Prihatiningtyas TR (C14052554)

II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ikan Mas Cyprinus carpio
Ikan mas Cyprinus carpio merupakan jenis ikan konsumsi air tawar yang
sangat populer. Ikan mas sudah dipelihara sejak tahun 475 Sebelum Masehi di
Cina. Di Indonesia ikan mas mulai dipelihara sekitar tahun 1920 (Khairuman et
al., 2008). Secara morfologis, ikan mas mempunyai bentuk tubuh agak
memanjang, sedikit pipih ke samping dan lunak. Mulut terletak di ujung tengah
dan dapat disembulkan. Bagian anterior mulut terdapat dua pasang sungut
berukuran pendek. Secara umum, hampir seluruh tubuh ikan mas ditutupi sisik
dan hanya sebagian kecil saja yang tubuhnya tidak ditutupi sisik. Sisik ikan mas
berukuran relatif besar dan digolongkan dalam tipe sisik sikloid berwarna hijau,
biru, merah, kuning keemasan atau kombinasi dari warna-warna tersebut sesuai
dengan rasnya. Adapun klasifikasi ikan mas menurut Saanin (1984) adalah
sebagai berikut :
Filum
: Chordata
Sub-filum : Vertebrata
Kelas
: Actinopterygii
Ordo
: Cypriniformes
Famili
: Cyprinidae
Genus
: Cyprinus
Spesies
: Cyprinus carpio
Ikan mas menyukai tempat hidup (habitat) di perairan tawar yang airnya
tidak terlalu dalam dan alirannya tidak terlalu deras, seperti di pinggiran sungai
atau danau. Suhu dan pH air optimal untuk pertumbuhan ikan mas adalah 20-250C
dan 7-8. Ikan mas tergolong jenis omnivora, yakni ikan yang dapat memangsa
berbagai jenis makanan, baik yang berasal dari tumbuhan maupun binatang renik.
Namun, makanan utamanya adalah tumbuhan dan binatang yang terdapat di dasar
dan tepi perairan (Khairuman et al., 2008).
2.2 Koi Herpesvirus (KHV)
Koi herpesvirus (KHV) merupakan kelompok virus DNA dari famili
Herpesviridae. Virus ini berkembang biak di dalam inti sel inang dan membentuk
badan inklusi yang disebut Cowdry tipe A. Virus ini apabila telah menginfeksi
inang maka sejumlah virus akan tetap tinggal di dalam inangnya sehingga bersifat
laten (Daili dan Makes, 2002 dalam Laelawati, 2008). Serangan penyakit ini tidak
hanya menyerang Indonesia. KHV dilaporkan mulai terjadi pada tahun 1998 di
Israel, Amerika Serikat (1998), Belgia (1999), Inggris (2000), Austria (2003),
Perancis (2001), Afrika Selatan (2001), Malaysia (2001), Hongkong (2001),
Denmark (2002), Jerman (2002), Belanda (2002),
Italia (2003), Luxemburg
(2003), Swiss (2003), Polandia (2003), Taiwan (2003), dan Thailand (2004)
(Pokorova et al., 2005).
KHV hanya dapat menyerang ikan mas Cyprinus carpio dan koi Cyprinus
carpio baik ukuran larva, juvenil maupun dewasa (Gilad et al., 2002). Kedua jenis
ikan tersebut juga dapat menjadi pembawa penyakit (carrier). Suhu optimal virus
herpes yang menyebabkan kematian adalah 18-27oC. Kematian ikan akan
menurun bahkan akan berhenti bila suhu berada di atas atau di bawah kisaran
optimal. Serangan penyakit ini bersifat akut (cepat) dan ganas. Ikan akan terlihat
sakit dan akhirnya mati dalam waktu 24-48 jam (OATA, 2001). Herpesvirus pada
ikan secara umum diidentifikasi sebagai penyebab penyakit mulai dari infeksi
sisik hingga infeksi sistemik yang fatal (Gilad et al., 2003).
Dari percobaan kohabitasi antara ikan sehat dan ikan terinfeksi KHV yang
dilakukan oleh Hutoran et al., (2005) diperoleh hasil bahwa ikan yang sakit
mengalami ganggunan berupa gerakan yang tidak terkoordinasi dan berenang
tidak beraturan yang merupakan tanda-tanda adanya gangguan saraf (neurological
disorder). Gangguan ini diperjelas dengan berkurangnya frekuensi gerakan ekor
dan kehilangan keseimbangan pada beberapa ikan. Penyebaran penyakit ini
melalui air dan bersifat sangat menular. Virus ini terutama menginfeksi pada
bagian insang dan ginjal ikan. Dari kajian histopatologi pada ginjal, tampak jelas
bahwa virus ini mengakibatkan inflamasi pada renal tubul ginjal dan
mengakibatkan sel-sel yang terinfeksi mengalami pembentukan badan inklusi
pada inti selnya. Kajian histopatologi insang ikan yang sakit menunjukkan bahwa
terdapat sel-sel inflamasi di insang dan epitel insang mengalami hiperplasia.
Kajian dengan menggunakan indirect immunofluorescent microscopy terhadap
insang, ginjal, otak dan hati menunjukkan bahwa virus KHV terakumulasi pada
insang dan ginjal (Pikarsky et al., 2004).
2.3 Vaksin DNA
Perkembangan vaksin pada ikan dikelompokkan menjadi tiga generasi.
Generasi pertama adalah vaksin konvensional yang dibagi menjadi dua kelompok
yaitu vaksin yang diinaktivasi/dimatikan (inactivated vaccine) dan vaksin hidup
yang dilemahkan (live attenuated vaccine). Vaksin generasi kedua adalah vaksin
protein rekombinan (recombinant protein vaccine) dan vaksin generasi ketiga
adalah vaksin DNA (DNA vaccine). Vaksin DNA adalah vaksin yang berbentuk
plasmid DNA yang mengandung sisipan gen imunogenik, misalnya glikoprotein,
yang diapit oleh sebuah promoter dan terminator/poliadenilasi (Lorenzen et al.,
2005). Ekspresi dari plasmid di sel somatik inang akan memicu sistem imun
humoral dan selular. Vaksin DNA memiliki keuntungan yaitu tidak menimbulkan
resiko infeksi, mudah dikembangkan dan diproduksi, bersifat stabil dan mampu
mengaktivasi
sistem
kekebalan
baik
humoral
maupun
seluler,
sedang
kelemahannya adalah terbatasnya gen yang bersifat imunogenik. Vaksin DNA
cukup efektif mencegah infectious haematopoietic necrosis virus (IHNV) dan
viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) pada ikan salmon (Lorenzen et
al., 2005).
2.4 Promoter
Promoter adalah bagian dari DNA yang merupakan tempat RNA
polimerase menempel dan menginisiasi transkripsi (Glick & Pasternak, 2003),
menentukan waktu, tingkat dan tempat ekspresi gen. Umumnya promoter terletak
pada bagian upstream (terminal 5’) suatu gen (Hackett, 1993).
Berbagai macam promoter dapat aktif pada sel ikan walaupun bukan dari
ikan yang homolog, namun akan mempengaruhi tingkat ekspresi gen (Dunham,
2004). Tingkat ekspresi gen dipengaruhi oleh adanya interaksi antara elemen cisregulator pada promoter dan elemen trans-regulator inang. Hackett (1993)
menjelaskan bahwa cis-regulator akan mengatur tingkat transkripsi bergantung
pada keberadaan protein trans-regulator. Cis-regulator akan berikatan dengan
protein atau faktor trans-regulator lainnya yang kemudian akan meningkatkan
atau menurunkan tingkat transkripsi. Kesesuaian antara elemen cis-regulator dan
elemen trans-regulator akan menghasilkan ekspresi yang tinggi. Sebaliknya, bila
kurang atau tidak sesuai maka ekspresi yang dihasilkan rendah (Fletcher &
Davies, 1991 dalam Ath-thar, 2007).
2.4.1 Promoter Heat Shock
Promoter heat shock diisolasi dari ikan rainbow trout (Kawamura dan
Yoshizaki, belum dipublikasikan) dan diketahui termasuk ke dalam golongan heat
shock protein. Promoter heat shock memiliki panjang fragmen 2759 pasang basa.
Jenis promoter lainnya yang termasuk ke dalam golongan heat shock protein
antara lain adalah promoter hsp27. Promoter hsp27 merupakan jenis promoter
yang bersifat dapat diinduksi (inducible). Promoter hsp27 memiliki aktivitas yang
tinggi pada sel otot bahkan dapat aktif di seluruh jaringan jika dipicu dengan
tekanan suhu (Wu et al., 2008).
Protein heat shock dapat ditemukan di seluruh makhluk hidup untuk
merespons adanya perubahan suhu dan menghindari kerusakan sel akibat panas.
Pada kondisi normal, heat shock ditemukan dalam konsentrasi yang rendah.
Konsentrasi tinggi diperoleh ketika terjadi perubahan suhu secara signifikan
(Fang, 2003). Toyohara et al. (2005) juga menyatakan bahwa heat shock berperan
merespons perubahan kondisi suhu lingkungan.
Pada pengujian yang dilakukan pada ikan zebra promoter heat shock dapat
pula mengekspresikan gen secara aktif tanpa diberikan rangsangan dari luar
seperti suhu dan hormon (constitutive) namun ekspresi tersebut terjadi dalam
waktu yang singkat (Krone & Sass, 1994; Krone et al., 1997; Lele et al., 1997;
Yeh & Hsu, 2002). Promoter heat shock dapat mengendalikan gen pada jaringan
kulit, otot dan hati (Wu et al., 2008) sehingga promoter heat shock tergolong
ubiquitous (Hackett, 1993).
2.4.2 Promoter Keratin
Promoter keratin diisolasi dari ikan flounder Jepang Paralichthys
olivaceus dan memiliki panjang fragmen 1288 pasang basa (Yazawa et al., 2005).
Promoter keratin ikan flounder Jepang (endogenus) diketahui memiliki aktivitas
hampir di seluruh jaringan, sedangkan yang diuji coba pada ikan zebra
(eksogenus) memiliki aktivitas terkuat pada jaringan epitel dan hati. Pada awalnya
promoter keratin merupakan promoter yang digunakan pada teknologi
transgenesis yang terkait dengan sistem imun, karena efektivitasnya yang tinggi
pada jaringan kulit (Gong et
al., 2002). Namun Giordano et al. (1990)
menyebutkan bahwa efektivitas promoter keratin tidak hanya terbatas pada
jaringan kulit dan epitel, tapi juga terdapat pada sel yang sedang berkembang dan
sel saraf tertentu. Sedangkan Yazawa et al. (2005) menjelaskan bahwa promoter
keratin yang diujikan pada ikan zebra mampu bersifat aktif dimana-mana atau
tidak spesifik jaringan tertentu (ubiquitous) dan dapat aktif kapan saja diperlukan
(house-keeping).
2.4.3 Promoter β-aktin
Promoter β-aktin ikan medaka merupakan salah satu jenis promoter yang
memiliki aktivitas tinggi pada beberapa jenis ikan diantaranya ikan medaka
(Takagi et al., 1994; Hamada et al., 1998), ikan rainbow trout (Yoshizaki, 2001),
ikan lele (Ath-thar, 2007) dan ikan mas (Purwanti, 2007). Promoter ini memiliki
elemen-elemen penting diantaranya CCAAT boks yang berfungsi untuk
meningkatkan ekspresi dengan stimulasi tertentu, unit CC(A/T)6GG yang biasa
dikenal dengan istilah motif CArG berperan dalam pengaturan ekspresi transgen,
dan TATA boks berperan sebagai tempat menempelnya enzim RNA polimerase
beserta faktor lain dan mengarahkannya sehingga proses transkripsi berlangsug
pada daerah yang benar (Takagi et al., 1994). Promoter dapat aktif dan
mengendalikan ekspresi transgen pada waktu dan tempat yang tepat dengan
adanya kerjasama antara elemen-elemen penyusun promoter tersebut.
Promoter β-aktin merupakan promoter yang bersifat house-keeping yaitu
dapat aktif kapan saja bila diperlukan. Selain bersifat house-keeping, β-aktin juga
mempunyai sifat ubiquitous (Hackett, 1993), dimana promoter ini akan aktif
dimana-mana dan constitutive (Volckaert et al., 1994) yang berarti bahwa
promoter ini bisa aktif tanpa diberikan rangsangan dari luar seperti suhu dan
hormon.
2.5 Gen Green Fluorescent Protein (GFP)
Gen green fluorescent protein (GFP) dimanfaatkan untuk mempelajari
promoter dan aktivitasnya (Dunham, 2004). GFP merupakan penanda molekuler
yang banyak digunakan dalam penelitian bioteknologi yang diisolasi dari uburubur Aequorea victoria. Beberapa kelebihan GFP sebagai penanda molekuler
antara lain keberadaan gen di dalam sel tidak berbahaya bagi sel itu sendiri, tidak
membutuhkan perlakuan khusus pada jaringan, tidak memerlukan substrat
tambahan untuk ekspresinya, dan memiliki kandungan protein yang berpendar dan
dapat divisualisasikan dengan menggunakan mikoroskop fluoresensi (Chalfie et
al., 1994 dalam Iyengar et al., 1996). Gen GFP ini selain berguna sebagai
penanda (marker) juga berfungsi sebagai gen target seperti dalam pembuatan ikan
hias berpendar yang berwarna warni (Gong et al., 2003).
2.6 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Muladno (2002) menyatakan bahwa PCR merupakan suatu reaksi in vitro
untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara
mensintesis molekul DNA baru yang komplemen dengan molekul DNA target
tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu
thermocycler. PCR juga cepat dan hanya dalam hitungan menit jutaan kopi
segmen DNA diproduksi.
PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang stabil terhadap suhu.
Enzim ini semula diisolasi dari bakteri Thermophilus aquaticus. Bakteri tersebut
berkembang di mata air panas pada suhu yang mendekati titik didih air, sehingga
semua enzim pada organisme ini telah berevolusi untuk menahan suhu tinggi.
Reaksi sintesis pada PCR diulang beberapa kali (siklus). Produk dari siklus
sintesis sebelumnya bertindak sebagai cetakan untuk siklus berikutnya,
mengakibatkan perbanyakan eksponensial terhadap daerah target dari DNA (Dale
& Schantz, 2002).
Empat komponen utama pada proses PCR ialah: (1) DNA cetakan
(template), yaitu fragmen (potongan) DNA yang akan dilipat gandakan; (2)
primer, yaitu sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang
menginisiasi sekaligus membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi
DNA. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang komplemen dengan DNA
cetakan, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita
inginkan; (3) deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), yaitu building blocks sebagai
‘batu bata’ penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam sesuai dengan
basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP, dTTP; dan (4) enzim DNA
polimerase, sebagai katalis reaksi sintesis DNA. Komponen lainnya yang juga
penting ialah MgCl2 yang fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA
polimerase dan senyawa buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia
untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan optimum dan menstabilkan enzim
DNA polimerase. Setiap siklus sintesis terdiri dari tiga tahapan yaitu denaturasi,
annealing (penempelan atau hibridisasi primer pada DNA cetakan), dan ekstensi/
elongasi (perpanjangan/sintesis utas komplemen dari DNA target). Masingmasing tahapan tersebut akan ditentukan oleh suhu dan lama waktu yang
dibutuhkan (Dale & Schantz, 2002).
Tahap awal proses PCR adalah denaturasi (denaturation) yaitu tahap
pemisahan utas ganda DNA cetakan (dsDNA) menjadi utas tunggal (ssDNA) ,
yang dilakukan pada suhu 940C. Kemudian dilanjutkan dengan annealing, yang
dilakukan dengan menurunkan suhu sehingga suatu primer pertama yang
merupakan titik awal dari penggandaan DNA akan menempel pada utas tunggal
cetakan yang komplemen/berlawanan. Suhu annealing yang dibutuhkan akan
bergantung pada komposisi dan panjang sekuen primer. Karena pasangan G-C
lebih kuat daripada A-T (pasang basa guanin:sitosin (GC) memiliki tiga ikatan
hidrogen, sedangkan adenin:timin (AT) hanya memiliki dua ikatan hidrogen),
semakin banyak G dan C dalam primer, maka primer tersebut akan berikatan lebih
kuat dengan komplemennya (lebih stabil terhadap peningkatan suhu). Oleh karena
itu, suhu annealing yang digunakan menjadi lebih tinggi bila jumlah GC lebih
banyak (Dale & Schantz 2002). Biasanya suhu annealing dipilih antara 40 dan
600C. Walaupun untuk DNA cetakan dengan kandungan GC yang tinggi, suhu
annealing setinggi 720C (sama dengan suhu ekstensi normal) dapat digunakan.
Karena primer berukuran kecil, dan pada konsentrasi molar yang tinggi secara
keseluruhan, annealing terjadi dengan cepat hanya dalam hitungan detik atau
kurang (Dale & Schantz 2002). Selanjutnya suhu ditingkatkan hingga sekitar
720C, yaitu suhu ekstensi optimum yang biasanya untuk reaksi PCR. Taq
polimerase saat ini akan membuat untai DNA yang komplemen diawali dari ujung
3’ primer. Setelah siklus PCR pertama selesai, dihasilkan dua molekul DNA utas
ganda dari setiap satu utas cetakan yang dipisah saat denaturai awal. Setiap
molekul DNA tersebut terdiri atas satu utas ganda cetakan semula, dan satu utas
ganda baru. Utas ganda baru tersebut ditentukan dengan spesifik pada salah satu
ujungnya oleh primer, dan tidak spesifik pada ujung yang lain sesuai dengan
waktu yang digunakan untuk ekstensi (Dale & Schantz 2002). Selain ketiga proses
tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan pre-denaturasi dan
final elongasi. Tahap pre-denaturasi dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi
untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan mengaktivasi DNA polimerase.
Final elongasi biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 515 menit untuk memastikan bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah
diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan setelah siklus PCR terakhir.
2.7 Analisis Produk PCR (Elektroforesis)
Teknik separasi dan pemurnian DNA/RNA merupakan teknik yang tidak
dapat dipisahkan dari biologi molekular. Hampir semua penelitian DNA/RNA
pasti melibatkan separasi dan pemurnian yang tekniknya cukup beragam. Gel
elektroforesis merupakan teknik yang penting untuk analisis dan pemurnian asam
nukleat. Ketika molekul bermuatan ditempatkan dalam suatu medan listrik,
molekul ini akan berpindah tempat ke arah elektroda dengan muatan yang
berlawanan; molekul asam nukleat bermuatan negatif, akan bergerak ke arah
kutub positif (anoda). Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar yang
disebut fase diam dan fase bergerak. Fase diam berfungsi menyaring objek yang
akan dipisah, sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan
dipisah. Sering kali ditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk
menjaga kestabilan objek elektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif
diletakkan pada masing-masing ujung aparat elektroforesis gel. Zat yang akan
dielektroforesis dimuat pada kolom (disebut well) pada sisi elektroda negatif.
Apabila aliran listrik diberikan, terjadi aliran elektron dan zat objek akan bergerak
dari elektroda negatif ke arah sisi elektroda positif. Kecepatan pergerakan ini
berbeda-beda, tergantung dari muatan dan berat molekul DNA. Kisi-kisi gel
berfungsi sebagai pemisah. Objek yang berberat molekul lebih besar akan lebih
lambat berpindah.
Gel agarosa dapat digunakan untuk memisahkan molekul asam nukleat
yang memiliki perbedaan beberapa ratus pasang basa, mengurangi konsentrasi
agarosa untuk memperoleh pemisahan efektif dari fragmen yang lebih besar, atau
meningkatkannya untuk fragmen kecil. Untuk molekul-molekul lebih kecil yang
ukurannya sama hingga hanya berbeda beberapa puluh pasang basa dapat
digunakan gel polyacrilamide (Dale & Schantz, 2002). Elektroforesis gel agarosa
dapat digunakan untuk menganalisis komposisi dan kualitas dari sampel asam
nukleat. Secara khusus, hal ini sangat membantu untuk menentukan ukuran
fragmen DNA dari hasil restriksi (restriction digest) atau produk reaksi PCR.
Untuk tujuan ini diperlukan kalibrasi terhadap gel dengan menjalankan (running)
penanda (marker) standar yang mengandung fragmen dari ukuran DNA yang
diketahui (Dale & Scahantz, 2002).
Pewarna seperti etidium bromida biasanya digunakan baik untuk
mendeteksi maupun mengkuantitasi asam nukleat. Etidium bromida memiliki
struktur cincin datar yang mampu menumpuk (stack) diantara basa-basa dalam
asam nukleat; hal ini dikenal sebagai intercalation. Selanjutnya, pewarna dapat
dideteksi melalui pendarannya (fluorescent), pada daerah spektrum merah-oranye
ketika dipaparkan dengan sinar UV. Hal ini merupakan metode yang paling luas
digunakan untuk pewarnaan gel elektroforesis, dan juga dapat digunakan untuk
menduga jumlah DNA (atau RNA) dalam sampel, dengan membandingkan
intensitas dari pendaran sampel yang telah diketahui konsentrasinya dan
dimuatkan pada gel yang sama (Dale & Schantz 2002).