- Designing primers :S&E software, etc
- Melting temperature =
4x(#G+#C)+2(#A+#T)
Annealing temp. 3-50 C below melting temp.
Target Sequence
forward primer
5’TATAAGCCATAACGATATTGCTGAGTCAAGTC
CACATATCATATGGATGAGAAATGCTTGTGGAG
CTGATGTTGATTTGGAGAGACTCTCTCTCTCTC
TCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCAAACCAGTT
AAAGAGTGTGCCAGTAGAG 3’
reverse primer
Forward Primer:
5’ GCC ATA ACG ATA TTG CTG AGT 3’
Reverse Primer:
5’ACT GGC ACA CTC TTT AAC TGG3’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’ Forward primer 3’
5’
dNTPs
TTGAGAAAGGAATAAGC DNA POL
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC
DNA POL TCTTTAGCTCATATACG
3’
Reverse primer
dNTPs
5’
5’
3’
GCATATACTCGATTTCT
5’
3’
TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC
AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG
3’
5’
Animasi kerja PCR
RT(Reverse Transcript)- PCR
• RNA c (complementary)- DNA
DNA:
EXON-1
EXON-2
INTRON
RNA:
EXON
EXON-2
INTRON
EXON-3
• Enzyme reverse transcriptase
• Hanya DNA exon
EXON-3
Agarose gel electrophoresis
• Memisahkan DNA berdasarkan berat
molekulnya
M
1
2
3
4
1X TAE buffer
DC power suplay
Loading buffer
Pewarnaan Etbr
Visualisasi :UV
light
marker
200bp
100bp
1
2
3
4
5
6
7
180-bp
Interpretasi
1. Tidak ada band/pita
- PCR gagal  perbaiki teknik
- Hasil negatif
2. Terdapat band/pita
- expected size  konfirmasi:
sequencing, restriction enzyme
mapping, blot hybridization
2. - non-expected size :
• nonspecific amplf.:
primer-dimer, rekombinasi
antara 2 PCR produk yang
berbeda cycles
• mutasi gen
Enzyme restriction
5’ . . . A G
3’ . . . T C
C T . . 3’
G A . . 5’
5’ . . . G G
3’ . . . C C
C C . . 3’
G G . . 5’
5’ . . . G
3’ . . . C C T A G
G A T C C 3’
G 5’
5’ . . . A
3’ . . . T T C G A
AGCTT
A
3’
5’
5’ . . . G
3’ . . . C T T A A
AAT T C
G
3’
5’
Ligation
2. Sequencing
• Pembacaan urutan nuleotide/basa pada
segmen DNA tertentu.
• Alat : Sequencing machine
• Methode dideoxy
• DNA disintesa dari dioxynucleotide
triphosphate (dNTP)
• Tiap nucleotida baru ditambahkan pada
group 3’-OH nucleotide terakhir
• Dideoxy method : sintetik nucleotide yang
tidak punya gugus 3’-OH, tetapi 3’-H
 tidak terjadi elongasi
 chain termination method
• Procedure
- prepare single strand DNA
- dNTP (dATP,dCTP,dGTP,dTTP)
- ddNTP (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)
- DNA polymerase 1
• Separation from the longest fragment to the
shortest fragment
• Each of ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP,ddTTP)
fluoresces different color
P- P- P
C 5’
O
Thymine
C 4’
3’C
1’
2’
O
C
C
C
T
C
O
OH
H
H
dTTP
Deoxythymidine triphosphate
ddTTP
Dideoxythymidine triphosphate
dATP
ddATP
dTTP
ddTTP
dCTP
ddCTP
dGTP
ddGTP
• Pembacaan :
- tentukan urutan basa primernya
(Forward/Reverse)
- cocokkan antara hasil dengan standar
urutan (gen bank)
- warna : merah (T), biru(C), hijau (A), hitam
(G)
Primer
3. Western Blot :
- Deteksi suatu protein
- transfer dari gel ke membran
- antibody terhadap protein
- Hasil : berupa band/pita
-tidak ada pita : antibody/staining lemah
hasil negatif : protein (-)
- terdapat pita : expected size : hasil
non- expected size : nonspecific protein