Induksi Variasi Somaklonal dan Teknik Seleksi In

VIII. PEMBAHASAN UMUM
Pemuliaan tanaman untuk karakter resistensi atall toleran terhadap
penyakit merupakan salah satll cara efektif untuk melindungi tanaman dari
kerusakan akihat faktor biotik, khususnya oleh mikroorganisme patogen. Plasma
nutfah yang mempunyai karakter resisten terhadap penyakit yang mewaris dari
satll generasi ke generasi berikutnya sangat berharga, karena dengan demikian
plasma nutfah tersebut dapat dengan mudah digunakan dengan menghemat biaya
pengendalian hama dan penyakit secara signiftkan. Di samping itu, secara
ekologi. budidaya tanaman menggunakan varietas tahan penyakit sangat ramah
lingkungan. Namun demikian, terdapat beberapa kendala untuk mendapatkan
varietas unggul baru yang laban penyakit, sekaligus berproduksi tinggi. Beherapa
kendala tersehut meliputi variabilitas patogen dalam huhungarmya dengan
ketahanan inang. tidak adanya tetua donor yang membawa gen resistensi,
te~adinya
linkage drag jika gen resistensi terdapat pada tanarnan yang herkerabat
jaub, atau tanaman yang secara agronomi kurang menguntungkan (Johnson 1992,
Wynne el al. 1991 ). Pada kacang tanab, pemuliaan untuk karakter resistensi
terhadap penyakit pada umumnya dilakukan dengan earn hibridisasi dan seleksi
(Norden el al. 1982, Knauft dan Ozias-Akins \995).
Salah satu penyakit penling kacang tanab yang dapat menyebabkan
kerusakan dan penurunan hasil secara nyata adalah busuk batang SclerOlium
(southern stem rot) yang disebabkan oleh infeksi Sclerotium rolfsii. Penyakit ini
relatif sulit untuk dikendaIikan secara kimia, karena inangnya sangat beragarn
(200-500 tanaman), dan pada siklus hidupnya dapat membentuk sklerosia yang
144
dapat bertahan hidup di dalam tanah dalam waktu lama (Backman 1984, Punja
1985). Sejaub ini, hanya beberapa galur atau aksesi yang te1ah di1aporkan
mempunyai resistensi parsial terhadap S. rolfsii, diantaranya NC 2 dan NC 3033
(Wynne el al. 1991).
Di Indonesia belurn ditemukan genotipe atau varietas kacang tanah yang
resisten terhadap S. rolfsii (Rani 200 I, Widyanti 2001). sehingga tetua donor
dengan gen resistensi terhadap penyakit ini belum ada. Oleh karena itu, pada
tahap awal penelitian disertasi ini telah dievaluasi sebanyak 30 genotipe kacang
tanah untuk reaksinya terhadap infeksi S. rolfsii di rumah plastik. Agar evaluasi
tersebut efektif, sebeJumnya telab dikembangkan metode inokulasi cendawan
patogen tersebut ke pangkal batang kacang tanah. Dari peneiitian ini dapat
disimpulkan bahwa metode inokulasi yang paling efektif adalah dengan carn
me1ukai pangkal batang kacang tanah dengan jarum, menempe1kan inoku1urn
pada bagian batang yang dilukai. dan menimbun inokulum dengan tanah. Dari
pene1itian tersebut juga disimpulkan bahwa dari 30 genotipe yang diuji, tidak
didapatkan kacang tanah yang tahan terhadap S. rolfsii.
Salah satu cara meningkatkan variabilitas genetik tanpa hibridisasi adalah
dengan pengulturan sel atau jaringan tanaman (Larkin dan Scowcroft 1981).
Pengulturan jaringan tanaman, terutama yang melalui tahapan pembentukan kalus
haik pada organogenesis maupun embriogenesis somatik telah banyak. dilaporkan
menyebabkan perubahan genetik yang menyebabkan beragarn kelainan sifat dari
tanaman awal sumber eksplan (Skirvin dan Janick 1976, Calelf 1983, Scowcroft
ef aI.
1985, George 1996).
Fenomena timbulnya vari.bilitas genetik pada
tanaman yang diregenerasikan melalui kultur sel dan jaringan lazim disebut
145
dengan variasi somaklonal. Dalam membantu pemuliaan tanarnan untuk sifat
resistensi terhadap penyakit, induksi variasi somaklonal sering kali diikuti dengan
seleksi in vitro menggunakan agens penyeleksi berupa toksin yang dikeluarkan
oleh patogennya (Daub 1985, Wenzel 1985, Hammerschlag 1992). Keberhasilan
kombinasi kedua metode tersebut (variasi somaklonal dan seleksi in vitro)
bergantung pada tersedianya teknik regenerasi in vitro yang reproducible, adanya
agens penyeleksi yang dapat menyebabkan kondisi selektif terhadap sel atau
jaringan yang dikulturkan, dan adanya korelasi positif antara ekspresi fenotipik
pada tingkat sel dengan ekspresi pada tanaman utuh.
Dalam patogenesisnya, S. rolfsii menge1uarkan sejumlah besar asam
oksalal (OA), yaitu fitotoksin yang bertanggung jawab pada kematian jaringan
tanaman, sebelum dan seiring dengan pertumbuhan miseHa pada jaringan
tanaman yang terinfeksi (Backman 1984, Punja 1985, Punja et al. 1985). Toksin
yang terdapat dalam ekstrak kasar filtrat kultur S. rolfsii mungkin dapat
digunakan sebagai agens penyeleksi pada kultur kalus embriogenik kacang tanah.
Di lain pihak, sistem regenerasi kacang tanah melalui embriogenesis somatik
yang mapan telab dilaporkan sebelunmya oleh Edy (1998) dan Sulichantini
(1998). Oleh karena itu, percobaan selanjutnya dilakukan untuk mencarl teknik
seleksi in vitro embrio somatik kacang tanah dalam medium yang mengandung
filtrat kultur S. rolftii dan regenerasi planlet menjadi tanaman. Hasil pengamatan
menunjukkan bahwa penambahan 30% filtrat kultur S. rolfsii telah menyebabkan
kondisi sub-lethal pada embrio somarik yang diknlturkan selama 3 periode
pengulturan masing-masing satu bulan.
Setelab periode seleksi, dihasilkan
sejumlah embrio somatik yang insensitifterhadap filtrat kultur cendawan.
146
Setelah mengalami tahapan pemulihan, maturasi dan pengecambahan,
embrio somatik dapat diregenerasikan menjadi 50 planlet, yang seianjutnya
dipindahkan untuk ditanam di rumah plastik hingga panen. Benih RO: 1 dipanen
secara terpisah berdasarkan masing-masing nomor RO, lalu dikeringkan. Pada
musim berikutnya, ditanam tanaman somaklon Rl dari benih RO: 1, hingga
menghasilkan benih Rl:2 yang juga dipanen secara terpisah berdasarkan masingmasing Domor galur Rl. SeJanjutnya pada musim berikutnya ditanam tanaman
R2 dari benih R 1:2.
Tujuan akhir penelitian disertasi ioi adalah untuk mendapatkan varian
somaklonal kacang tanah yang resisten terhadap penyakit busuk batang
Sclerotium. Untuk itu, evaluasi respons ketahanan varian somaklon terhadap
penyakit target pada umumnya tidak dilakukan pada somaklon generasi RO,
melainkan pada somaklon generasi Rl dan R2, atau bahkan generasi berikutnya
Hal ioi diJakukan untuk meyakinkan bahwa karakter resistensi terhadap penyakit
Gika didapatkan) bersifat mewaris dengan stabil.
Dalam seleksi in vitro, sel atau jaringan diseleksi berdasarkan fenotipe
insensitivitas diantara populasi kalus embriogenik yang sensitif terhadap FK
cendawan. Dengan demikian sel atau jaringan varian yang insensitif hasH seleksi
in vitro diduga telah mengalami mutasi yang dikendalikan oleh gen dominan atau
telah mengalami mutasi ganda (jika mutan homosigot), sehingga identitas varian
dapat dievaluasi pada generasi RO. Pengulturan tunas RO basil seleksi in vitro
dalam media selektif MSO yang mengandung filtrat kultur cendawan S. rolfsii
diajukan sebagai metode identifikasi dini untuk tunas varian yang resisten
terhadap S. rolfsii. Tunas RO yang insensitif terhadap FK cendawan diharapkan
147
juga merupakan tunas yang resisten terhadap S. rolfsii.
Percobaan selanjutnya
adalah membandingkan metode pengujian tunas RO dan metode inokulasi dengan
S. rolfsii pada potongan daun atau anak dauD tanaman RO (detached leaf test)
dengan inokulasi yang dilakukan pada somaklon generasi Rl di rumah plastik.
Dari percobaan ini dapat disimpu1kan babwa pengulturan tunas RO dalam
media selektif berisi 30% filtrat kultur cendawan dapat digunakan sebagai
identifikasi dini galur kacang tanah yang taleran terhadap infeksi S. rolfsii hasil
seleksi in vitro. Walaupun dernikian. pengujian resistensi terhadap S. ro/fsii perlu
dilakukan terhadap varian somaklonal pada generasi selanjutnya (R2) untuk
mempelajari apakah karakter tersebut secara konsisten mewaris dan stabil,
sekaligus uotuk menyeleksi karakter agronomi unggul yang lain.
Kalaupun dari penelitian ini pada akhimya didapatkan vanan dengan
fenotipe resisten terhadap penyakit busuk batang, hal lain yang perlu diperhatikan
adalah keragaan agronomis dari varian somaklon tersebut. Hasil akhir yang
dibarapkan dari penelitian disertasi ini adalab didapatkannya sifat resistensi
terhadap penyakit pada varian somaklon yang keragaan agronontisnya tidak lebih
jelek daripada tanaman awal. Dengan kata lain, varian somaklon kacang tanah
yang resisten terhadap S. rolfsii dibarapkan juga menghasilkan pnlong bemas
dalam jumlab yang sarna atau lebih banyak dibandingkan dengan tanaman awal
yang sehat.
Oleh karena itu, percobaan selanjutnya bertujuan untuk mengevaluasi
keberadaan dan frekuensi keragaman karakter morfologi, agronomi atau fisiologi
pada pnpulasi tanaman kacang tanab yang diregenerasikan dari ES yang
insensitif terhadap filtrat kultur cendawan basil seleksi in vitro, dan menentukan
148
keragaman karakter yang diamati sebagai penyimpangan akibat faktor genetik
atau epigenetik dengan mengamati keberadaannya di antara populasi RO, RI dan
R2, serta mengidentifikasi galur-galur varian somaklonal yang menunjukkan
sifat-sifat penting yang dapat digunakan sebagai plasma outfah barn kaeang
tanab.
HasH pengamatan menunjukkan bahwa, varian somaklonal kacang tanah
yang dijumpai untuk karakter kualitatif maupun kuantitatif banyak yang bernilai
agronomi negatif. Akan tetapi. sejumlah nomor galur R2 zuriat nomor-nomor RO
tertentu mempunyai tinggi tanaman dan jumlah polong bemas yang sarna atall
lebih tinggi dan jumlah polong cipo yang sarna atall lebih sedikit daripada nilai
tanaman awalnya Dipedukan pengujian Iebih lanjut untuk menapis karakter
varian yang resisten terhadap infeksi S.rolfsii pada populasi tanaman somaklon
tersebut sehingga pada akbimya didapatkan karakter yang diharapkan, yaitu
varian somaklonal yang resisten terhadap penyakit busuk. batang Sclerotium,
sekaligus mampu mengbasilkan polong bemas dalam jumlab sama atau lebih
besar daripada tanaman awal yang tidak diinokulasi.
HasH evaluasi respons tanaman somaklon Rl dan R2 terhadap inokulasi
dengan S. rolftii di rumab plastik menunjukkan babwa dati 18 tanaman somaklon
RI zuriat dari 6 galur RO yang diinokulasi dengan S. rolftii, didapatkan \0
somaklon yang bertahan hidup dengan gejala penyakit pada skor 2 atau 3, dan
menghasilkan benib Rl :2. Hasil inokulasi dengan S. rolftii pada populasi
tanaman R2
zuriat galur Rl terpilih menunjukkan bahwa dari 158 nomor R2 yang
diinokulasi dan terinfeksi S. rolftii terdapat 66 tanaman yang pada aWainya
menunjukkan gejala penyakit dengan skor 1-3, diikuti dengan indikasi resistensi
149
terhadap penyakit yang ditandai dengan munculnya gejala penyemhuhan luka
pada lesio. Dari 66 tanaman yang resisten tersebut, beberapa tanaman hanya
menghasilkan polong bemas lebih sedikit, namun 20 somaklon resisten yang lain
mampu menghasilkan poiong bernas yang hampir sarna atau lebih besar
dibandingkan tanaman kacang tanah awal yang tidak diinokulasi. Dengan
demikian, tujuan akhir dari disertasi ini, yaitu mendapatkan varian somaklon
kacang tanah yang resisten terhadap penyakit busuk batang Sclerotium melalui
induksi variasi somaklonal dan seleksi in vitro ernbrio somatik dengan agens
penyeleksi herupa 30% filtrat kultur S. rolfsii, telab tercapai. Walaupun demikian,
penelitian lebih lanjut untuk mengevaluasi kestabilan sifat resisten terhadap
penyakit busuk batang dan mendapatkan mutan homozigot pada generasi
berikutnya melalui beberapa selfing masih perlu dilakukan.
Mekanisme ketahanan yang terjadi pada varian somaklonal yang resisten
terhadap penyakit busuk batang diduga berhubungan dengan detoksifikasi salah
satu faktor patogenisitas S. rolfsii yaitu asam okaalat (OA). OA disekresikan oleh
S. rolfsii pada awal dan selama proses patogenesisnya, dan berperan dalam
kematian jaringan inang bersama-sama dengan· enzim-enzim pendegradasi
dinding sel (Punj. 1985). Oleh karen. itu, filtrat kultur S. rolfsii yang digunakan
untuk seleksi in vitro kemungkinan besar mengandung sejwnlah besar asam
okaalat. Filtrat kultur cendawan mempunyai pH sang.t asam, yaitu 2.9 - 3.0.
Enzim pendegradasi dinding sel di dalam filtrat kultur cendawan mungkin tidak
aktif lagi karena sebelum disaring biakan cendawan disterilkan dengan autoklaf.
Strategi yang umum digunakan untuk menjadikan suatu tanaman resisten
terhadap
cendawan
patogen
yang
mensekresikan
OA
adalah
dengan
150
mendegradasi OA tersebut pada saat awal terjadinya infeksi (Lu 2003). Salab
satu enzim yang dapat mengubah OA menjadi produk yang tidak toksik bagi
tanaman adalah oxalate oxidase (OXO) (Lane et at. 1991). Enzim ini ditemukan
di banyak tanaman, yaitu gandum, barley, jagung, oat, padi, rye dan cemara
(Dunwell
el
al. 2000, Lane 2002). Oleh karena itu, besar kemungkinan kacang
tanah juga mempunyai gen penyandi enzim ini. OA memang telah ditemukan di
banyak tanaman dalam konsentrasi rendab di vakuola
(~alis~an
2000). Diduga,
tanaman somaklon resisten kacang tanah yang didapatkan dalam penelitian ini
telah mengalami ekspresi berlebih enzim OXO setelah mengalarni seleksi in vitro
dengan agens penyeJeksi yang mengandung OA. Hal ini dapat disebabkan oleh
tidak aktifnya trans-acting/actor yang semula menghambat aktivitas enzim axo
atau terjadinya duplikasi sekuen gen penyandi OXO karena terjadi chromosomal
rearrangengement. Perubahan genetik yang mendasari terjadinya variasi
somaklonal meliputi mutasi titik (single nucleotide changes), perubahan jumlah
kopi gen tertentu, aktivasi transposable element, perubahan jumlah kromosom,
chromosomal
rea"angenements,
dan metilasi
DNA
(Scowcroft
1985,
Hanunerschlag 1992).
Dengan dipaparkannya serangkaian hasil penelitian disertasi ini, maka hal
yang terpenting adalab babwa induksi variasi somaklonaI yang diikuti dengan
seleksi in vitro menggunakan filtrat kultur cendawan patogen telah terbukti dapat
diguiiakan untuk: mendapatkan tanaman varian somaklonal yang resisten terhadap
patogen yang bersangkutan.