introduksi dan ekspresi gen

ABSTRACT
GUSRINA. Introduction and expression of tilapia (Oreochromis niloticus)
growth hormone gene in catfish (Clarias sp). Under direction of KOMAR
SUMANTADINATA, ALIMUDDIN, and UTUT WIDYASTUTI.
The gene transfer technology applied in commercially important aquatic
animals is to enhance genetic quality of aquaculture broodstock. This study was
conducted to introduce gene encoding growth hormone (GH) in catfish embryos
to improve its growth rate. In fish, microinjection was the earliest technique
developed to introduce foreign DNA into fertilized eggs. However, the
opaquness, stickiness and buoyancy of the embryos, the invisibility of the
pronuclei, the togness of the chorion, and the higher mortality of injected eggs
make this technique time consuming and requires sophisticated skills.
Electropration method is able to produce mass fish transgenic. In this study, we
transferred a plasmid containing GH gene of Nile tilapia (tiGH), driven by medaka
β-actin promoter (mBP) into catfish using microinjection and electroporation
methods, to obtain growth enhanced transgenic fish. The DNA solution (mBPtiGH) used was 50 µg/ml in sterile distillated water. The parameter observed was
survival rate of embryos (SRe), hatching rate (HR), and the percentage of
individual carrying mBP-tiGH. Transgenic individual carrying tiGH was identified
by PCR ( Polymerase Chain Reaction) method with specific primer for tiGH gene.
The analysis of gene expression was conducted by RT-PCR. The results of
research from 100 catfish embryos showed that control uninjected treatment was
higher SRe and HR of eggs fertilized while the Sre and HR in electroporatedsperm was similar with control (SRe 98.5%; HR 91.2%). Percentage of catfish
carrying tiGH gene by microinjection methods was 42.86% (12/28) while by
electroporation methods was 87% and 93%. Germ line transmission of the
transgene at first generation was 4.0 % - 8.33%. The growth of catfish in founder
generation was not different between transgenic and nontransgenic. The growth
of transgenic catfish at first generation were up to 7 fold higher compared with
nontransgenic fish.
Keywords : catfish, electroporation, gene transfer, GH, microinjection, promoters
RINGKASAN
GUSRINA. Introduksi dan Ekspresi Gen Hormon Pertumbuhan Ikan Nila
(Oreochromis niloticus) pada Ikan Lele (Clarias sp). Dibimbing oleh KOMAR
SUMANTADINATA, ALIMUDDIN dan UTUT WIDYASTUTI.
Kementerian Kelautan Perikanan menargetkan peningkatan produksi ikan
lele 50% pertahun. Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk meningkatkan
produksi adalah dengan memelihara ikan yang tumbuh cepat. Saat ini sedang
dicoba suatu metode yang dapat menunjang program tersebut yaitu teknologi
transgenesis. Teknologi transgenesis merupakan suatu teknik rekayasa genetik
dengan cara mengintroduksi gen yang khas pada ikan untuk mendapatkan
keunikan yang memiliki nilai tambah. Teknologi transfer gen telah dikembangkan
untuk memperbaiki karakter kuantitatif dan kualitatif. Gen dari individu suatu
spesies diisolasi, dihubungkan ke promoter (sebagai sekuens pengatur ekspresi
gen atau on/off switches), diklon dan diperbanyak terutama dalam plasmid .
Aplikasi teknologi transgenik pada ikan lele di Indonesia belum
dilakukan. Pada penelitian ini untuk menghasilkan ikan lele transgenik dilakukan
beberapa tahapan penelitian. Tahap pertama dalam penelitian ini adalah
melakukan pengujian terhadap aktivitas promoter. Promoter yang digunakan
dalam pengujian ini adalah ß-aktin yang berasal dari ikan medaka yang
disambungkan dengan gen penyandi protein berpendar hijau dalam konstruksi ßaktin-GFP (mBP-GFP). Aktivitas promoter tersebut dianalisis dengan mengamati
ekspresi gen penanda GFP (Green fluorescent protein) pada embrio ikan lele.
Tahap kedua dalam penelitian ini adalah mengintroduksikan gen mBP-tiGH pada
embrio ikan lele menggunakan metode mikroinjeksi. Tahap ketiga dalam
penelitian ini adalah menganalisis ekspresi gen mBP-tiGH pada generasi
founder dan generasi pertama pada ikan lele. Pada tahap terakhir dilakukan juga
transfer gen menggunakan metode elektroporasi untuk menghasilkan ikan
transgenik dalam jumlah banyak. Hasil penelitian ini diharapkan akan menjadi
acuan dalam rangka memproduksi ikan lele transgenik yang mempunyai
pertumbuhan yang lebih baik.
Pada tahap pertama digunakan konstruksi gen dalam bentuk plasmid
mBA-GFP dengan konsentrasi 50 µg/ml . Konstruksi gen tersebut diinjeksikan ke
dalam blastodisk embrio ikan lele fase 1 sel. Jumlah telur yang diinjeksi untuk
konstruksi gen adalah sebanyak 30 embrio dan dilakukan 2 pengulangan. Telur
diinkubasi pada akuarium dengan suhu air sekitar 28oC. Ekspresi gen GFP
diamati menggunakan mikroskop fluoresen (Olympus SZX 16) dimulai pada jam
ke-4 setelah fertilisasi dan dilanjutkan setiap 2 jam sekali hingga ekspresi GFP
tidak terdeteksi. Derajat kelangsungan hidup embrio (DKH-e) dan derajat
penetasan (DP) dianalisis sebagai data pendukung. DKH-e dihitung sebelum
telur menetas, sedangkan DP dihitung ketika semua telur telah menetas. Data
dianalisis secara deskriptif. Hasil penelitian menunjukkan bahwa DKHe (63,33±3,34%) dan DP (63,63± 10,03%) kontrol tidak diinjeksi lebih tinggi
dibandingkan dengan perlakuan injeksi. DKH-e yang diinjeksi dengan mBA-GFP
adalah 25,00±1,67%. Nilai DP untuk mBA-GFP adalah 18,34±1,65%. Persentase
embrio yang mengekspresikan gen GFP adalah 3,3 ±0,0%. Puncak ekspresi
gen GFP yang dikendalikan oleh promoter β-aktin adalah pada jam ke-10.
Ekspresi gen GFP tidak tampak lagi pada saat telur menetas. Kesimpulannya
adalah bahwa promoter β-aktin dari ikan medaka dapat aktif mengendalikan
ekspresi gen asing pada ikan lele, sehingga promoter tersebut dapat digunakan
dalam pembuatan ikan lele transgenik.
Penelitian tahap kedua dilakukan untuk mengetahui keberhasilan
introduksi gen penyandi hormon pertumbuhan (Growth Hormone, GH) pada
embrio ikan lele sehingga dapat memperbaiki kecepatan tumbuhnya. Gen GH
dari ikan nila (tiGH) yang dikontrol oleh promoter beta-aktin (mBP) dari ikan
medaka ditransfer menggunakan metode mikroinjeksi ke dalam blastodisk
embrio ikan lele fase satu sel. Konsentrasi konstruksi gen mBP-tiGH yang
ditransfer adalah 50 µg/ml akuabides. Parameter yang diamati meliputi derajat
kelangsungan hidup embrio (DKHe), derajat penetasan (DP) dan persentase
individu ikan lele yang membawa mB-tiGH. Identifikasi ikan yang membawa mBtiGH ditentukan menggunakan metode PCR dengan primer spesifik untuk gen
tiGH. Hasil penelitian dengan menggunakan metode mikroinjeksi dari 100 embrio
yang diinjeksi menunjukkan bahwa nilai DKHe (97%) dan DP (94%) pada kontrol
(tidak dimikroinjeksi) lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan mikroinjeksi
(30% untuk DKHe, dan 28% DP). Ikan lele yang membawa mBP-tiGH dengan
metode mikroinjeksi adalah 42,86% (12/28).
Penelitian tahap ketiga bertujuan untuk menganalisis ekspresi gen
penyandi hormon pertumbuhan ikan nila (tiGH) pada ikan lele (Clarias sp) pada
generasi pertama. Ikan lele transgenik founder yang diperoleh dari hasil
penelitian sebelumnya dilakukan pemeliharaan sampai siap untuk dipijahkan.
Setelah 12 bulan pemeliharaan dilakukan pengamatan tingkat kematangan
gonad dan diperoleh 4 ekor induk ikan lele yang matang kelamin dengan jumlah
jantan 3 ekor dan betina 1 ekor. Ikan lele jantan transgenik founder disilangkan
dengan ikan lele betina nontransgenik, sedangkan ikan lele betina transgenik
founder disilangkan dengan ikan lele jantan nontransgenik. Proses pemijahan
dilakukan secara semi-buatan. Penetasan telur dan pemeliharaan larva
dilakukan sesuai dengan prosedur SNI (2004). Parameter yang diamati adalah
ekspresi gen secara fenotipe dan genotipe. Ekspresi gen secara fenotipe
diketahui dengan mengamati pertumbuhan ikan lele, sedangkan secara genotipe
adalah dengan analisa RT-PCR. Berdasarkan hasil analisis RT-PCR, terdapat 1
ekor memperlihatkan ekspresi transgen dari 9 ekor pada generasi founder,
sedangkan pada generasi pertama memperlihatkan ekspresi transgen terdapat 5
ekor dari 7 ekor yang dianalisis. Hal ini memperlihatkan bahwa gen yang telah
disisipkan tersebut terekspresi, walaupun tidak semua mengekspresikan
transgen. Identifikasi ikan yang membawa gen mBP-tiGH
ditentukan
menggunakan metode PCR dengan primer spesifik untuk gen tiGH. Hasil
penelitian dari 4 ekor induk lele transgenik founder hanya 2 ekor yang memijah
dan diperoleh hasil pada ikan lele transgenik generasi pertama yang membawa
gen mBP-tiGH adalah 8,33% (15 dari 180) dan 4,0% (6 dari 150). Pertumbuhan
ikan lele pada generasi founder tidak berbeda antara transgenik dan
nontransgenik. Pertumbuhan ikan lele generasi pertama (rata-rata bobot) antara
transgenik dan nontransgenik berbeda nyata dengan peningkatan sampai 7 kali
lipat dibandingkan dengan nontransgenik. Kesimpulan adalah bahwa gen mBPtiGH dapat ditransmisikan pada generasi pertama dan memberikan peningkatan
pertumbuhan pada benih ikan lele.
Transfer gen menggunakan elektroporasi menunjukkan bahwa nilai DKHe
dan DP antara kontrol dengan perlakuan elektroporasi relatif sama 98,5% untuk
DKHe, dan 91,2% DP. Ikan lele yang membawa mBP-tiGH dengan metode
elektroporasi yaitu 90% lebih tinggi dibandingkan dengan mikroinjeksi. Dengan
demikian metode elektroporasi dapat digunakan untuk meningkatkan jumlah ikan
lele tarnsgenik yang dihasilkan.
Kata kunci : elektroporasi, GFP, GH, mikroinjeksi, PCR, transfer gen