identifikasi Begomovirus Indonesia Pada Tomat

IX. PEMBAHASAN UMUM
Begomovirus adalah virus tanaman yang merupakan salah satu agen
etiologi dari penyakit keriting daun yang saat ini muncul dan menjadi ancaman
serius pada tanaman hortikultur, termasuk tomat di beberapa daerah sentra
produksi di Indonesia. Munculnya penyakit yang disebabkan oleh Begomovirus
tersebut telah diidentifikasi dan dilaporkan oleh beberapa peneliti pada tanaman
tomat dan cabai pada beberapa tahun terakhir (Hidayat et al. 1999; Sudiono et al.
2001; Aidawati et al. 2005; Hidayat et al. 2006; Sukamto et al. 2006). Aktivitas
manusia dan teknik pertanian modern diduga sebagai faktor kunci penyebab
munculnya Begomovirus di beberapa area produksi tomat di dunia, termasuk
Indonesia. Perubahan sistem bercocok tanam dengan penggunaan varietas-varietas
baru, budidaya tanaman secara luas dengan genotipe rentan, penggunaan pestisida
yang berlebihan, introduksi dan penyebaran virus-virus eksotik dan serangga
vektornya ke lingkungan yang baru merupakan implikasi munculnya berbagai
strain Begomovirus pada tanaman-tanaman yang berbeda (Morales & Anderson
2001; Varma & Malathi 2003). Selain itu, adanya karakteristik dan sifat intrinsik
dari Begomovirus itu sendiri seperti kemampuan berevolusi melalui rekombinasi
dan pseudo-rekombinasi dapat memunculkan spesies atau varian-varian baru
sehingga memicu epidemi penyakit pada suatu daerah (Harrison & Robinson
1999).
Pada studi ini, spesies virus tanaman dari genus Begomovirus yang
menginfeksi tomat telah berhasil dideteksi, dianalisis dan disekuen untuk
menentukan adanya keragaman genetiknya. Di samping itu, pemanfaatan strategi
non-PDR
dan
PDR
telah
berhasil
diaplikasikan
masing-masing untuk
mengembangkan tanaman tomat dan tembakau (N. tabaccum) sebagai tanaman
model yang tahan terhadap Begomovirus.
Terdapat variasi gejala-gejala spesifik pada tanaman tomat yang dapat
diamati dilapang, seperti misalnya daun menggulung/keriting, ukuran daun
menjadi kecil-kecil, daun seperti mangkuk (cupping), mosaik kekuningan,
tanaman kerdil. Meskipun gejala-gejala tersebut umumnya berasosiasi dengan
infeksi Begomovirus, namun demikian masih mengalami kesulitan untuk
133
menentukan hubungan yang tepat antara suatu tipe gejala dengan spesies virus
tertentu dalam kaitannya dengan deteksi dan identifikasi Begomovirus. Tipe gejala
yang muncul biasanya sangat bergantung pada genotipe inang, kondisi
lingkungan, atau adanya tidaknya infeksi campuran dari beberapa virus (mixed
infections). Dengan diperolehnya klon infeksius dari Begomovirus (Abhary et al.
2006), akan memungkinkan untuk mempelajari dan menentukan dengan lebih
detail hubungan antara spesies virus dan tipe gejala yang dimunculkan. Akan
tetapi, penggunaan klon infeksius ini untuk menentukan hubungan gejala masih
kurang praktis, karena infeksi campuran dari beberapa virus banyak ditemukan di
lapang. Dengan kenyataan ini, pendekatan yang digunakan untuk karakterisasi dan
deteksi Begomovirus yang menginfeksi tomat dalam studi ini mendasarkan pada
data molekuler (PCR).
Hasil deteksi Begomovirus yang menginfeksi tomat dengan teknik PCR
pada studi ini mendukung hasil-hasil penelitian yang telah dilakukan sebelumnya.
Hasil ini juga membuktikan bahwa Begomovirus telah muncul pada pertanaman
tomat di daerah-daerah lain yang sebelumnya belum pernah dideteksi. Dari 75
total sampel tanaman yang dikoleksi dari 7 daerah sentra produksi tomat (4
propinsi), diperoleh sebanyak 39 sampel yang positif menunjukkan adanya
Begomovirus. Pemilihan sampel untuk analisis keragaman genetik Begomovirus
dilakukan berdasarkan pada lokasi dimana sampel dikoleksi dan menunjukkan
hasil positif ketika dideteksi dengan PCR. Analisis sekuen pendahuluan untuk
mempelajari keragaman genetik dilakukan dengan menggunakan pendekatan
teknik PCR-RFLP menggunakan 4 macam enzim restriksi. Dengan teknik ini,
keragaman genetik yang dipelajari hanya mendasarkan pada sekitar 24 nukleotida
(dilihat dari panjang situs restriksi yang dikenali oleh enzim) dari total ±1500
nukleotida (fragmen hasil amplifikasi PCR). Fragmen 1500 merupakan fragmen
genom Begomovirus yang terdiri dari sekuen parsial ujung N gen AC1 (Rep),
daerah intergenik utuh (termasuk origin of replication) dan sekuen parsial ujung N
dari gen AV1(coat protein). Analisis delapan isolat Begomovirus yang berasal dari
daerah yang berbeda membagi isolat-isolat tersebut menjadi tiga kelompok dan
mengindikasikan adanya keragaman genetik di antara isolat-isolat tersebut.
Analisis sekuen yang lebih detail untuk melihat keragaman genetik isolat-
134
isolat Begomovirus dilakukan dengan menggunakan sekuen asam amino dari gen
AV1 (coat protein). Gen AV1 dari Begomovirus menyandikan protein selubung
(coat protein) dan merupakan gen yang paling konservatif (conserved gene).
Menurut Komisi Taksonomi Virus Internasional (International Committee on
Taxonomy of Viruses), sekuen gen AV1 telah dapat digunakan untuk identifikasi
dan klasifikasi Begomovirus yang belum diketahui (Khan & Ahmad 2005). Pada
penelitian ini, analisis sekuen nukleotida dan asam amino gen AV1 dari delapan
isolat Begomovirus mengindikasikan adanya keragaman genetik diantara isolatisolat Begomovirus. Berbeda dengan hasil analisis berdasarkan PCR-RFLP,
analisis filogenetik berdasarkan sekuen asam amino membagi isolat-isolat tersebut
menjadi dua kelompok yang berbeda namun semua isolat mempunyai kemiripan
genetik dengan Begomovirus yang lain, yaitu Ageratum yellow vein virus (AYVV)
atau Ageratum yellow vein virus-Taiwan (AYVV-Tw). Identitas sekuen gen AV1
dengan AYYV mempunyai tingkat kemiripan sekuen berkisar antara 92-95%
(sekuen nukleotida) dan 90-97% (sekuen asam amino). Menurut Rybicki (1998),
nilai identitas sekuen nukleotida 90% dapat digunakan untuk mengidentifikasi
sebuah virus sebagai spesies (<90%) atau strain yang baru (>90%). Berdasarkan
identitas ini, maka isolat-isolat Begomovirus pada penelitian ini dikategorikan
sebagai strain AYVV Indonesia. Hal ini juga menggambarkan bahwa isolat-isolat
Begomovirus yang menginfeksi tanaman tomat pada studi ini kemungkinan
merupakan satu progenitor yang sama dengan AYVV.
Seperti telah dijelaskan sebelumnya bahwa Begomovirus telah mendapat
perhatian cukup luas karena beberapa alasan. Selain karena perkembangan
Begomovirus baru yang sangat cepat melalui rekombinasi dan pseudorekombinasi di antara strain dan/atau spesies, juga karena kemampuannya untuk
menyebabkan kehilangan hasil yang nyata pada beberapa komoditas hortikultur,
termasuk tomat dan cabai. Beberapa pendekatan telah digunakan dalam usaha
untuk mengendalikan Begomovirus yang menginfeksi tanaman tomat, namun
hanya beberapa saja dari usaha tersebut yang terbukti efektif (Freitas-Astua et al.
2002). Usaha untuk mengendalikan kutu kebul secara biologi juga telah dilakukan
di dalam produksi tomat namun hasilnya tidak memuaskan (Mason et al. 2000)
Penggunaan varietas tomat yang tahan Begomovirus merupakan salah satu pilihan
135
strategi yang paling murah dan aman terhadap lingkungan. Mengingat adanya
rekombinasi yang berkontribusi terhadap keragaman Begomovirus sehingga
memunculkan varian-varian dan spesies baru, maka pengembangan tanaman
tomat tahan Begomovirus harus diarahkan pada ketahanan yang berspektrum luas
dan durabel (broad and durable resistance). Berdasarkan kenyataan tersebut,
maka pengembangan tanaman tomat tahan Begomovirus dapat dicapai dengan dua
pendekatan, yaitu pendekatan pathogen derived resistance (PDR) dan non-PDR.
Pendekatan PDR dilakukan dengan teknik rekayasa genetik menggunakan
sekuen utuh dari gen AV1 (gen CP) untuk mendapatkan tanaman tembakau (N.
tabaccum) sebagai tanaman model untuk mempelajari keefektifan gen tersebut
dalam ketahanan terhadap Begomovirus. Pendekatan ini telah menghasilkan
tanaman transgenik tembakau dengan tingkat ketahanan bervariasi antara yang
tahan, toleran dan rentan. Penelitian yang menggunakan gen CP utuh (full-length)
dari Begomovirus (TYLCV) juga telah dilakukan oleh Kunik et al. (1994) dan
Sinisterra et al. (1999) untuk memperoleh ketahanan terhadap TYLCV pada
tanaman tomat dan tembakau dan telah menghasilkan tanaman-tanaman yang
mengekspresikan ketahanan bervariasi antara tahan dan sangat rentan. Ketahanan
yang dihasilkan pada penelitian pertama ternyata berasoasiasi dengan ekspresi gen
CP pada level yang tinggi (coat protein-mediated resistance, CPMR), sedangkan
penelitian pada tembakau, ketahanan yang diperoleh berasosiasi dengan transkrip
RNA. Pemanfaatan gen CP melalui strategi PDR untuk memperoleh ketahanan
terhadap Begomovirus dilaporkan hanya efektif untuk Begomovirus yang
monopartit dibandingkan dengan bipartit. Hal ini kemungkinan berhubungan
dengan adanya kenyataan bahwa protein selubung (CP) diperlukan untuk infeksi
sistemik pada Begomovirus monopartit (Briddon et al. 1989; Rojas et al. 2001)
sehingga tanaman tomat yang mengekspresikan CP dari TYLCV (monopartit)
menunjukkan adanya penundaan perkembangan gejala dan penundaan ini sangat
bergantung pada tingkat ekspresi dari gen CP (Kunik et al. 1994). Sebaliknya, CP
dari Begomovirus bipartit tidak diperlukan untuk penyebaran sistemik dari virus,
karena nuclear shuttle protein (NSP) dapat menggantikan fungsi dari CP untuk
penyebaran (Ingham et al. 1995; Pooma et al. 1996). Oleh karena itu, strategi
menggunakan CP untuk memperoleh ketahanan terhadap Begomovirus bipartit
136
tidak akan menghasilkan ketahanan dengan level yang tinggi. Di Indonesia, strainstrain Begomovirus yang telah dipelajari (berdasarkan sekuen nukleotidanya)
merupakan Begomovirus yang monopartit (data tidak ditampilkan). Oleh karena
itu, pemanfaatan strategi PDR dengan menggunakan gen CP masih relevan untuk
menghasilkan tanaman yang tahan Begomovirus (TYLCV).
Pada studi PDR ini, ketahanan yang diperoleh diduga juga karena adanya
akumulasi dari produk protein gen AV1. Berbeda dengan penelitian Kunik et al.
(1994) yang menganalisis ekspresi gen CP dengan menggunakan pendekatan
Western blot, penentuan adanya akumulasi protein dari gen AV1 pada studi ini
mendasarkan pada jumlah kopi gen dari analisis molekuler menggunakan
Southern blot. Integrasi gen AV1 dengan satu kopi gen menunjukkan adanya
tingkat ketahanan yang tinggi terhadap Begomovirus dan sebaliknya jumlah kopi
lebih dari satu gen memberikan respon tingkat ketahanan yang rendah. Hal ini
diduga karena integrasi gen multikopi menyebabkan tidak berfungsinya gen AV1
karena terjadinya pembungkaman gen (gene silencing) sehingga tidak terbentuk
protein. Selain itu, mekanisme ketahanan yang diperoleh melalui pendekatan PDR
ini kemungkinan bukan merupakan mekanisme ketahanan yang dimediasi oleh
RNA (RNA-mediated resistance). Hal ini didukung oleh beberapa alasan, di
antaranya adalah bahwa Begomovirus adalah virus dengan genom DNA,
mekanisme ketahanan melalui lintasan pembungkaman RNA alami (natural RNA
silencing pathways) berbeda dengan virus dengan genom RNA. Genom RNA
virus dapat secara langsung dihancurkan oleh siRNA (small interfering RNA)
sesuai dengan mekanisme dari lintasan pembungkaman sitoplasmik (cytoplasmic
silencing pathway), sedangkan komponen genom DNA Begomovirus bukan
merupakan target dari pembungkaman RNA sitoplasmik. Jadi hanya produk
transkripnya yang dapat menjadi target pada mekanisme ini. Namun demikian,
untuk mempelajari lebih detail mekanisme ketahanan yang terjadi pada tanaman
tembakau transgenik yang membawa gen AV1 Begomovirus maka perlu dilakukan
analisis Northern dan Western Blot untuk mengetahui ada tidaknya transkrip dan
produk proteinnya.
Pendekatan non-PDR dilakukan dengan menggunakan gen-gen ketahanan
yang tersedia secara alami (gen R) terutama pada spesies liar dan kemudian gen-
137
gen tersebut diintroduksikan ke varietas rentan dengan program pemuliaan
konvensional. Pada penelitian ini, pendekatan non-PDR dilakukan dengan
memanfaatkan gen ketahanan (gen R) dari spesies liar yang telah diintroduksikan
ke dalam galur tanaman tomat budidaya (galur FLA456 dari AVRDC). Tanamantanaman tomat generasi F1 (F1-TYLCV dan F1-DC) telah dihasilkan melalui
persilangan konvensional dengan galur tahan Begomovirus dari AVRDC
(FLA456) dan tanaman-tanaman F1 tersebut menunjukkan adanya respon
ketahanan terhadap TYLCV (Begomovirus). Tanaman-tanaman F1 tahan yang
telah diperoleh akan digunakan sebagai materi untuk mengembangkan tanaman
tomat yang stabil mempunyai ketahanan terhadap Begomovirus melalui
serangkaian persilangan (silang balik dan silang sendiri). Namun demikian,
meskipun dari penelitian tahap awal ini telah dihasilkan beberapa tanaman F1
yang tahan, dari beberapa laporan penelitian menunjukkan bahwa pengembangan
tanaman tomat tahan melalui pendekatan tradisional/persilangan masih banyak
menemui hambatan. Hambatan-hambatan tersebut di antaranya adalah sumber gen
R biasanya terdapat pada spesies liar dan ini akan sulit untuk memindahkan ke
tanaman budidaya karena faktor inkompatibilitas dan sterilitas. Selain itu,
introduksi gen R dengan program pemuliaan konvensional banyak memakan
waktu dan tenaga, terutama untuk gen R yang bersifat resesif, dan terkadang
terjadi linkage drag. Pada studi ini, juga diperoleh informasi bahwa dari dua galur
AVRDC yang digunakan, hanya satu galur (FLA456) yang memberikan respon
tahan terhadap Begomovirus (TYLCV) sedangkan galur yang lain memberikan
respon rentan (FLA478). Hal ini mengindikasikan bahwa galur-galur tahan yang
telah ditanam dilapang atau dievaluasi masih menunjukkan respon rentan dengan
strain-strain Begomovirus yang lain dan ketahanan yang diperoleh mempunyai
spektrum yang sempit. Oleh karena itu, kombinasi dari pendekatan PDR dan nonPDR untuk pengembangan tanaman tomat tahan terhadap virus dengan sifat
ketahanan yang berspektrum luas dan tahan lama (durabel) kemungkinan besar
akan dapat dicapai.
Secara umum, pemanfaatan strategi PDR dengan rekayasa genetik akan
memberikan peluang menghasilkan tanaman transgenik yang tahan untuk setiap
virus (cross protection) dan akan mempunyai peranan penting pada pertanian
138
modern di masa mendatang. Penggunaan pestisida akan dapat dikurangi atau
dihindari dengan pemanfaatan tanaman transgenik yang tahan. Namun demikian,
pemanfaatan tanaman transgenik tahan virus masih mengalami kendala untuk
diaplikasikan terutama berkaitan dengan penerimaan produk transgenik oleh
masyarakat dan masalah keamanan hayati. Selain itu, pengembangan tanaman
transgenik tahan virus dengan strategi protein mediated resistance (PMR) masih
berhadapan dengan regulasi untuk pelepasannya karena berkaitan dengan produk
protein yang dihasilkan (perlu ada pengujian tersendiri) dan ini berbeda dengan
tanaman transgenik dari RNA mediated resistance yang biasanya tidak
menghasilkan protein.
139