noni mardian trizana
advertisement
UJI KINERJA PROMOTER GEN LEAFY DAN AGAMOUS TANAMAN KAKAO (Theobroma cacao L.) PADA TANAMAN TEMBAKAU (Nicotiana tabacum L.) NONI MARDIAN TRIZANA SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Uji kinerja promoter gen LEAFY dan AGAMOUS tanaman kakao (Theobroma cacao L.) pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) adalah benar hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka tesis ini. Bogor, Maret 2012 Noni Mardian Trizana NRP G851100071 ABSTRACT NONI MARDIAN TRIZANA. Performance test of cocoa’s (Theobroma cacao L.) LEAFY and AGAMOUS promoters in tobacco plant (Nicotiana tabacum L.)1) Supervised by I MADE ARTIKA and TETTY CHAIDAMSARI Performance of cocoa’s (Theobroma cacao L.) gene promoters, TcLFY and TcAG, in a tobacco plant (Nicotiana tabacum L.) used as a plant model has been tested. The two promoters were introduced into the tobacco plant cells using a modified leaf discs method employing Agrobacterium tumifaciens AGL0. The transformed tobacco plant cells were then regenerated and their morphology were observed periodically. The tobacco plants harbouring the gene promoter TcLFY, during regeneration, showed a leaf morphology similar to that of the positive control. However, the growth rate of tobacco plants inserted with promoter TcLFY was faster compared to that of the positive control. Tobacco plants harbouring gene promoter TcAG, during regeneration, showed imperfect leaf morphology. The growth rate of these tobacco plants was slower than that of the positive control and of the tobacco plants inserted harbouring gene promoter TcLFY. These results indicated that the introduced promoters affect the morphology of the tobacco plants. In order to further confirm the presence of the GFP gene and activation of TcLFY: GFP and TcAG: GFP, a molecular verification test was carried out. Variation of sucrose concentration in the media was made to examine the effect of sucrose on the activity promoters TcAG and TcLFY in tobacco plants. The sucrose concentration tested were 0%, 0,5% and 4% followed by observation on the 3rd and 7th day of cultivation. At 0% sucrose concentration the tobacco plants harbouring promoter TcLFY showed yellowish leaf, while those cultivated in the media with sucrose concentration of 0.5% and 4% grew well and normal. This indicated that sucrose affects the activity of the promoter TcLFY in tobacco plants. Tobacco plants inserted with promoter TcAG did not show significant morphological changes when grown in a medium of 0%, 0,5% or 4% sucrose concentration. This indicated that addition of sucrose does not significantly affect the induction of expression of the AG gene and the activation of the promoter TcAG. Keywords: Agamous, Leafy, Promoter, sucrose, Theobroma cacao L RINGKASAN NONI MARDIAN TRIZANA. Uji Kinerja Promoter Gen LEAFY dan AGAMOUS Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) pada Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum L.). Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan TETTY CHAIDAMSARI Kakao merupakan tanaman perkebunan yang memiliki potensi dalam pertumbuhan perekonomian Indonesia. Perkebunan kakao di balik potensinya yang besar masih memiliki kendala yaitu hama tanaman, kualitas rendah, pembungaan dan layu pentil. Pendekatan secara biologi molekuler dilakukan untuk uji lanjut terhadap promoter gen pembungaan yaitu promoter gen TcLFY yang berperan sebagai gen pusat pembungaan dan promoter gen TcAG yang berperan pada proses pembungaan dan pembuahan. Uji kinerja dari promoter ini dilakukan dengan transformasi ke tanaman model tembakau. Penyisipan promoter TcLFY dengan ukuran 1650 bp dan promoter TcAG dengan ukuran 1200 bp dari tanaman kakao (Theobroma cacao L.) telah dilakukan pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) yang berfungsi sebagai tanaman model. Transformasi genetik promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG ke dalam sel tanaman tembakau dilakukan dengan teknik cakram daun (leaf disk) yang dimodifikasi melalui Agrobacterium tumifaciens AGL0. Morfologi tanaman diamati secara berkala. Tanaman tembakau yang disisipi promoter TcLFY selama regenerasinya menunjukkan morfologi atau bentuk daun yang mirip dengan daun tembakau kontrol positif. Namun pertumbuhan tanaman tembakau yang disisipi promoter TcLFY, pertumbuhannya lebih cepat jika dibandingkan kontrol positif. Tanaman tembakau yang disisipi promoter TcAG selama regenerasinya menunjukkan morfologi daun atau bentuk daun yang tidak sempurna. Namun pertumbuhan tanaman tembakau yang disisipi promoter TcAG lebih lambat jika dibandingkan kontrol positif dan tanaman tembakau yang disisipi promoter TcLFY. Hasil dari pengamatan bentuk daun pada tanaman tembakau tersebut menunjukkan bahwa promoter mempengaruhi morfologi pada tanaman. Verifikasi secara biologi molekuler dilakukan untuk konfirmasi lebih lanjut keberadaan gen GFP dan aktivasi dari TcLFY:GFP dan TcAG:GFP. Verifikasi ini dilakukan dengan isolasi DNA genomik daun tembakau mengacu kepada metode Orozco et al., (1994) yang dimodifikasi dan amplifikasi menggunakan PCR. Sukrosa diketahui mengaktifkan promoter LEAFY pada Arabidopsis. Variasi media sukrosa dilakukan untuk menguji pengaruh sukrosa terhadap kerja promoter TcLFY dan TcAG pada tanaman tembakau.Variasi sukrosa dilakukan pada 3 konsentrasi sukrosa yaitu 0%, 0,5% dan 4% dengan jangka waktu 3 hari pengamatan dan 7 hari pengamatan. Pada konsentrasi sukrosa 0% tanaman tembakau yang disisipi promoter TcLFY memperlihatkan daun yang menguning, berbeda halnya dengan media sukrosa 0,5% dan 4% yang tumbuh dengan baik. Hal ini mengidentifikasikan bahwa sukrosa mampu mempengaruhi aktivitas dari promoter TcLFY pada tanaman tembakau. Tanaman tembakau yang disisipi promoter TcAG tidak memperlihatkan perubahan morfologi yang signifikan seperti promoter TcLFY pada variasi sukrosa 0%, 0,5% dan 4%. Penambahan induksi sukrosa tidak terlalu berpengaruh terhadap ekspresi dari gen AG. Hal ini juga terjadi pada aktivitas promoter TcAG yang tidak berpengaruh aktivitasnya dengan penambahan sukrosa. © Hak Cipta Milik IPB, tahun 2012 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB. 2. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa ijin IPB. UJI KINERJA PROMOTER GEN LEAFY DAN AGAMOUS TANAMAN KAKAO (Theobroma cacao L.) PADA TANAMAN TEMBAKAU (Nicotiana tabacum L.) NONI MARDIAN TRIZANA Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Mayor Biokimia SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Judul Penelitian Nama NIM : Uji kinerja promoter gen LEAFY dan AGAMOUS tanaman kakao (Theobroma cacao L.) pada tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) : Noni Mardian Trizana : G851100071 Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Ir I Made Artika, M.App.Sc Ketua Dr. Tetty Chaidamsari, M Si Anggota Diketahui : Ketua Program Studi Biokimia Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS Tanggal Ujian: 26 Maret 2012 Dekan Sekolah Pascasarjana Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc, Agr Tanggal lulus: PRAKATA Alhamdulillah segenap rasa syukur penulis ucapkan ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penelitian yang berjudul Uji Kinerja Promoter Gen LEAFY dan AGAMOUS Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) pada Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum L.) dapat diselesaikan. Sholawat beriring salam terus tercurahkan kepada suri tauladan kita yang mulia Rasulullah Muhammad SAW. Penulis menyampaikan ucapan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah membantu dan mendukung penelitian ini yaitu: 1. Bapak Dr.Ir I Made Artika, M.App.Sc dan Ibu Dr. Tetty Chaidamsari, MSi sebagai dosen pembimbing yang memberikan arahan dan motivasi beliau sehingga tulisan ini dapat diselesaikan. 2. Ibu Prof. Dr. drh. Maria Bintang MS yang telah memberikan motivasi dan arahan sehingga sehingga tulisan ini dapat diselesaikan. 3. Bapak Dr. Djoko Santoso sebagai pembimbing pada proses Isolasi Promoter TcAG tanaman kakao 4. Ucapan terima kasih juga Penulis sampaikan kepada keluarga, Ayah dan Ibu tercinta, yang telah memberi dukungan berupa do’a dan materil 5. Teknisi di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia yang mendukung dalam penelitian yang telah dilakukan. Teknisi yang ikut mendukung yaitu teh Herti, teh Nia, teh Aan, teh Nina, teh Rini, teh Riana, mas Heri, dan mas Topan. 6. Teman-teman Biokimia 2010 yaitu Mbak Martha, Mbak Sri, Mbak Eliz, Mbak Lia, Mbak Nunu, Kak Bobi, yang telah memberikan motivasi dan do’anya. 7. Kepada teman-teman seperjuangan yaitu Uni Zikra, Upik, Isni, Cicin, Mbak Maria, Eka, Teh Kanti yang selalu memberi motivasi dan do’anya. Penulis juga menyadari keterbatasan pengetahuan dan pengalaman dalam penulisan usulan penelitian ini, untuk itu Penulis sangat terbuka terhadap kritik dan saran yang diberikan demi penyempurnaan isi tulisan ini. Semoga keterbatasan tersebut mendorong Penulis untuk terus belajar dan penelitian ini dapat bermanfaat bagi pihak-pihak yang memerlukannya. Bogor, Maret 2012 Noni Mardian Trizana NRP G851100071 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sawahlunto, 9 Maret 1988 sebagai anak sulung dari dari pasangan Slamet Sutrisno dan Supriyanti. Penulis memulai pendidikannya pada tahun 1993 di SDN 11 Kampung Surian, Kecamatan Barangin, Sawahlunto dan lulus pada tahun 1999. Tahun 2002 penulis lulus dari SLTPN 02 Sawahlunto, yang kemudian melanjutkan ke SMU 01 Sawahlunto dan menyelesaikannya hingga tahun 2005. Tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Program Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur SPMB. Penulis menyelesaikan program studi sarjana jurusan Biokimia di Institut Pertanian Bogor pada tahun 2010. DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL……................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................. xvi PENDAHULUAN.......................................................................................... Latar Belakang.................................................................................... Tujuan Penelitian................................................................................ Hipotesis Penelitian…………………………………………………. Manfaat Penelitian.............................................................................. 1 1 3 3 3 TINJAUAN PUSTAKA................................................................................. Botani dan Morfologi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.)……. Gen Pembungaan…………………………………………………… Promoter….……………………………............................................ Tanaman Tembakau………………………………………………… Transformasi Tanaman……………………………………………... Kultur Jaringan……………………………………………………… 5 5 7 10 11 12 13 BAHAN DAN METODE.................................................................. ............. Bahan dan Alat....................................................................... ............. Metode Percobaan.................................................................. ............. Transformasi ke tanaman tembakau…………………………… Kultur jaringan………………………………………………… Isolasi DNA tembakau……………………………………….... PCR……………………………………………………………. Variasi media………………………………………………….. 17 17 17 17 18 19 19 20 HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………………………... Konsentrasi kanamisin…………………………………………....... Transformasi ke tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.)……… Regenerasi eksplan tembakau yang membawa kontruksi promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG………………………………. Konfirmasi promoter gen TcLFY dan TcAG...................................... Variasi media sukrosa……………………………………………… 21 21 23 SIMPULAN DAN SARAN………………………………………………… 45 DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………. 47 LAMPIRAN………………………………………………………………… 51 27 37 39 DAFTAR TABEL Halaman 1 Nilai OD Agrobacterium tumifaciens AGL0 dari kedua konstruk yang diukur pada panjang gelombang 600 nm…………………………….......... 25 2 Perbedaan jumlah inisiasi pada tanaman tembakau………………………... 29 3 Variasi media dengan sukrosa pada inkubasi 3 hari……….….…………… 41 4 Variasi media dengan sukrosa pada inkubasi 7 hari……………………….. 42 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Bagian bunga kakao, stamen (Sta), sepal (Se), petal (Pe), pistil (Pi) dan staminod (Std)…………………………………………………………….. 7 2 Aktivasi gen kelas A,B dan C oleh gen LFY……………………………... 9 3 Model ABC dari perkembangan pembungaan Arabidopsis, fungsi gen kelas A, B dan C yang mempengaruhi bentuk dari meristem bunga (Se: sepal, Pe: petal, St: stamen, Ca: karpel)…………………………………... 9 4 Posisi promoter dalam suatu gen…...…………………………………….. 11 5 Struktur kanamisin……………………………………………………….. 22 6 Posisi promoter dan gen reporter GFP pada vektor pGWB serta gen seleksi kanamisin nptII……………………...…………………………….. 23 7 Kondisi kultur bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa konstruk promoter TcLFY dan promoter TcAG (a) hari ke 0 (b) setelah 2 hari inkubasi………………………………………………………………. 24 8 Mekanisme transformasi promoter TcLFY dan TcAG dari Agrobacterium tumifaciens AGL0 ke tanaman tembakau…………………….…………... 27 9 Proses inisiasi eksplan pada tanaman tembakau yang berumur 18 hari (a) tanaman kontrol negatif, (b) tanaman kontrol positif, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY………………………………….................... 28 10 Perbedaan morfologi tanaman tembakau yang berumur 40 hari, (a) tanaman kontrol negatif, (b) tanaman kontrol positif, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (d) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY……………………………………………… 30 11 Perbedaan morfologi tanaman tembakau yang berumur 2 bulan, (a) tanaman kontrol negatif, (b) tanaman kontrol positif, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (d) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY…………………..………………………….. 32 12 Perbedaan morfologi tanaman tembakau yang berumur 4 bulan, (a) tanaman kontrol, (b) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY………... 34 13 Proses aktivasi dan inaktivasi gen MAD-Box pembungaan pada tanaman. Agamous (AG) menghambat ekspresi dari Apetala (AP), leafy (LFY) dan (WUS), LFY mengaktifkan ekspresi AG, AP dan AP3………………………………………………………………………... 35 14 Mekanisme pengaktifan promoter AG oleh protein LFY…………………. 36 15 Isolasi DNA genomik tembakau (a) kontrol, (b) TcAG dan (c) TcLFY…... 38 16 Amplifikasi gen reporter GFP, (a) GFP dari promoter TcAG, (b) GFP dari promoter TcLFY…………………………………………………………... 38 17 Sinyal sukrosa pada tanaman yang menginisiasi gen pembungaan……….. 44 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian…………………………………………………...… 52 2 Komposisi media…………………………………………………………… 53 3 Gen-gen yang terlibat dalam organogenesis tanaman……………………… 54 4 Gen yang berperan pada proses pembungaan (promoter) dan penghambat proses pembungaan (repressor)……………………………………………. 55 5 Ekpresi gen ABC pada pembungaan………………………………………. 56 6 Proses pembuatan coklat…………………………………………………… 57 7 Perubahan berat yang terjadi pada tanaman tembakau……………………... 58 1 PENDAHULUAN Latar Belakang Kakao merupakan salah satu komoditas perkebunan yang penting bagi perekonomian nasional yaitu sebagai penyedia lapangan kerja, sumber pendapatan dan devisa negara. Kakao juga berperan dalam mendorong pengembangan wilayah. Perkebunan kakao telah menyediakan lapangan kerja dan sumber pendapatan bagi sekitar 900 ribu kepala keluarga petani yang sebagian besar berada di Kawasan Timur Indonesia (KTI) pada tahun 2002, serta memberikan sumbangan devisa terbesar ke tiga sub sektor perkebunan setelah karet dan kelapa sawit dengan nilai sebesar US$ 701 juta (Lingga 2007). Namun pada tahun 2008 sumbangan devisa ini meningkat menjadi US$ 1150 juta (BBP2TP 2010). Saat ini Indonesia menduduki urutan ke tiga di dunia sebagai penghasil kakao setelah Pantai Gading (38,3%) dan Ghana (20,2%). Angka produksi kakao Indonesia sebesar 13,6% (BBP2TP 2010). Permintaan dunia terhadap komoditas kakao semakin meningkat dari tahun ke tahun. Organisasi ICCO (International Cocoa Organization) memperkirakan produksi kakao dunia akan mencapai 4,05 juta ton, sementara konsumsi akan mencapai 4,1 juta ton, sehingga akan terjadi defisit sekitar 50 ribu ton per tahun. Produksi kakao Indonesia pada tahun 2005 yaitu 435 ribu ton/tahun. Hal ini tidak sebanding mengingat Indonesia masih mempunyai banyak lahan kosong yang sebenarnya bisa digunakan untuk produksi kakao. Kendala lain yang dialami Indonesia dalam produksi kakao yaitu serangan hama, kualitas dari buah kakao yang masih rendah dan benih yang dipakai oleh petani kakao bukan merupakan benih unggul. Potensi kerugian biji kakao Indonesia ke Amerika Serikat akibat mutu rendah sebesar US$ 301,5/ton, dan produk kakao Indonesia di pasar internasional dikenai diskon US$ 200/ton atau 10-15% dari harga pasar. Harga kakao dunia saat ini bisa mencapai US$ 3300 per ton (BBP2TP 2010). Permasalahan lain pada produksi kakao yaitu pada permasalahan pembungaan dan layu pentil. Layu pentil merupakan penyakit fisiologis pada tanaman kakao. Persentase layu pentil bisa mencapai 60-90% dan berlangsung pada umur 0-70 hari (PPKKI 2004). Usaha untuk memperbaiki produksi kakao 2 secara pembungaan dilakukan secara biologi molekuler. Salah satu usahanya yaitu penemuan gen-gen yang berperan penting pada proses pembungaan dan proses pembungaan menuju buah. Gen-gen yang berperan tersebut antara lain LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1), CAULIFLOWER (CAL), FRUITFULL (FUL), dan AGAMOUS (AG) (Dean & Simpson 2002). Promoter gen pembungaan dari buah kakao yang akan dilakukan uji lanjut diantaranya yaitu Theobroma cacao L. AGAMOUS (TcAG) dan Theobroma cacao L. LEAFY (TcLFY). Proses pembungaan bisa diinduksi oleh senyawa tambahan yang diberikan secara eksogen untuk mempengaruhi ekspresi dari gen pembungaan. Induksi dengan senyawa chlormequat chloride (CCC) diketahui telah berhasil mempercepat proses pembungaan dengan mengaktifkan senyawa sukrosa endogen tanaman (Samanhudi 2006). Selain dengan induksi CCC, induksi dengan giberelin juga telah terbukti mempengaruhi aktivitas pembungaan. Blazquez et al., (1998) melaporkan bahwa pemberian giberelin dan sukrosa secara eksogen mampu mempengaruhi proses pembungaan dengan mengaktifkan kerja dari promoter LFY pada Arabidopsis. Tingginya kebutuhan kakao dunia membuat Indonesia semakin giat untuk meningkatkan produksi dan kualitas kakao. Buah kakao Indonesia mengalami peningkatan sedikit dari segi kuantitas tetapi dari segi kualitas, kakao Indonesia masih tergolong rendah. Peningkatan kualitas diupayakan Indonesia dimulai dengan usaha penyediaan bibit unggul, pemupukan, peningkatan kualitas tanah, dan pengendalian genetik kakao untuk peningkatan kualitas bunga dan buah. Pengendalian genetik dengan induksi pembungaan dilakukan untuk mempercepat proses pembungaan. Pengendalian genetik dengan induksi ini bisa dilakukan dengan bagian gen berupa promoter. Penelitian ini bertujuan mempelajari fungsi promoter gen TcLFY dan TcAG tanaman kakao (Theobroma cacao L.) dengan transformasi tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.). 3 Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mempelajari fungsi promoter gen TcLFY dan TcAG tanaman kakao (Theobroma cacao L.) dengan transformasi tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.). Hipotesis Penelitian Promoter yang digunakan untuk mengontrol ekspresi gen TcLFY dan TcAG pada tanaman tembakau dapat dipelajari sifat dan pengaruhnya. Manfaat Penelitian a. Bagi perguruan tinggi Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mendorong insitusi untuk mengembangkan teknik dan mencari ide-ide baru dalam pengembangan tanaman perkebunan, salah satunya tanaman kakao sehingga dapat dihasilkan kualitas dan kuantitas dari tanaman kakao yang lebih tinggi. b. Bagi mahasiswa Penelitian ini diharapkan mampu memacu mahasiswa untuk berfikir kreatif, inovatif, dan dinamis. Khususnya dalam hal membantu petani dalam menyelesaikan permasalahannya dalam meningkatkan produksi kakao dari segi kualitas dan kuantitas. Pelaksaan penelitian ini juga membantu menumbuhkan sikap kepedulian mahasiswa terhadap permasalahan yang terjadi pada petani. Selain itu mahasiswa juga bisa menambah wawasan dan pengalamannya. c. Bagi masyarakat Hasil penelitian ini diharapkan dapat membantu mengatasi masalah dari Theobroma cacao L. dalam hal perbanyakan buah dan mendapatkan kualitas buah yang terbaik. Promoter gen TcLFY dan TcAG dapat digunakan sebagai regulator dalam proses pembungaan menjadi buah coklat sehingga buah yang dihasilkan 4 mempunyai kualitas yang bagus, mengalami peningkatan harga dan bisa mensejahterakan kehidupan petani. d.bagi pemerintah Pemerintah diharapkan dari hasil penelitian ini dapat membantu petani kecil baik sarana dan prasarana untuk mendukung kelancaran petani dalam memproduksi buah kakao yang berkualitas. 5 TINJAUAN PUSTAKA Botani dan Morfologi Tanaman Kakao (Theobroma cacao L.) Tanaman kakao (Theobroma cacao L.) merupakan tanaman dikotil dan termasuk ke dalam famili Sterculiaceae. Jumlah kromosom yang dimiliki tanaman kakao yaitu 2n = 20. Tanaman kakao dewasa bisa mencapai ketinggian 6-9 m (Tjasadiharja 1987). Daerah dataran rendah tropis dengan ketinggian 1000 m di atas permukaan laut merupakan daerah tanaman kakao tumbuh. Curah hujan yang merata sepanjang tahun dengan minimal 90-100 mm per bulan diperlukan pula oleh tanaman kakao. Curah hujan yang baik untuk pertumbuhan tanaman kakao dipengaruhi juga oleh sifat fisik tanah itu sendiri (Siregar et al., 2004). Tanaman kakao juga memerlukan pH tanah yang berkisar antara 6.0-7.0 (Goenadi & Hardjono 1985). Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Dilleniidae Ordo : Malvales Famili : Sterculiaceae Genus : Theobroma Spesies : Theobroma cacao L. Suhu lingkungan yang baik untuk kakao tumbuh adalah 18-32°C dengan suhu rata-rata tahunan 25°C. Suhu rata-rata bulanan terdingin tidak boleh kurang dari 15°C. Pengaruh suhu ini sangat erat hubungannya dengan sinar matahari, ketersediaan air, dan kelembaban udara. Jika suhu rendah maka akan menyebabkan pembungaan terlambat. Penurunan suhu di bawah 22°C bisa menyebabkan primordia bunga terhenti (Wachjar & Iskandar 1988). Kondisi pada suhu tinggi akan menyebabkan pertumbuhan pucuk terhambat, tetapi merangsang 6 pembentukan cabang sehingga mengakibatkan daun-daun tidak berkembang (Wood 1985). Salah satu sifat khusus dari daun kakao adalah adanya dua persendian (articulation) yang terletak di pangkal dan ujung tangkai daun. Persendian ini berperan pada pergerakan untuk menyesuaikan dengan arah datangnya sinar matahari. Bentuk helai daun bulat memanjang, ujung daun meruncing, dan pangkal daun runcing. Susunan tulang daun menyirip dan tulang daun menonjol ke permukaan bawah helai daun. Warna daun dewasa yaitu hijau tua. Panjang daun dewasa 30 cm dan lebarnya 10 cm. Permukaan daun mengkilap dan licin (PPKKI 2004). Kakao merupakan tanaman yang kaulifloral, yaitu bunga tumbuh dan berkembang dari bekas ketiak daun pada batang dan cabang (PPKKI 2004). Tanaman ini mempunyai bunga yang berwarna merah muda sampai putih, reguler, hermafrodit, sebuah ovari superior yang merupakan gabungan dari lima karpel, memiliki lima sepal, lima petal, dan 10 stamen (Tjasadiharja 1987). Menurut Siregar et al., (2004) kelopak daun bunga kakao berwarna putih dan kadangkadang makin ke ujung warna kelopak terlihat ungu kemerahan. Mahkota bunga bentuknya seperti cawan, mempunyai panjang 8-9 mm dan berwarna putih kekuningan atau putih kemerahan. Bunga kakao akan muncul secara bergerombol pada bantalan bunga. Bantalan bunga yaitu jaringan yang menebal pada ketiak bekas menempelnya tangkai daun. Waktu yang diperlukan dari munculnya bakal bunga sampai mekar yaitu 30 hari. Bila saat mekar bunga tidak mengalami penyerbukan maka bunga akan gugur (Tjasadiharja 1987). Pembungaan kakao dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu umur tanaman, status nutrisi, korelasi internal, aktivitas kambium, naungan, suhu, distribusi hujan dan kelembapan. Warna buah kakao ketika muda yaitu hijau agak putih dan berwarna kuning jika masak. Selain itu ada juga jenis lain yaitu berwarna merah ketika muda dan berwarna jingga ketika masak. Buah akan masak setelah berumur enam bulan. Biji tersusun dalam lima baris mengelilingi poros buah. Jumlahnya beragam yaitu 20-50 butir per buah. Pembuahan kakao dipengaruhi oleh beberapa hal yaitu jumlah bunga yang tumbuh, persentase bunga yang diserbuki, persentase bunga yang dibuahi, persentase buah muda yang mampu berkembang sampai 7 masak (PPKKI 2004). Bentuk bunga kakao dapat dilihat pada Gambar 1 (Hinsley 2010). Se Pe Sta Std Pi Gambar 1 Bagian bunga kakao, stamen (Sta), sepal (Se), petal (Pe), pistil (Pi) dan staminod (Std). Gen Pembungaan Perkembangan organ bunga sangat penting pada proses pembungaan. Pembentukan organ ini dikendalikan oleh gen-gen yang berperan pada proses tersebut. Pengembangan gen pada bunga dapat diisyaratkan menjadi model ABC. Model ini mengkoordinasikan ekspresi dan fungsi dari gen menjadi transkripsi A, B dan C. Aktivitas transkripsi tipe A disandikan oleh gen APETALA1 (AP1) dan APETALA2 (AP2) yang mengontrol pembentukan sepal dan petal. Tipe B yang disandikan oleh gen APETALA3 (AP3) dan APETALA1 (AP1) mengontrol pembentukan petal dan stamen. Sedangkan tipe C disandikan oleh gen AGAMOUS (AG) yang mengontrol perkembangan stamen dan karpel (Pinero & Couplan 1998). Gen AGAMOUS merupakan keluarga dari gen MADS-Box (MCM1, AGAMOUS, DEFICIENS, and SRF) yang diperlukan dalam pembentukan identitas bunga (Bao et al., 2004). Gen yang berperan dalam mengontrol pembentukan stamen dan karpel ini, ekspresinya dapat ditekan oleh gen lain yaitu gen BELLRINGER (BELL) sehingga pengaruh dari gen AG dalam pembentukan meristem bunga dan inflorensia menjadi terhambat (Bao et al., 2004). Menurut Jordan (2006) ekspresi AG bisa ditekan oleh gen lain yaitu gen APETALA2 (AP2), 8 LEUNIG (LUG), SEUSS (SEU), STERILE APETALA (SAP), CURLY LEAF (CLF), INCURVATA2 (ICU2) dan BELLRINGER (BELL). Chaidamsari (2005) melaporkan bahwa kloning dari cDNA encoding TcAG (homolog AG dari kokoa) telah diekspresikan pada stamen dan ovari, yang dibandingkan dengan AG pada Arabidopsis. Gen TcAG selalu diekspresikan pada dinding buah (sebagian kecil) selama perkembangan. Kakao homolog dari AG pada Arabidopsis (TcAG) berpengaruh pada pembentukan kelopak bagian dalam dari organ pembungaan, staminode, stamen dan ovari. Pada tanaman yang lain, TcAG hanya terekspresi pada pembungaan dan predominan pada staminode, stamen dan ovari. Homolog gen pembungaan kakao pada Arabidopsis berpengaruh baik pada koregulasi inisiasi pembungaan dan berpengaruh juga pada determinasi identitas dari sepal dan petal (Chaidamsari 2005). Gen LFY diketahui mampu mengaktifkan ekspresi dari gen kelas A, kelas B dan kelas C (Gambar 2) (Jordan 2006). Model ekspresi dari gen A, B dan C diperlihatkan pada Gambar 3. Ekspresi AG diketahui diaktifkan oleh LFY dan protein LFY yang berperan untuk mengikat in vitro pada intron kedua AG. Pembatasan berikutnya dari transkripsi AG ke pada perkembangan bunga adalah hasil dari kombinasi aktivitas LFY dan WUSCHEL (WUS). Gen WUS mengkodekan homeodomain faktor transkripsi yang diperlukan untuk menentukan proliferasi seluler dalam meristem. Keberadaan LFY dinyatakan kuat dalam organ bunga muda primordia dan meristem bunga. Gen LFY juga terlibat dalam aktivasi ekspresi AP1 dan CAL. Gen LFY memiliki efek yang kuat pada identitas meristem karena mengaktifkan transkripsi dari rangkaian gen lain (Glover 2007). Jenis gen kakao lain yang mengkode faktor transkripsi dari kelas MADSbox yang diperkirakan mempengaruhi regulasi waktu pembungaan dan pembentukan bunga yaitu Theobroma cacao L. APETALA1 (TcAP1) (Chaidamsari 2005). Gen TcAP1 diekspresikan pada pembungaan dan dalam bunga predominan terekspresi pada sepal dan petal pada level yang rendah pada organ pembungaan yang lain. Menurut Parcy et al., (1998) protein LFY juga diketahui mampu mengaktifkan ekspresi dari gen AP1 dengan cara mengikat sekuen promoter AP1. 9 Gambar 2 Aktivasi gen kelas A,B dan C oleh gen LFY (Jordan 2006). Gambar 3 Model ABC dari perkembangan pembungaan Arabidopsis, fungsi gen kelas A, B dan C yang mempengaruhi bentuk dari meristem bunga (Se: sepal, Pe: petal, St: stamen, Ca: karpel). 10 Promoter DNA Promoter adalah bagian gen yang berfungsi sebagai pengatur proses ekspresi genetik (transkripsi) bagian struktural. Promoter ini bagian yang akan dikenali pertama kali oleh enzim RNA polimerase dan protein regulator sebelum proses transkripsi dimulai (Yuwono 2005). Daerah promoter merupakan daerah awal terjadinya sintesis RNA dan proses sintesis ini berlangsung hingga bagian akhir sekuen. Daerah promoter terdiri dari daerah kecil dengan urutan basa-N yang pada umumnya mempunyai urutan yang tetap atau sering disebut TATAbox. TATA-box merupakan bagian DNA yang banyak mengandung basa timin dan adenin dan berada pada bagian upstream dan dilokasikan pada -10 dan -35 bp upstream (Murray et al., 2003). Sekuens pada kotak TATA menentukan titik inisiasi transkripsi secara tepat. Penghilangan kotak TATA pada β-globin menyebabkan penurunan transkripsi secara invitro. Pengubahan sekuens TATA menjadi TAGA atau TAAA akan menghilangkan proses transkripsi (Yuwono 2005). Kotak TATA mempunyai peranan yang penting dalam proses transkripsi, namun ada banyak gen yang tidak mempunyai kotak TATA. Gen yang tidak mempunyai kotak TATA dapat dikelompokkan menjadi dua kelas yaitu gen house keeping dan gen-gen yang diatur ekspresinya berdasarkan atas perkembangan organisme. Gen house keeping yaitu gen-gen yang diekspresikan secara konstitutif pada semua sel karena gen ini diperlukan dalam metabolisme utama. Gen-gen yang diatur ekspresinya berdasarkan atas perkembangan organisme yaitu gen-gen homeotik yang mengatur perkembangan lalat buah atau gen-gen yang terlibat di dalam perkembangan sistem kekebalan pada mamalia (Yuwono 2005). Posisi promoter dalam suatu gen untuk lebih jelasnya dapat dilihat pada Gambar 4 (Hunter 2011). Promoter mempunyai aktivitas spesifik pada jaringan atau organ spesifik. Salah satu aktivitas tersebut yaitu dalam hal pengkontrolan ekspresi toksin pada jaringan atau organ spesifik (Chaidamsari 2005). 11 Gambar 4 Posisi promoter dalam suatu gen (Hunter 2011). Tanaman Tembakau Tembakau berkembang luas pada berbagai bagian dunia. Tembakau mempunyai stuktur batang tegak, kuat dan berkayu. Tinggi tanaman bervarisasi tergantung pada varietasnya. Jika kondisi lingkungan baik, maka tingginya bisa mencapai 2 meter. Batang tembakau tidak bercabang, tetapi pada saat berbunga di bagian atas ketiak daun akan tumbuh tunas-tunas lateral. Tunas-tunas tersebut akan tumbuh menjadi sirung atau sulang. Jika batang tembakau rebah, maka tunas-tunas lateral tersebut akan berpotensi tumbuh menjadi sulang. Varietas yang banyak sulang tidak disukai karena pertumbuhannya akan mengurangi zat-zat hara dan nutrisi yang diperlukan untuk pertumbuhan daun (Suwarso 1999). Tembakau merupakan jenis tanaman dikotil yang berakar tunggang. Bentuk daun dipengaruhi oleh posisi di batang. Daun bawah bentuknya lebih bulat dibandingkan daun-daun di atasnya. Daun pucuk bentuknya lebih runcing. Daun ditopang oleh ibu tulang daun dengan cabang-cabang yang berbentuk menyirip. Permukaan atas dan bawah daun terdapat stomata dan bulu-bulu kelenjer (trikom). Stomata lebih banyak terdapat di permukaan bawah daun (Suwarso 1999). Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) 12 Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Asteridae Ordo : Solanales Famili : Solanaceae (suku terung-terungan) Genus : Nicotiana Spesies : Nicotiana tabacum L. Spesies N. Tabacum L. pada umumnya merupakan tanaman hari netral. Waktu pembungaan tidak dipengaruhi oleh lamanya waktu penyinaran matahari. Tanaman akan membentuk karangan bunga di ujung batang pada fase generatif tanaman. Bunga dewasa mempunyai mahkota berbentuk terompet sepanjang 4-5 cm yang mempunyai lima lekuk di bagian tepinya. Mahkota bunga berwarna merah muda pada bagian atas dan berwarna putih pada bagian bawahnya. Beberapa saat sebelum bunga mekar, tepung sari telah masak dan kepala putik reseptif sehingga siap menerima tepung sari. Bila penyerbukan berhasil, pembuahan akan terjadi sekitar 36 jam kemudian. Buah akan mulai masak 3-4 minggu setelah terjadi pembuahan (Suwarso 1999). Tanaman tembakau mempunyai kecendrungan yang kuat untuk melakukan proses penyerbukan sendiri. Hal ini menjadi salah satu alasan dipilihnya tanaman tembakau sebagai tanaman untuk transformasi. Selain itu pertumbuhan dari tanaman tembakau sangat mudah, proses pembungaan yang cepat dan pembungaan yang tidak dipengaruhi oleh penyinaran (Bock 2007). Transformasi Tanaman Transformasi tanaman adalah penyisipan materi genetik asing yang masuk melalui dinding sel tanaman. Teknik transformasi ke tanaman ada banyak macam tetapi secara garis besar dapat dibagi ke dua kelompok yaitu menggunakan bakteri Agrobacterium tumifaciens dan transformasi secara langsung. Transformasi secara langsung antara lain mikroinjenksi, fusi steroplas, fusi liposom, imbisi embrio, injeksi tabung putik, transformasi protoplas, dan penempakan DNA dengan 13 pendekatan biolistik. Teknik ini dinamakan teknik transformasi secara langsung karena DNA diintroduksi tanpa menggunakan perantara (Loedin 1994). Transformasi menggunakan Agrobacterium tumifaciens merupakan metode transformasi yang paling sering digunakan. Bakteri gram negatif ini menginfeksi pada tanaman dikotil yang menyebabkan penyakit tumor batang (crown gall). Kemampuan ini didukung oleh keberadaan plasmid Ti pada bakteri. Ketika Agrobacterium tumifaciens menginfeksi tanaman, bagian dari molekul DNA berupa transferred DNA (T-DNA) akan terintegrasi pada DNA kromosom tanaman. sifat unik ini memungkinkan plasmid Ti menjaid alat transpor dari gen lain dengan menyisipkan gen asing tersebut pada T-DNA. Kemudian dengan teknik transformasi Agrobacterium tumifaciens diinfeksikan pada sel tanaman. Teknik ini telah berhasil diterapkan pada tanaman tembakau, tomat, pepaya, pisang, kentang, dan tanaman dikotil lainnya (Zupan et al., 2000). Keuntungan dari teknik ini adalah gen yang terintegrasi umumnya hanya satu kopi karena disisipkan pada T-DNA (Loedin 1994). Plasmid yang digunakan untuk transformasi dinamakan juga dengan vektor. Vektor inilah yang membantu untuk transfer gen ke tanaman. Selain gen target terdapat pula gen reporter. Gen reporter yang biasa digunakan adalah gen Gus penyandi β-glukuronidase, synthetic green fluorescent protein (sGFP), luciferase (LUC), enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), dan enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) (Nakagawa 2007). Hasil positif Gus adalah terdapatnya warna biru sedangkan GFP terdapatnya warna hijau. Analisis yang tercepat untuk menunjukkan gen terintegrasi secara stabil pada tanaman adalah dengan analisis histokimia enzim gen penanda (gen reporter) dan analisis PCR (Loedin 1994). Kultur Jaringan Kultur jaringan adalah metode untuk mengisolasi bagian tanaman berupa sekelompok sel atau jaringan yang ditumbuhkan pada kondisi aseptik, sehingga bagian tanaman tersebut dapat memperbanyak diri menjadi tanaman yang lengkap membentuk daun, batang dan akar. Teknik kultur jaringan ini memanfaatkan perbanyakan secara vegetatif (Hameed et al., 2006). 14 Sebagian besar metode kultur jaringan menggunakan media garam mineral Murashige & Skoog (MS) sebagai media tanam yang diperkaya dengan sukrosa. Kultur jaringan disebut juga sebagai kultur in vitro. Tanaman yang pertumbuhannya dilakukan secara in vitro termasuk golongan heterotrof (Miller & Chandler 1990). Metode perbanyakan tanaman secara in vitro dapat dilakukan melalui perbanyakan tunas dari mata tunas apikal, melalui pembentukan tunas adventif, dan embriogenesis somatik. Jaringan yang digunakan sebagai eksplan dalam kultur jaringan yaitu jaringan muda yang belum mengalami diferensiasi dan masih aktif membelah sehingga memiliki kemampuan regenerasi yang tinggi. Jaringan tipe pertama ini biasa ditemukan pada tunas apikal, tunas aksiler, bagian tepi daun, ujung akar, maupun kambium batang. Tipe jaringan lain yang digunakan yaitu jaringan parenkim. Jaringan parenkim yaitu jaringan penyusun tanaman muda yang sudah mengalami diferensiasi dan menjalankan fungsinya. Contoh jaringan tersebut yaitu jaringan daun yang telah mampu melakukan aktivitas fotosintesis dan jaringan batang atau akar yang berfungsi sebagai tempat cadangan makanan (Evert et al., 2006). Tanaman yang spesifik membutuhkan media tanam yang spesifik pula (Miller & Chandler 1990). Tanaman kentang yang dikulturkan pada media MS dengan dua kali unsur makro yang ditambah 60 g/L sukrosa dapat meningkatkan vigor tanaman akan tetapi tanaman akan menjadi lebih pendek, jumlah daun menjadi sedikit, diameter menjadi lebih sempit, dan percabangan lebih banyak (Purwito 1999). Menurut Hapsoro (1999) peningkatan konsentrasi sukrosa menyebabkan penurunan jumlah tunas dan panjang tunas pada tanaman famili. Nutrien anorganik ditambahkan pada tanaman kultur dalam bentuk garam mineral. Bahan mineral yang diberikan tersebut dapat berupa kation dan anion. Seperti contoh kalsium, magnesium dan kalium diserap oleh akar tanaman kultur jaringan dalam bentuk kation Ca2+, Mg2+ and K+. Nitrogen diserap dalam bentuk anion NO3 dan kation NH4+. Tanaman kultur jaringan juga menyerap fosfat dalam bentuk ion HPO42- and H2PO4- dan menyerap sulfat dalam bentuk ion SO42-. Sistem penyerapan pada kultur jaringan dipengaruhi oleh konsentrasi unsur lainnya, pH, suhu, dan status biokimia atau fisiologis tanaman jaringan. Faktor-faktor ini dapat dikendalikan oleh akar dalam menentukan keseimbangan 15 ioniknya. Misalnya, Mg2+ bersaing dengan + kation lain untuk 2+ pengambilannya. Jika kondisi K tinggi maka konsentrasi Ca , Mg proses 2+ akan mengalami kekurangan. Penyerapan aktif fosfat terjadi jika pH larutan menjadi sedikit basa ketika ion (H2PO4) - berubah menjadi (HPO4)2 -. Amonium lebih mudah digunakan dibandingkan nitrat pada suhu rendah. Serapan amonium ke dalam sel tanaman ditingkatkan pada kondisi tingkat karbohidrat yang tinggi di dalam sel. Kalsium tidak diserap secara efisien dan konsentrasi dalam jaringan tanaman cenderung proporsional dengan yang ada di tanah (George 1996). Tanaman relatif tidak sensitif terhadap ion sulfat. Jika konsentrasi fosfat terlarut tinggi maka bisa menekan pertumbuhan. Hal ini karena melalui proses kompetitif yang mengurangi penyerapan unsur-unsur minor Zn, Fe dan Cu. Proses penyerapan mineral pada tanaman kultur jaringan bisa terjadi melalui stomata daun dan dilanjutkan ke pembuluh xilem. Ketika eksplan yang pertama ditempatkan pada media, terdapat kebocoran ion dari sel yang rusak, terutama kation (Na+, Ca2+, K+, Mg2+) untuk 1-2 hari pertama, sehingga konsentrasi dalam jaringan tanaman benar-benar menurun. Penyerapan aktif dimulai dan konsentrasi internal sel perlahan-lahan naik. Fosfat dan nitrogen (terutama amonium) diserap lebih cepat dari ion yang lain (George 1996). 16 17 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor. Penelitian ini berlangsung dari bulan Juni 2011 hingga Februari 2012. Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan adalah cawan petri, gelas piala, tabung sentrifus, sentrifus Beckman Allegra 64R, sentrifus effendorf 5417R, tabung effendorf, pipet mikro, tips, spektrofotometer UV-VIS Beckman, mortar, penangas air, autoklaf, pipet tetes, stirer, pipet Mohr, labu Erlenmeyer, oven, pH meter, alat elektroforesis (sisir, cetakan agar, bak elektroforesis, adaptor 100 Volt, dan UV T2201), cawan petri, speed vac, neraca analitik, shaker incubator, laminar air flow cabinet dan alat PCR (Biometra T-Personal). Bahan-bahan yang digunakan adalah bufer ekstraksi (1 M Tris-Hcl, 0,5 M EDTA, 5 M NaCl, 10% CTAB, dan akuades steril), 1% β-merkaptoetanol, isopropanol, CH3COONa, etanol absolut, PVPP, nitrogen cair, kultur daun tembakau steril, gene specific primer (GSP) gen GFP yaitu GFP forward (TCACTGGAGTGGTCCCAGTT) (CCATGTGTAATCCTAGCAGC), dan dNTP, Taq GFP polymerase reverse recombinant invitrogen, gel agarose, loading dye, etidium bromida, Agrobacterium tumifaciens AGL0, tris borat EDTA (TBE), media LB cair, rifamisin, kanamisin, asetosiringon, sefotaksim, media MS padat (A, B, C, D, E, dan F), benzil amino purin (BAP), vitamin 10mL/L, agar kultur jaringan, dan sukrosa. Metode Penelitian Transformasi ke tanaman tembakau Penyisipan genetik promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG ke dalam sel tanaman tembakau dilakukan dengan teknik cakram daun (leaf disk) yang dimodifikasi. Bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 ditumbuhkan dalam 18 media cair LB yang mengandung kanamisin 50 ppm dan rifamisin 100 ppm selama 24-48 jam pada suhu 28°C dengan pengocokan 150 rpm dalam keadaan gelap. Setelah diencerkan dengan media MS cair, Agrobacterium tumifaciens AGL0 tersebut dikulturkan kembali selama sekitar 0,5-1 jam dan diukur nilai optical density (OD) hingga mencapai 0,1-0,3. Pengukuran nilai OD dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Potongan-potongan eksplan daun tembakau, ukuran cakram diameter 0,5-1,0 cm diinkubasi selama 15 menit dengan 1/10 volume kultur cair Agrobacterium tersebut. Ko-kultivasi pada media MS padat yang mengandung asetosiringon 100 ppm dilakukan selama 1 hari. Setelah itu dipindahkan ke media yang mengandung sefotaksim 250 ppm selama 5 hari. Seleksi tanaman transforman dilakukan pada media MS padat yang mengandung antibiotika kanamisin 50 ppm dan sefotaksim 250 ppm (Samanhudi 2006). Kultur Jaringan Kultur jaringan untuk regenerasi planlet tembakau dilakukan menggunakan metode standar melalui organogenesis. Potongan eksplan daun steril dikulturkan pada media MS padat yang mengandung BAP 0.5 ppm. Kultur eksplan diinkubasi pada suhu 26-28°C. Sub kultur ke media segar dilakukan setiap 4-6 minggu sekali. Kultur eksplan transgenik dilakukan dengan metode dan kondisi yang sama dengan non-transgenik kecuali komposisi media. Seleksi dan kultur eksplan transgenik dalam media tumbuhnya ditambahkan antibiotik penyeleksi yang sesuai yaitu kanamisin 50 ppm. Pada masa tumbuh ini morfologi tanaman tembakau diamati. Tanaman tembakau yang mengandung promoter gen target akan tumbuh pada media seleksi kanamisin dan yang tidak mengandung promoter gen target tanaman ini akan mati (Samanhudi 2006). Isolasi DNA tembakau Isolasi DNA daun tembakau mengacu kepada metode Orozco et al., (1994) yang dimodifikasi. Daun tembakau sebanyak 0,1-0,2 gram digerus hingga halus dengan nitrogen cair dan ditambah PVPP. Bufer ekstraksi hangat ditambahkan sebanyak 1 mL (1 M Tris-HCl, 0,5 M EDTA, 5 M NaCl, 10% 19 CTAB, dan akuades steril). Sebanyak 10 μL β-merkaptoetanol ditambahkan dan larutan daun tembakau divortex. Larutan diinkubasi pada suhu 65ºC selama 30 menit. Kemudian diekstrak dengan kloroform : isoamil alkohol (24:1). Sampel selanjutnya disentrifugasi pada 11000 selama 10 menit. Lapisan atas (supernatan) diambil dan dipindahkan ke dalam tabung Effendorf baru. Kemudian sampel diekstrak kembali dengan kloroform : isoamil alkohol (24:1). Sampel selanjutnya disentrifugasi kembali pada 11000 selama 10 menit. Pelet dikeringkan dengan membalikkan tube secara hati-hati. Kemudian pelet ditambahkan bufer TE sebanyak 500 μL dan natrium asetat 1/10 volume pH (5,2) serta etanol absolut sebanyak 2 volume. Larutan diinkubasi selama 30 menit di freezer. Larutan disentrifus pada 12000 rpm selama 10 menit dan 4ºC. Endapan dicuci menggunakan etanol 70% dingin dan dikeringkan dengan sentrifugasi pada 8000 rpm selama 5 menit dan 4ºC. Sampel dilarutkan dalam 50 μL ddH2O. Kualitas DNA diuji dengan elektroforesis dengan konsentrasi agar 1%. DNA genomik tembakau yang berhasil diisolasi kemudian diinjeksikan pada agar sebanyak 2 μL yang dilarutkan pada 1 μL larutan loading dye. Bufer yang digunakan pada elektroforesis yaitu bufer TBE (Tris Borat EDTA). Pita DNA divisualisasikan menggunakan sinar UV dan difoto. PCR PCR dilakukan untuk mengetahui planlet transgenik yang digenerasikan tersebut berhasil atau tidak. Campuran pereaksi PCR mengandung DNA templat sebanyak 1-10 ng, keempat dNTP masing-masing 0.2 μM, sepasang primer NPTII masing-masing sebanyak 1 μL dan DNA Taq polymerase 0,5 μL. Reaksi dilakukan dengan volume 25 μl, dengan program PCR sebagai berikut yaitu denaturasi pada suhu 94°C selama 30 detik, penempelan pada suhu 50°C selama 30 detik, perbanyakan pada suhu 72°C selama 2 menit, dengan pengulangan sebanyak 35 siklus. Hasil PCR diperiksa menggunakan gel agarose dengan konsentrasi 1%. Amplikon hasil PCR kemudian diinjeksikan pada agar sebanyak 5 μL yang dilarutkan pada 1 μL larutan loading dye. Bufer yang digunakan pada elektroforesis yaitu bufer TBE (Tris Borat EDTA). Pita DNA divisualisasikan menggunakan sinar UV dan difoto. 20 Variasi media sukrosa Variasi media mengacu pada metode Balzquez et al., (1998) yang dimodifikasi. Variasi media sukrosa dilakukan dengan menanam tanaman tembakau transgenik TcLFY dan TcAG ke tiga jenis media sukrosa dengan konsentrasi 0%, 0,5% dan 4%. Daun yang terdapat pada satu tanaman harus berjumlah minimal 2 pasang daun. Tanaman tembakau diamati warna dan bentuk daunnya pada hari ke 3 dan hari ke 7. 21 HASIL DAN PEMBAHASAN Konsentrasi kanamisin Penggunaan kanamisin sebagai seleksi tanaman telah banyak dilakukan pada proses transformasi. Menurut Makful (2004) kanamisin sangat baik digunakan sebagai seleksi tanaman transforman karena kanamisin mudah dilarutkan, tidak terpengaruh pH, tidak mahal dan stabil. Sebelum melakukan transformasi tanaman, perlu dilakukan optimasi konsentrasi kanamisin terlebih dahulu. Optimasi konsentrasi kanamisin untuk penelitian ini telah dilakukan sebelumnya dengan menggunakan beberapa konsentrasi kanamisin. Variasi konsentrasi yang dilakukan yaitu 0, 50, 100, 150 dan 200 ppm. Hasil dari optimasi kanamisin yang dilakukan diperoleh hasil bahwa konsentrasi optimum yang diperoleh yaitu 50 ppm (mg/L) untuk menyeleksi transforman karena konsentrasi tersebut telah mampu menghambat pertumbuhan tanaman tembakau yang bukan transforman. Oleh karena itu, pada penelitian ini digunakan kanamisin pada konsentrasi 50 mg/L. Hal yang sama dilakukan oleh Dobhal et al., (2010) yang melakukan transformasi menggunakan tanaman tembakau dengan promoter 35S dan gen reporter GUS dengan konsentrasi akhir kanamisin yang digunakan yaitu 50 mg/L. Sebanyak 3,9% tanaman tembakau telah berhasil ditransformasikan dan melewati masa seleksi media kanamisin menggunakan vektor pCAMBIA 2301 dan menggunakan gen reporter GUS pada konsentrasi akhir kanamisin 50 mg/L (Dobhal et al., 2010). Transfomasi promoter 35S dan gen reporter GUS ke tanaman tembakau yang dilakukan Chaidamsari (1999) pun menggunakan konsentrasi kanamisin 50 mg/L. Optimasi kanamisin perlu dilakukan untuk mengetahui kondisi tanaman yang akan ditransformasi. Kondisi ini berupa konsentrasi kanamisin yang mampu membunuh tanaman. Tanaman yang berbeda mempunyai optimasi kanamisin yang berbeda (Bhau & Wakhlu 2001). Seperti halnya optimasi kanamisin tanaman tomat yang dilakukan oleh Yelli (2009), setelah dilakukan variasi konsentrasi dari kanamisin diperoleh kanamisin optimum dari tomat yaitu 50 mg/L. Makful (2004) melaporkan, kanamisin optimum tanaman pepaya untuk transformasi gen 1- 22 aminosiklopropan-1-asam karboksilat oksidase adalah 150 mg/L. Konsentrasi yang digunakan untuk seleksi harus menggunakan kadar antibiotik terendah yang menghasilkan tekanan seleksi yang optimal. Kanamisin termasuk ke dalam antibiotik golongan aminoglikosida (Gambar 5). Kanamisin mempengaruhi kerja dari 30S subunit ribosom yang menyebabkan mutasi dan mencegah translasi RNA. Mutasi ini menyebabkan kesalahan pada pembacaan kodon CAT menjadi kodon ATG yang dibaca oleh aminoasill tRNA (aa-tRNA). Kesalahan ini akan berpengaruh terhadap pengenalan kodon dan anti-kodon (Ahsen et al., 1991). Aminoasil tRNA akan membawa asam amino yang berbeda karena antikodon aa-tRNA yang berbeda (Yuwono 2005). Asam amino yang berbeda akan mempengaruhi sintesis protein (Makful 2004). Tanaman yang tidak membawa konstruk promoter dan gen ketahanan terhadap kanamisin (nptII) maka tanaman ini akan mati karena induksi dengan kanamisin akan mempengaruhi sintesis protein di dalam selnya. Gambar 5 Struktur kanamisin (Helmenstine 2012). 23 Transformasi konstruk ke tanaman tembakau (Nicotiana tabacum L.) Konstruksi promoter gen reproduktif LEAFY dari Theobroma cacao L. (TcLFY) dan promoter gen reproduktif AGAMOUS dari Theobroma cacao L. (TcAG) pada vektor ekspresi pGateway B telah dilakukan dengan metode Gateway. Promoter TcLFY sebelumnya telah berhasil diisolasi dengan panjang 1650 bp. Metode yang digunakan untuk mengisolasi promoter TcLFY yaitu dengan metode program Polymerase Chain Reaction (PCR) genome walkingTM (Santoso 2010). Promoter TcAG juga telah berhasil diisolasi dengan panjang 1200 bp. Metode yang digunakan untuk mengisolasi promoter ini yaitu dengan metode Thermal Asymmetric Interlaced Polymerase Chain Reaction (TAIL PCR) (Trizana 2010). Kedua vektor pGateway B yang membawa fragmen promoter TcLFY dan TcAG ini digunakan untuk transformasi ke bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 menggunakan metode kejut dingin. Kemudian diperoleh dua Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa vektor pGateway B TcLFY dan TcAG. Setelah berhasil ditransformasikan ke bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 promoter ini kemudian diuji untuk mengetahui fungsinya pada tanaman model tembakau (Nicotiana tabacum L.). Kedua konstruk ini selanjutnya disisipkan ke dalam tanaman tembakau menggunakan metode leaf disk. Konstruksi vektor pGWB yang digunakan mengandung selectable marker gene yaitu gen neomycin phosphotransferase II (npt II) (Gambar 6). Gen npt II mengkodekan ketahanan terhadap antibiotika kanamisin. Keberadaan gen ini digunakan sebagai seleksi bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 pada saat kultur dan seleksi tanaman tembakau yang terinsersi fragmen promoter TcLFY dan TcAG yang diberikan pada media pertumbuhan. Promoter TcLFY/TcAG Gen reporter GFP Gambar 6 Posisi promoter dan gen reporter GFP pada vektor pGWB serta gen seleksi kanamisin nptII. 24 Transformasi tanaman tembakau dilakukan untuk menginsersikan promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG pada genom tembakau. Transformasi pada penelitian dilakukan menggunakan bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa promoter TcLFY dan promoter TcAG. Sebelum ditransformasi bakteri ini dikulturkan selama 2 hari dalam keadaan gelap pada suhu 28ºC menggunakan antibiotik kanamisin dan rifamisin. Setelah 2 hari diinkubasi terjadi perubahan warna pada media kultur. Perubahan warna yang terjadi yaitu dari warna kuning jernih menjadi warna kuning keruh (Gambar 7). Perubahan warna ini mengindikasikan bahwa bakteri yang dikulturkan tumbuh dan bisa digunakan untuk proses transformasi ke tanaman tembakau. Kanamisin digunakan untuk seleksi bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa vektor pGateway B. Pada vektor ini terdapat gen ketahanan terhadap kanamisin (nptII). Sedangkan rifamisin digunakan untuk membunuh bakteri selain bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0. (a) (b) Gambar 7 Kondisi kultur bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa konstruk promoter TcLFY dan promoter TcAG (a) hari ke 0 (b) setelah 2 hari inkubasi. Pada proses transformasi, nilai optical density (OD) juga harus diperhatikan. Nilai OD600 Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa konstruk promoter TcLFY yang diperoleh yaitu 0,286. Nilai OD600 Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa konstruk promoter TcAG yang diperoleh yaitu 0,243 (Tabel 1). Nilai OD600 yang disarankan untuk proses ini yaitu sekitar 0,1-0,3 (Dobhal et al., 2010). Jika nilai OD600 diatas 0,3 maka akan terjadi penumpukkan biomassa bakteri dan proses transformasi akan terganggu. 25 Tabel 1 Nilai OD Agrobacterium tumifaciens AGL0 dari kedua konstruk yang diukur pada panjang gelombang 600 nm Agrobacterium tumifaciens AGL0 Nilai OD konstruk promoter TcLFY 0,286 konstruk promoter TcAG 0,243 Sebanyak 50 eksplan tanaman tembakau ditransformasikan dengan ukuran 1x1 cm2 untuk setiap eksplan pada media MS dan penambahan asetosiringon. Penambahan asetosiringon ke dalam media berperan sebagai senyawa fenol yang dapat mempermudah proses transformasi dan infeksi bakteri Agrobacterium tumefaciens AGL0. Infeksi ini dilakukan dengan menginduksi gen Vir pada bakteri Agrobacterium tumefaciens AGL0 yang mentransfer T-DNA beserta konstruk promoter dari bakteri ke dalam sel (Gambar 8). Gambar 8 Mekanisme transformasi promoter TcLFY dan TcAG dari Agrobacterium tumifaciens AGL0 ke tanaman tembakau (sinyal yang berwarna hijau berupa senyawa fenol). 26 Bakteri Agrobacterium tumifaciens merupakan bakteri fitopatogen yang menyerang tanaman dikotil dan mampu membentuk tumor. Tumor ini digunakan bakteri sebagai penghasil karbon untuk sumber makanannya. Pada proses infeksi ini, bakteri mampu mentransfer potongan DNA ke dalam genom tanaman yang dikenal dengan istilah T-DNA (Rahmawati 2006). Sinyal yang dihasilkan dari luka pada potongan eksplan berupa senyawa fenol dan penambahan asetosiringon pada media merangsang induksi gen Vir. Komponen genetik yang terlibat dalam proses pembentukan tumor yaitu gen virulen kromosom (chromosomal virulence disingkat Chv), gen virulen (Vir) dan daerah T-DNA yang juga terletak pada plasmid. Gen Chv yang terdapat pada kromosom Agrobacterium tumifaciens berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman. Gen virulen (Vir) yang terdapat dalam plasmid Ti berperan dalam menginduksi transfer dan integrasi T-DNA. Pada daerah T-DNA inilah promoter konstruk TcLFY atau TcAG berada. Selain konstruk promoter, gen seleksi nptII juga berada pada daerah T-DNA ini (Rahmawati 2006). Mekanisme masuknya T-DNA ke sel tanaman dari bakteri Agrobacterium dilakukan dengan bantuan tipe IV secretion system (T4SS). T4SS merupakan sistem transport membran pada proses konyugasi bakteri. Asetosiringon yang merangsang gen Vir membantu dalam proses pemindahan T-DNA ini. Salah satu gen Vir yang berperan yaitu gen VirD2. Gen VirD2 akan mengikat sekuen TDNA dan membantu untuk memindahkan T-DNA dari sel bakteri ke tanaman (Gambar 8). Gen VirD2 dan T-DNA dalam proses perpindahannya akan membentuk komplek nukleo protein. Komplek nukleo protein ini akan dilapisi oleh utas tunggal VirE2 binding protein menuju nukleus tanaman dan tergabung ke dalam genom tanaman (Zupan et al., 2000). Hal yang harus diperhatikan dalam melakukan proses transformasi yaitu teknik yang digunakan untuk menginfeksi eksplan tanaman dengan kultur bakteri Agrobacterium tumefaciens AGL0. Ketika memotong eksplan tanaman dari tanaman aslinya harus dilakukan secara perlahan menggunakan ujung dari pinset. Daun yang dipotong akan mengeluarkan senyawa fenol yang berfungsi untuk menarik bakteri Agrobacterium tumefaciens AGL0. Selain penambahan asetosiringon yang berfungsi sebagai senyawa fenol, tanaman pun memproduksi 27 senyawa fenol ketika luka saat pemotongan. Faktor lain yang menentukan keberhasilan transformasi khususnya transformasi melalui vektor Agrobacterium diantaranya adalah jenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi, genotip, jenis vektor, strain Agrobacterium, gen marker seleksi yang efisien, penambahan fitohormon selama ko-kultivasi, media ko-kultivasi, lamanya periode ko-kultivasi, penambahan asetosiringon dan waktu inokulasi. Regenerasi eksplan tembakau yang membawa kontruksi promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG Morfologi tanaman Tanaman tembakau yang telah berhasil ditransformasi kemudian dikokultivasi pada media asetosiringon pada keadaan gelap selama sehari dan dipindahkan ke media sefotaksim selama 4 hari. Menurut Chaidamsari (1999) waktu kokultivasi yang terlalu lama akan menyebabkan kontaminasi oleh bakteri Agrobaterium tumifaciens AGL0 dan mempengaruhi kesehatan eksplan. Eksplan tembakau yang telah diinkubasi pada media sefotaksim selama 4 hari telah menunjukkan perubahan dibandingkan pada eksplan tembakau pada saat dipotong. Pada saat eksplan tembakau dipotong, keadaan daun masih lemas seperti daun pada tanaman aslinya. Eksplan tembakau yang telah diinkubasi pada media sefotaksim selama 4 hari keadaan daun sudah mulai berubah yaitu sedikit keras, tebal dan ukuran daun yang mulai bertambah. Eksplan ini kemudian dipindahkan ke media seleksi kanamisin dan sefotaksim serta diamati pertumbuhannya. Pertumbuhan pada daun eksplan akan dimulai dengan terbentuknya inisiasi calon tunas daun. Tanaman tembakau yang tidak berhasil disisipi oleh konstruksi promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG maka pada media seleksi kanamisin tanaman tembakau ini akan mati. Proses transformasi ini menggunakan kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif adalah tanaman tembakau non-transgenik yang ditumbuhkan pada media tanpa kanamisin. Kontrol positif digunakan sebagai pembanding dengan tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY dan TcAG. Kontrol negatif 28 adalah tanaman tembakau yang non-transgenik yang ditumbuhkan pada media yang mengandung kanamisin. Kontrol negatif digunakan sebagai acuan tanaman tembakau yang tidak berhasil disisipi oleh promoter TcLFY dan TcAG. Kontrol negatif dan tanaman tembakau yang tidak berhasil disisipi oleh promoter TcLFY dan TcAG dalam pertumbuhannya akan mati karena tidak memiliki gen ketahanan terhadap kanamisin (Gambar 9a). (a) (c) (b) (d) Gambar 9 Proses inisiasi eksplan pada tanaman tembakau yang berumur 18 hari (a) tanaman kontrol negatif, (b) tanaman kontrol positif, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (d) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. 29 Inisiasi pada tanaman tembakau sudah dapat diamati dengan jelas pada hari ke-18 (Gambar 9). Jumlah inisiasi pada daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG memperlihatkan perbedaan. Inisiasi pada tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY memperlihatkan jumlah inisiasi yang lebih banyak bila dibandingkan dengan inisiasi pada tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG dan tanaman tembakau kontrol positif (Gambar 9d). Inisiasi pada tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG memperlihatkan jumlah inisiasi yang sedikit bila dibandingkan dengan tanaman tembakau kontrol positif (Tabel 2). Inisiasi ini diinduksi dengan bantuan senyawa benzil amino purin (BAP) pada media. BAP merupakan senyawa pengatur tumbuh sitokinin yang bersifat sintetik. BAP berperan dalam induksi pembelahan sel pada masa pertumbuhan dan pembentukan cabang-cabang tunas daun (Wakushima et al., 1996 ). Tanaman tembakau kontrol negatif belum menunjukkan morfologi adanya inisiasi tunas. Semua tanaman tembakau ditanam pada media seleksi kanamisin kecuali tanaman kontrol positif. Sebanyak 10% dari 50 eksplan tanaman tembakau untuk setiap promoter berhasil ditransformasikan dan melewati masa seleksi media kanamisin. Menurut Dobhal et al., (2010) Sebanyak 3,9% tanaman tembakau telah berhasil ditransformasikan dan melewati masa seleksi media kanamisin menggunakan vektor pCAMBIA 2301 dan menggunakan gen reporter GUS. Tabel 2 Perbedaan jumlah inisiasi pada tanaman tembakau Tanaman tembakau Kondisi jumlah inisiasi tunas Kontrol negatif Kontrol positif ++ Promoter TcAG + Promoter TcLFY +++ Keterangan : + = ada, sedikit, ++ = ada, banyak, +++ = ada, lebih banyak, - = tidak ada inisiasi 30 Eksplan awal (a) (b) Eksplan awal Eksplan awal (c) (d) Gambar 10 Perbedaan morfologi tanaman tembakau yang berumur 40 hari, (a) tanaman kontrol negatif, (b) tanaman kontrol positif, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (d) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. 31 Inisiasi yang muncul pada permukaan daun akan membentuk tunas yang selanjutnya akan membentuk daun kecil. Daun-daun kecil ini ini tumbuh menjadi besar sehingga dari satu eksplan akan memperoleh banyak tunas daun. Pada Gambar 10 terlihat bentuk daun yang berasal dari inisiasi tunas. Bentuk daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG menunjukkan perbedaan morfologi. Daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY mempunyai banyak tunas daun, bentuk struktur daun yang terlihat jelas, dan pertumbuhan yang cepat. Berbeda halnya dengan daun tembakau yang disisipi promoter gen TcAG yang memperlihatkan bentuk daun tidak sempurna dengan sedikit tunas daun bila dibandingkan dengan daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. Pertumbuhan tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG memiliki pertumbuhan yang lambat. Tanaman tembakau kontrol positif memperlihatkan bentuk daun yang sempurna. Bentuk daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY bila dibandingkan dengan daun kontrol juga terlihat ada perbedaan. Daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY membentuk tunas yang lebih banyak bila dibandingkan dengan tunas daun tanaman kontrol, namun daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY terlihat tidak sempurna seperti kontrol dan terdapat lekukan-lekukan pada daunnya. Tanaman yang diamati pada umur 40 hari ini belum dipisahkan dari eksplan indukannya (Gambar 10). Hal yang berbeda ditunjukkan oleh tanaman tembakau kontrol negatif. Tanaman tembakau kontrol negatif (Gambar 10a) memperlihatkan eksplan daun yang sebagian telah mati dan sebagian lagi masih hidup. Eksplan yang berwarna coklat menunjukkan tanaman tembakau yang telah mati. Eksplan daun tembakau yang berwarna hijau menunjukkan eksplan ini masih bertahan hidup walaupun tidak menunjukkan inisiasi tunas. Tunas daun tembakau yang tumbuh dipotong dari eksplan indukan dan dipindahkan ke media seleksi kanamisin baru sehingga diperoleh individu baru yang akan membentuk tanaman tembakau utuh. Sehingga dari satu ekplan tanaman tembakau bisa diperoleh sekitar 4-10 tanaman tembakau baru. Morfologi tanaman tembakau terus diamati pertumbuhan dan bentuk daunnya. Ketahanan 32 tanaman tembakau yang disisipi promoter terhadap media seleksi kanamisin juga diamati. (a) (b) (c) (d) Gambar 11 Menampilkan perbedaan morfologi tanaman tembakau yang berumur 2 bulan, (a) tanaman kontrol negatif, (b) tanaman kontrol positif, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (d) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. 33 Bentuk daun tembakau terlihat jelas perbedaannya dari daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG pada umur 2 bulan. Bentuk daun tembakau pada umur 2 bulan telah mampu menunjukkan jati diri dan morfologi dari pengaruh insersi promoter. Perbedaan morfologi pertumbuhan tanaman sangat terlihat jelas. Alasan lain untuk mengamati tanaman ini pada umur 2 bulan yaitu karena pada umur ini tanaman tembakau sudah melewati tahap seleksi dengan menggunakan media kanamisin. Ketahanan terhadap kanamisin ini mengindikasikan terjadinya ekspresi dari gen nptII yaitu gen ketahanan kanamisin. Jika terjadinya ekspresi nptII maka secara tidak langsung mengindikasikan bahwa sekuen promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG terdapat pada tanaman transforman. Menurut Setyodjatmiko (2000), tembakau yang berumur 2-3 bulan telah mempunyai ketahanan terhadap kanamisin. Tanaman tembakau yang tidak berhasil melewati proses transformasi dengan baik maka pada media yang mengandung kanamisin tanaman ini akan mati. Indikator yang digunakan yaitu tanaman tembakau kontrol negatif yang ditanam pada media yang mengandung kanamisin. Pada Gambar 11a, kontrol negatif yang berumur 2 bulan terlihat putih dan tidak bisa bertahan hidup. Pertumbuhan daun merupakan pertumbuhan yang banyak diamati karena menunjukkan morfologi yang terlihat ekstrim terutama untuk promoter gen TcAG. Tanaman kontrol menunjukkan bentuk daun yang normal. Tanaman yang terinsersi promoter gen TcAG menunjukkan bentuk daun yang tidak seragam, bentuk daun yang tidak sempurna dan pertumbuhan daunnya yang lambat (Gambar 11c). Tanaman yang terinsersi promoter gen TcLFY memiliki bentuk daun seperti tanaman kontrol, bentuk daun yang hampir seluruhnya sempurna dan pertumbuhan daun seperti tanaman kontrol positifnya (Gambar 11d). Bentuk daun tembakau dari ekspresi promoter gen TcAG yang tidak sempurna dan bentuk daun tembakau dari ekspresi promoter gen TcLFY seperti tanaman kontrol telah mengindikasikan bahwa promoter aktif dalam melakukan proses transkripsi. 34 (a) (b) (c) Gambar 12 Perbedaan morfologi tanaman tembakau yang berumur 4 bulan, (a) tanaman kontrol, (b) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG, (c) tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. Setelah berumur 4 bulan pertumbuhan dari ketiga tanaman terlihat jelas (Gambar 12). Tanaman tembakau kontrol positif memiliki bentuk daun yang normal dengan pertumbuhan daun yang normal. Tanaman tembakau yang terinsersi promoter gen TcAG memiliki bentuk daun yang berbeda dari tanaman tembakau kontrol positif, ukuran daun lebih kecil dan terlihat tidak normal, serta pertumbuhan daun yang lambat (Gambar 12b). Hal yang sama juga dilakukan oleh Yang et al., (2011) yang menunjukkan morfologi ukuran tanaman tembakau yang terinsersi second intron AG lebih pendek dari tanaman kontrol. Tanaman tembakau yang terinsersi promoter gen TcLFY memiliki bentuk daun yang sedikit berbeda dari tanaman kontrol tetapi memperlihatkan bentuk daun mendekati tanaman kontrol, dan pertumbuhan daun yang cepat (Gambar 12c). Menurut Blazquez et al., (1998) tingkat ekspresi LFY sangat penting untuk berubah bentuk dari daun untuk bractless bunga. Ekspresi gen AG yang berlebihan diketahui dapat menekan ekspresi dari gen AP dan WUS (Gustafson et al., 1994). Hal yang sama juga terjadi pada aktivasi dari promoter gen TcAG yang berlebihan. Aktivasi dari promoter TcAG yang berlebihan akan menghambat ekspresi dari AP1. Gen AP1 diketahui mampu mengaktifkan ekspresi gen LFY. Proses penghambatan gen AP1 oleh AG secara tidak langsung juga akan menghambat ekspresi dari LFY. Penghambatan ekspresi LFY melalui jalur penghambatan gen AP1 juga menghambat ekspresi dari gen MADS BOX karena gen LFY diketahui merupakan gen pusat yang dapat 35 mengaktifkan gen MADS BOX pada pembungaan. Gen MADS BOX yang terpengaruh penghambatannya terdiri dari AP1, AP2, AP3, dan AG (Jordan 2005). Gen LFY diketahui diekspresikan pada masa vegetatif daun (Blazquez et al., 1998). Penghambatan ekspresi dari LFY ini juga akan berpengaruh terhadap morfologi dari daun tembakau. Gambar 13 Proses aktivasi dan inaktivasi gen MAD-Box pembungaan pada tanaman. Agamous (AG) menghambat ekspresi dari Apetala1 (AP), dan (WUS), LFY mengaktifkan ekspresi AG, AP1 dan AP3. Gen LFY dalam sistem gen pembungaan tidak termasuk ke dalam gen MADS BOX tetapi berada di luar gen MADS BOX. Pada sistem pembungaan gen LFY termasuk ke dalam gen pada pusat pembungaan yang mampu mengaktifkan ekspresi dari gen MADS BOX. Gen MADS BOX yang diaktifkan oleh gen LFY terdiri dari gen-gen yang berada pada sistem ABC pembungaan yaitu AP1, AP2, AP3 dan AG. Bentuk daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY terlihat seperti daun tembakau kontrol positif dan tidak memperlihatkan daun tembakau yang tidak sempurna seperti tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG. Namun jika dibandingkan dengan tanaman tembakau kontrol positif, daun tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY mempunyai ekspresi daun yang berbeda dari segi bentuk. Hal ini karena gen LFY secara aktif berperan dalam pengaktifan gen AG dan gen AP (Gambar 13), sehingga proses bolak balik antara gen ini tidak terlalu mempengaruhi bentuk daunnya dan terlihat seperti daun kontrol positif. Protein LFY mengaktifkan gen-gen lainnya dengan cara membentuk ikatan dengan sekuen gen target yang dikenal dengan istilah DNA-binding protein (Jordan 2005). Mekanisme ini terjadi pada aktivasi AG, protein LFY membentuk ikatan dengan sekuen gen AG pada intron kedua sekuen gen AG (Sieburth & 36 Meyerowitz 1997, Busch et al., 1999, Deyholos & Sieburth 2000). Proses aktivasi ini juga dibantu dengan regulator. Regulator ini yaitu berupa protein WUSCHEL (WUS) yang diekspresikan oleh gen WUS. Protein regulator WUS mempunyai peran khusus di dalam sel yaitu sebagai regulator gen kelas C pada pembungaan (Gambar 14). Gambar 14 Mekanisme pengaktifan promoter AG oleh protein LFY (Sharma et al., 2003) Aktivasi gen AP3 oleh LFY dibantu oleh regulator gen yaitu UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO). Gen UFO seperti halnya gen WUS berperan sebagai regulator khusus yaitu pada pengaktifan gen kelas B pada pembungaan. Protein LFY juga berperan melakukan ikatan dengan sekuen DNA pada gen AP1. Aktivasi gen AP1 oleh LFY terjadi secara langsung tanpa bantuan regulator (Parcy et al., 1998). Menurut Samanhudi (2006) aktivasi promoter AP1 mampu mempengaruhi perkembangan tanaman sehingga tanaman mampu berbunga dengan cepat dan sempurna. Hal ini karena AP1 mempunyai regulasi untuk mengaktifkan ekspresi 37 dari gen LFY. Gen AP1 yang termasuk ke dalam gen MADS BOX mengekspresikan protein dalam bentuk MADS domain (Jordan 2005). Proses pengaktifan LFY oleh AP1 terjadi dengan mekanisme binding site pada kotak CArG Box dengan motif [CC(A/T)6 GG]. Mekanisme ini terjadi pada bagian upstream promoter LFY ((Passmore et al., 1989; Boxer et al., 1989).). Konfirmasi promoter gen TcLFY dan TcAG Uji molekuler dilakukan untuk mengindikasikan keberhasilan aktivitas dari promoter dengan mengukur ekspresi dari gen pelapor Green fluorescent protein (GFP). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan primer GFP forward dan primer GFP reverse. Sebelum amplifikasi dilakukan isolasi DNA total daun tembakau. Hasil verifikasi dari isolasi DNA total dan amplifikasi dapat dilihat pada Gambar 15. Verifikasi DNA kontrol positif diperihatkan pada Gambar 15a. Hasil identifikasi promoter TcLFY dan TcAG pada isolasi daun tembakau diperihatkan pada Gambar 15b dan Gambar 15c. Gen GFP berhasil diamplifikasi dengan ukuran pita 300 bp (Gambar 16). Hal yang sama juga didapatkan oleh Deng & Capecchi (1992) yang mendapatkan ukuran pita GFP yaitu 300 bp. Verifikasi yang dilakukan dengan PCR ini memperkuat hasil yang diperoleh bahwa transformasi ke tanaman berhasil dilakukan. Proses insersi yang dilakukan T-DNA pada Agrobacterium tumifaciens AGL0 berhasil membawa kontruk promoter. Ekspresi gen GFP yang terdeteksi juga membuktikan keberhasilan aktivasi dari promoter TcLFY dan TcAG. Gen reporter GFP dilaporkan telah berhasil digunakan sebagai evaluasi reporter tranformasi tanaman menggunakan Agrobacterium (Greebenok 1997). Jika promoter aktif maka gen reporter GFP akan ditranskripsi dan untuk mengetahui gen reporter GFP bisa dideteksi dengan keberhasilan transformasi dilakukan dengan metode PCR. Promoter AG telah berhasil mampu mengaktifkan ekspresi dari gen reporter GUS pada tanaman Arabidospsis (Sieburth & Meyerowitz 1997). Hal yang sama pun ditemukan pada promoter LFY yang telah mampu mengaktifkan ekspresi dari gen reporter GUS (Blazquez et al., 1998). 38 (a) (b) (c) Gambar 15 Isolasi DNA genomik tembakau (a) kontrol, (b) TcLFY dan (c) TcAG. Gen GFP (300 bp) (a) (b) Gambar 16 Amplifikasi gen reporter GFP, (a) GFP dari promoter gen TcLFY, (b) GFP dari promoter gen TcAG. 39 Variasi media sukrosa Variasi sukrosa dilakukan untuk menguji pengaruh sukrosa terhadap kerja promoter. Variasi sukrosa dilakukan pada 3 macam variasi yaitu sukrosa 0%, 0,5% dan 4% dengan jangka waktu 3 hari pengamatan dan 7 hari pengamatan. Konsentrasi media 4% digunakan sebagai kontrol positif. Kondisi tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG tidak menunjukkan perubahan yang signifikan dengan perlakuan variasi sukrosa. Morfologi pada daun tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcAG tidak menunjukkan perubahan warna ekstrim seperti tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. Selama inkubasi 3 hari warna daun tembakau yang disisipi promoter gen TcAG pada konsentrasi 0% terlihat sedikit menguning, tetapi tidak sama di seluruh daunnya. Sedangkan pada konsentrasi 0,5% dan 4% tidak terjadi perubahan warna kuning namun warna pada seluruh daunnya terlihat sama (Tabel 3). Selama inkubasi 7 hari pada konsentrasi sukrosa 0%, 0,5% dan 4% tidak terjadi perbedaan yang signifikan, hanya pada konsentrasi 4% terlihat lebih segar dan lebih hijau (Tabel 4). Pada konsentrasi media sukrosa 0% promoter gen TcAG mampu mempengaruhi metabolisme tanaman untuk bertahan hidup dan tidak menunjukkan perubahan yang berat. Hal ini menguntungkan karena walaupun tanpa induksi sukrosa dari luar, dengan bantuan promoter gen TcAG tanaman dapat tumbuh dengan baik. Penelitian yang dilakukan oleh Ohto et al., (2001) menemukan bahwa pemberian sukrosa 1% tidak mempengaruhi ekpresi dari AGAMOUS LIKE 20 (AGL20)/SOC selama inkubasi 5 hari. Tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY memperlihatkan kondisi, semakin tinggi konsentrasi glukosa, pertumbuhan tanaman memperlihatkan pertumbuhan yang baik yang diperlihatkan dengan kondisi daunnya. Morfologi daun pada konsentrasi 0% memperlihatkan bentuk yang sangat ekstrim terutama untuk tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY. Selama variasi sukrosa 3 hari (Tabel 3), daun memperlihatkan warna kuning dan kusam sedangkan pada kondisi 7 hari (Tabel 4) memperlihatkan warna daun kuning, kusam dan terdapat kecoklatan. Warna daun ini menunjukkan bahwa telah terjadi gangguan pada metabolisme pada tanaman dan gangguan pada aktivasi dari promoter gen TcLFY akibat ketiadaan sukrosa pada media. Menurut 40 Blazquez et al., (1998) sukrosa meningkatkan ekspresi vegetatif dari LFY::GUS dan kenaikan ini diperkuat oleh inkubasi dengan giberellin, walaupun inkubasi dengan giberellin saja tidak memberikan efek yang nyata pada kondisi ini. Kondisi ini berbeda pada konsentrasi sukrosa 0,5% dan 4%. Pada konsentrasi 0,5% dan 4% daun masih terlihat hijau, namun pada konsentrasi 4% daun terlihat lebih hijau (Tabel 3). Inkubasi selama 3 hari dan 7 hari pada konsentrasi ini tidak menunjukkan perubahan yang signifikan. Hal ini membuktikan bahwa pada kondisi yang sedikit sukrosa yaitu 0,5%, tanaman tembakau yang disisipi promoter gen TcLFY mampu bertahan hidup dan warna daun yang masih terlihat hijau. 41 Tabel 3 Variasi media dengan sukrosa pada inkubasi 3 hari Nama promoter 0% 0,5% 4% P TcAG P TcLFY 42 Tabel 4 Variasi media dengan sukrosa pada inkubasi 7 hari P TcAG 0% 0.5% 4% P TcLFY 43 Proses pembungaan pada tanaman dipengaruhi oleh kandungan sukrosa pada media (Samanhudi 2006). Menurut Szopa et al., (2003), aktivitas promoter bisa diinduksi oleh sukrosa. Tingkat induksi ini bisa berbeda untuk jalur transgenik yang berbeda. Setelah 72 jam inkubasi pada sukrosa dicirikan dengan meningkatnya aktivitas dari gen reporter GUS. Tanaman Arabidopsis bisa membentuk bunga dalam keadaan gelap dengan syarat bahwa media harus mengandung sukrosa (Blazquez et al., 1998). Kandungan sukrosa endogenous menunjukkan peningkatan pada saat munculnya bunga. Peningkatan ini secara tidak langsung mempengaruhi aktivitas gen di dalam sel (Samanhudi 2006). Peneltian yang dilakukan oleh Bernier et al., (1993) telah membuktikan bahwa sukrosa menginduksi proses pembungaan pada Sinapis alba. Konsentrasi sukrosa dalam floem mengalami peningkatan dengan cepat pada proses pembungaan. Peningkatan ini berasal dari mobilisasi sukrosa dalam bentuk simpanan sebagai pati pada daun dan batang (Bernier et al., 1993). Induksi dengan sukrosa pada proses pembungaan juga telah terbukti pada tanaman Arabidopsis yang dilakukan oleh Roldan et al., (1997). Sukrosa memegang peranan penting saat transisi pembungaan. Pada proses transisi ini sukrosa berperan dalam mengaktifkan gen-gen yang berperan dalam mengontrol transisi pembungaan (Ohto et al. 2001). Proses inisiasi sukrosa dalam mempengaruhi gen-gen pembungaan dapat dilihat pada Gambar 17. Flowering locus (FLC) bertindak sebagai represor pada proses pembungaan yang menghambat ekspresi dari gen LFY (Michaels & Amasino 1999) namun keberadaan sukrosa mampu mengaktifkan ekspresi dari LFY. Konsentrasi sukrosa pada tanaman yang meningkat bisa berasal dari mobilisasi karbohidrat dalam bentuk simpanan berupa pati. Pati ini bisa berasal dari dalam daun dan batang. Peran sukrosa pada proses pembungaan tidak terpengaruh dengan kondisi cahaya. Sukrosa berperan pada proses ini baik dalam keadaan terdapat cahaya maupun tidak. Sukrosa mampu mempercepat berkembangnya FVE, FPA, FCA, CONSTANS (CO), dan GIGANTEA (GI) tetapi tidak FT dan FWA (Roldan et al., 1997). Proses teraktivasinya gen-gen FVE, FPA, FCA, CO, dan GI terjadi pada masa vegetatif. FCA yang aktif mampu merespon ekspresi dari LFY. Induksi oleh sukrosa juga mampu mempengaruhi kerja dari 44 tiga gen pada metabolisme sukrosa yaitu ADP GLUKOSA PIROFOSFORILASE (ADG1), STARCH EXCESS1 (SEX1), dan PHOSPHOGLUCOMUTASE (PGM). Ketiga gen ini mampu menginduksi ekspresi dari gen LFY (Levy & Dean 1998). Gambar 17 Sinyal sukrosa pada tanaman yang menginisiasi gen pembungaan (Jordan 2006). 45 SIMPULAN DAN SARAN Promoter gen TcLFY dan promoter gen TcAG telah berhasil ditransformasikan ke tanaman model tembakau. Promoter gen TcLFY memberikan morfologi tanaman seperti tanaman kontrol. Promoter gen TcAG memberikan morfologi tanaman dengan pertumbuhan yang lambat dan bentuk morfologi daun yang tidak sempurna. Promoter mampu mempengaruhi morfologi tanaman. Seleksi tanaman transforman dilakukan dengan media seleksi kanamisin dan verifikasi dengan PCR. Media sukrosa mampu mempengaruhi aktivitas dari promoter gen TcLFY tetapi tidak terlalu berpengaruh terhadap promoter gen TcAG. SARAN 1. Penelitian terhadap promoter gen LFY dan promoter gen AG perlu dilakukan pada tanaman lain untuk melihat morfologi dan ekspresinya. 2. Penelitian dengan doubel konstruk promoter perlu dilakukan untuk melihat lebih cepat hasilnya. 3. Penambahan hormon lain untuk melihat pengaruh dari perkembangan kedua promoter ini. 4. Pengujian terhadap pengaruh faktor lain dalam penginduksian promoter seperti, temperatur dan cahaya. 46 47 DAFTAR PUSTAKA Ahsen, Von U, Davies J, Schroeder R. 1991. Antibiotic inhibition group I ribozyme function. Nature 353:368-370. Bao X, Robert GF, JZ Levin, Z Liu. 2004. Repression of Agamous by Bellringer in floral and inflorescence meristems. The Plant Cell. 16:1478-1489. [BBP2TP] Balai Besar Perbenihan & Proteksi Tanaman Perkebunan. 2010. Teknologi fermentasi untuk meningkatkan kualitas biji tanaman kakao Indonesia. [terhubung berkala]. http://ditjenbun.deptan.go.id. [3 Jul 2011]. Bernier G, Havelange A, Houssa C, Petitjean A, Lejeune, P. 1993. Physiological signals that induce flowering. Plant Cell 5: 1147–1155. Bhau BS, Wakhlu AK. 2001. Effect of some antibiotics on the in vitro morphogenetic response from callus cultures of Coryphantha elephantidens. Biologia plantarum 44(1):19-24 Blazquez MA, Green R, Nilsson O, Sussman MR, Weigel D. 1998. Gibberellins promote flowering of Arabidopsis by activating the leafy promoter. The Plant Cell 10: 791–800. Boxer,L.M., Prywes,R., Roeder,R.G. and Kedes,L.J. 1989. The sarcomeric actin CArG-binding factor is indistinguishable from the c-fosserum response factor. Mol. Cell. Biol 9: 515-522. Bock R, Karcher D, Bock R. 2007. Penentuan tingkat penahanan transgen disediakan oleh transformasi kloroplas, Prosiding National Academy of Sciences 114 (17). Busch MA, Bomblies K, Weigel D. 1999. Activation of a floral homeotic gene in Arabidopsis. Science 285:585–587. Chaidamsari T, Suwanto A, Winata L, Santoso D. 1999. Isolasi dan ekspresi gen GUS pada beberapa jaringan tanaman kakao. Bioteknologi pertanian 4(1):28-35. Chaidamsari T. 2005. Biotechnology for cocoa pod borer resistance in cocoa. [tesis]. Wageningen, Wageningen University. Dean C, Simpson GG. 2002. Recent advances in flowering time control research in Arabidopsis. Science 296:285-289. Deng C, Capecchi MR. 1992. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular and Cellular Biology 12:3365-3371. Deyholos MK, Sieburth LE. 2000. Separable whorl-specific expression and negative regulation by enhancer elements within the AGAMOUS second intron. Plant Cell 12:1799-1810. Dobhal S, Pandey D, Kumar A, Agrawal S. 2010. Studies on plant regeneration and transformation efficiency of Agrobacterium mediated transformation using neomycin phosphotransferase II (nptII) and glucuronidase (GUS) as a reporter gene. African Journal of Biotechnology 9(41): 6853-6859. 48 Evert RF, Esau K, Eichhorn SE. 2006. Esau's Plant anatomy: meristems, cells, and tissues of the plant body: their structure, function, and development. John Willey & Sons 67-79. George EF. 1996. Plant Propagation by Tissue Culture. Exegetics Ltd: England. Goenadi DH, Hardjono A. 1985. Penilaian Kesesuaian lahan untuk tanaman cokelat di Indonesia. Buletin Perkebunan. 3:7-9. Glover BJ. 2007. Understanding Flower and Flowering. New York: Oxford University Pr Inc. Grebenok RJ, Lambert GM, Galbraith DW. 1997. Characterization of the targeted nuclear accumulation of GFP within the cells of transgenic plants. Plant J 12:685-696. Gustafson BC, Savidge B, Yanofsky MF. 1994. Regulation of the Arabidopsis homeotic gene APETALA1. Cell 76:131-143. Hameed N, Shabbir A, Ali A, Bajwa R. 2006. In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.). Mycopath 4:35-38. Hapsoro D. 1999. Effects of gelling agents ad sucrose concentrations on in vitro shoot proliferation of vanilla (Vanilla planifolia Andr). J. Agrotropika IV (2):1-5. Helmenstine AM. 2012. Kanamycin Chemical Structure. [terhubung berkala]. http://chemistry.about.com.htm [7 Mar 2012]. Hinsley SR. 2010. Theobroma cacao. [terhubung berkala]. http://www.malvaceae.info/Genera/Theobroma.html [4 Jun 2010]. Hunter M. 2011. Sigma factor. [terhubung berkala]. http:// helicase.pbworks.com [4 Jun 2010]. Jordan BR. 2006. The Molecular Biology and Biotechnology of Flowering. New Zealand: Biddles Ltd. Lingga H. Mencari solusi atas kakao. Agrotek Okt 2007:10-16. Levy YLY, Dean C. 1989. The Transition to Flowering. Plant Cel, 10:1973–1989. Loedin IHS. 1994. Transformasi genetik pada tanaman. Hayati. 1(2):66-67. Makful, Purnomo S, Sunyoto, Iswanto R, Utami TIR. 2004. Transformasi cDNA gen 1-aminosiklopropan-1-asam karboksilat oksidase untuk penundaan kematangan pada pepaya dampit dan sarirona. J. Hort 14 (1):1-7. Miller AR and Chandler CK. 1990. Plant regeneration from excised cotyledons of mature strawberry achenes. Hort Science. 25(5):569-571. Michaels SD, Amasino RM. 1999. FLOWERING LOCUS C encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering. Plant Cell 5:949-56. Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Harpers Illustrated Biochemistry. North Amerika : McGraw-Hill Companies Inc. 49 Nakagawa et al. 2007. Development of Series of Gateway Binary Vectors, pGWBs for Realizing Efficient Construction of Fusion Genes for Plant Transformation. Journal of bioscience and bioengineering. 104(1):34–41. Ohto M, Onai K, Furukawa Y, Aoki E, Araki T, Nakamura K. 2001. Effects of sugar on vegetative development and floral transition in Arabidopsis. Plant Physiology 127:252–261. Orozo C, Chalmena KT, Wough B, Powell W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgenession in coffe using RAPD marker. Theor Appl Genet 87:934-935. Passmore S, Elble R, Tye BK. 1989. A protein involved in minichromosome maintenance in yeast binds a transcriptional. Genes Dev 3: 921-935. Parcy F, Nilsson O, Busch, MA, Lee I, Weigel D. 1998. A genetic framework for floral patterning. Nature 395:561–566. Pineiro M, Coupland G. 1998. The control of flowering time and floral identity in Arabidopsis. Plant physiol 117:1-8. [PPKKI] Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia. 2004. Budidaya Kakao. Jakarta: Agromedia pustaka. Purwito A. 1999. Fusiprotoplas Intra dan Interspesiws pada tanaman kentang. Bogor: Institut Pertanian Bogor, Program Pascasarjana. Rahmawati S. 2006. Status Perkembangan Perbaikan Sifat Genetik Padi Menggunakan Transformasi Agrobacterium. Jurnal AgroBiogen 2(1):3644. Roldan M, Gomez MC, Ruiz GL, Martin TM, Salinas J, Martinez ZJM. 1997. Effect of darkness and sugar availability to the apex on morphogenesis and flowering time of Arabidopsis. Flowering Newsl 24:18–24. Rolland F, Moore B, Sheen J. 2002. Sugar sensing and signaling in plants. The Plant Cell 185-205. Samanhudi. 2006. Studi pembungaan dan isolasi gen Apetala1 pada kakao (Theobroma kakao L.). [Disertasi]. Bogor: Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Santoso YR. 2010. Isolasi promotor gen lfy pada tanaman Theobroma cacao L. Dengan teknik Genome walkingtm. [skripsi]. Bogor: Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Setyodjatmiko N. 2000. Pemanfaatan gen movement protein (mp) untuk perbaikan ketahanan tanaman tembakau terhadap virus mosaik ketimun(Cucumber Mosaic Virus). [Disertasi]. Malang: Program Pacasarjana, Universitas Brawijaya. Sharma VK, Carles C, Fletcher JC. 2003. Maintenance of stem cell populations in plants. PNAS 100(1):11823-11829. 50 Sia TY, Ooi CK, Munshi S,Verma A. 2000. Colloid and surface phenomena aspects of chocolate. [terhubung berkala]. http://www.eng.buffalo.edu. [21 Feb 2012]. Sieburth LE, Meyerowitz EM. 1997. Molecular dissection of the AGAMOUS control region shows that cis 122 B. Krizek elements for spatial regulation are located intragenically. Plant Cell 9:355–365. Siregar THS, S Riyadi, Nuraeni L. 2004. Budidaya, Pemasaran, dan Pengolahan Cokelat. Jakarta: Penebar Swadaya. Sieburth LE, Meyerowitz EM. 1997. Molecular dissection of the AGAMOUS control region shows that cis elements for spatial regulation are located lntragenically. The Plant Cell 9:355-365. Suwarso. 1999. Morfologi dan biologi tanaman tembakau virginia. Monograf Balittas. 3:1-8. Trizana NM. 2010. Isolasi dan karakterisasi promoter gen agamous dari kakao (Theobroma cacao L.) [skripsi]. Bogor: Program Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Tsajadiharja. 1987. Hubungan antara pertumbuhan pucuk, perkembangan buah serta tingkat kandungan asam indol asetat di dalam biji dan layu pentil kakao (Theobroma cacao L.). [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Yang Y, Singer SD, Liu Z. 2011. Petunia agamous enhancer-derived chimeric promoters specify a carpel-, stamen-, and petal-specific expression pattern sufficient for engineering male and female sterility in tobacco. Plant Mol Biol Rep 29:162–170. Yelli F. 2009. Transformasi dan regenerasi tanaman tomat (lycopersicon esculentum mill.) dengan gen partenokarpi melalui vektor Agrobacterium tumefaciens. [terhubung berkala]. http:blog.unila.ac.id. [13 Feb 2012]. Yuwono T. 2005. Bilogi Molekuler. Jakarta: Erlangga. Wachjar A, SH Iskandar. 1998. Budidaya Cokelat. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Wakushima, S., Yoshioka, H., Sakurai, N. 1996. Lateral female strobili production in a Japanese red pine (Pinus densiflora Sieb. Et Zucc.) clone by exogenous cytokinin application. J For Res 1: 143–148. Wood GAR. 1985. Cocoa. New York: Longman Inc. Zupan L, Muth TR, Draper O, Zambryski P. 2000. The transfer of DNA from Agrobacterium tumifaciens into plants: a feast of fundamental insight. Plant J 23:11-28. 51 LAMPIRAN 52 Lampiran 1 Diagram alir penelitian Kultur bakteri Agrobacterium tumifaciens AGL0 yang membawa promoter gen target Transformasi ke tanaman tembakau Regenerasi tanaman tembakau Konfirmasi promoter gen TcLFY dan TcAG PCR Variasi media sukrosa 0%, 1,5%, dan 4% 53 Lampiran 2 Komposisi media Komposisi media MS Nama media Komposisi A NH4NO3 (82,5 g/L) B KNO3 (95 g/L) C CaCl2.2H2O (22 g/L) H3BO3 (0,31 g/L), KI (0,0415 g/L), KH2PO4 (8,5 g/L), Na2MoO4.2H2O (0,0215 g/L), CoCl2 (0,0013 g/L) MgSO4.7H2O (18,5 g/L), ZnSO4.7H2O (0,43 g/L), CuSO4.5H2O (0,0013 g/L), MnSO4.7H2O (0,7527 g/L) Na2EDTA (1,86 g/L), FeSO4.7H2O (1,39 g/L) D E F Komposisi vitamin MS Nama bahan Komposisi Tiamin HCl 10 mg/L Asam nikotinat 1 mg/L Piridoksin HCl 1 mg/L Mio-inositol 100mg/L 54 Lampiran 3 Gen-gen yang terlibat dalam organogenesis tanaman (sumber: Jordan 2006) 55 Lampiran 4 Gen yang berperan pada proses pembungaan (promoter) dan penghambat proses pembungaan (repressor) (Sumber : Levy & Dean 1989) 56 Lampiran 5 Ekpresi gen ABC pada pembungaan Ket : Se : sepal, Pe : petal, St : stamen, Ca : karpel (Jordan 2005) 57 Lampiran 6 Proses pembuatan coklat (Sia et al., 2000) 58 Lampiran 7 Perubahan berat yang terjadi pada tanaman tembakau Perubahan berat pada tanaman tembakau yang diinsersi promoter gen TcAG Perubahan berat pada tanaman tembakau yang diinsersi promoter gen TcLFY