identifikasi bercak sperma melalui analisa dna profiling
advertisement
IDENTIFIKASI BERCAK SPERMA MELALUI ANALISA DNA PROFILING DAN MEMBANDINGKAN DENGAN DARAH TERSANGKA PADA LOCUS THO1,D17S5 & vWA AHMAD YUDIANTO,dr Ahmad yudianto,dr PENDAHULUAN Kejahatan sex Pembuktian adanya sperma. Sperma cairan & Bercak. Tes Dx : UV, Pengecatan & Kimiawi Sejak 1985 dikembangkan DNA TINJAUAN PUSTAKA (1) BIOMOLEKULER SPERMATOZOA. Ejakulat pria SEMEN (cair & padat). Bag. Padat semen spermatozoa o/ TESTIS. 4 Porsi Ejakulat : Pre-Ejakulat, Awal, Utama & Akhir. Normal : 2-3 ml (Spermatozoa 60-80 juta/ml). Zat yg t’kandung : Fruktosa, PG, Elektrolit, Enzim, Hormon, aa, KH & lemak. 1. TINJAUAN PUSTAKA (2) Bagian Spermatozoa : Kepala, leher & Ekor (panjang 50 um). Kepala 1 inti DNA Kepala leher Middle piece Spermatozoa TINJAUAN PUSTAKA (3) Kadar DNA dlm jaringan Tubuh SUMBER KADAR DNA 1 Cairan Amnion 65 ng/ml 2 Darah 40 ug/ml 3 CVS 8 ug/ml 4 Biakan Fibroblast 6,5 ug/T25 Flask 5 Rambut 250 ng/mg 6 Hepar 15 ug/mg 7 Otot 3 ug/mg 8 Kulit 3 ug/mg 9 Sperma 3,3 pg/sel TINJAUAN PUSTAKA (4) Dasar pemeriksaan DNA daerah Intron. DNA untaian double helixik. Hidrogen. Btk untaian A-E & Z, B >> ok.fisiologis. Monomer Nukleotida : Basa, gula & P. Basa : A & G (purin), C & T (pirimidin) Ikatan G-C lebih stabil. TINJAUAN PUSTAKA (5) Basa N Ikatan Glikosidik Gula/Deoksiribosa Ikatan Fosfadiester 3’-5’ Phospat Ikatan hidrogen Double Helix Struktur DNA Struktur kimia DNA sama setiap org tp urutan basa beda. - Pola pengulangan deretan basa DNA - Teknik analisa : RFLP, VNTR, STR & mt DNA - FBI : 13 locus STR - TINJAUAN PUSTAKA (6) 2. PENANGANAN SAMPEL. Penanganan Sampel : sangat penting. Penyimpanan : Sbg Ekstraksi, Lysate jar & DNA murni. Sampel sperma : - cair dihisap, bercak dikain yg dicurigai. - dibungkus & label legal artis. - kirim ke lab. TINJAUAN PUSTAKA (7) 3. TAHAPAN PEMERIKSAAN 3.1.Isolasi DNA : - Tahapan : lisis buffer, digestion & proteinase K. - Metode : Chelex, Trizol, Wizard, phenol & salting out. - Trizol : pasti berhasil, pendek, tahan lama & DNA paling tinggi. Metode TRIZOL : - Cairan darah : = 1 ml trizol + 0,5 ul drh EDTA, vortex, ink.5’. = 0,2 ml chloroform, vortex ink.3’ = centrifg. 16000 rpm.15’.4 C, ambil fs atas. = +0,5 ul isopropanol, ink. Sh kamar 10’ = centrfg 16000 rpm 10’,4 C = Buang supernatan, cuci dgn alkohol 70%. = + dgn DW 50 ul, simpan. - Bercak : = 3 ml DW + kain bercak (simp 1 hr). = sonicasi 15’, vortex (homogen), ambil cairan centrfg 6000 rpm 20’, pellet diambil. TINJAUAN PUSTAKA ( 8) 3.2. PEMURNIAN & KADAR DNA Analisa Kemurnian DNA : UV Sphectrophotometri & analisa elektroforesa pd agarose gel berisi 0,5 ug/ml EtBr. EtBr UV Spectrophotometri Analisa Elektroforesa Prosedur UV Sphectrophotometri : - DW 295 ul + DNA Isolasi 5 ul, vortex - Baca hasil l 260 & 280 - Kadar : l 260 X 700/5 X 50 ul/ml - 1 OD = 50 ug/ul - Kemurnian : l 260/l 280 - Nilai : 1 - 2 TINJAUAN PUSTAKA (9) 3.3. PCR - Siklus : DENATURASI, ANNEALING & PERPANJANGAN RANTAI. - BAHAN/REAGEN: DNA target, Primer (up Steam, Down steam), PCR mix (tag polimerase, MgCl2, dNTP), DW & mineral oil. Prosedur PCR: - Kontaminasi min. - reagen vortex, spin - PCR mix 12,5 ul, primer @2,5 ul pd dinding, vortex, spin. - + DNA target, DW smp total 25 ul. - mineral oil 1-2 tts - amplifikasi PCR, sesuai program/lokus. - lengkap simpan ( 4C) primer primer Sintesa dimulai ujung 3’ Siklus 2 TINJAUAN PUSTAKA (10) 3.4. ELEKTROFORESIS DNA muatan (–) Bergrk ke (+) tgt BM/fragmen. BM<<- makin cepat pd molekul gel (agarose, poliacrilamid & campuran ). Agarose gel Pita DNA Poliacrilamid agarose composit gel : - Agarose 0,15 gr + 30 cc TBE, dioven sampai homogen (tab.1). - Acrilamid Bis 4,5 cc + Temed 15 ul (tab.2) - Pd Tab.1 pd suhu 50 C + APS 100 ul, tuangkan bolak-balik ke tab.2 & tuangkan ke ELP. Prosedur Elektroforesa : - DNA Primer & sampel, vortex. - teteskan 2,5 ul loading dye + DNA primer & DNA sampel pada lubang pantray. - Hubungkan terminal elektroda TINJAUAN PUSTAKA (11) 3.5. STAINING - Silver Staining dari poliacrilamid composite gel. - Silver staining : pemindahan gel dari gel box ke pantray yg diberi berbagai cairan utk menampilkan pita. - Silver staining murah, cepat & tahan lama. Prosedur Staining : - Drying : metanol 20%, glycerol 2% dlm 100 cc H20 selama 5’ - Fixaxi : etanol 10%, acetid acid glycerol 5% dlm 100cc H2O selama 20’ - Bilas H2O 3X. -Staining : AgNO3 0,1% dlm 100cc 5080’, cuci DW 3X. - Developing : NaOH 1,5%, formalin 100ul dlm 100 ccH2O, lihat dilampu PELAKSANAAN KEGIATAN (1) Kegiatan di TDC UNAIR Des 04-Jan 05. Sampel : Bercak sperma & darah Isolasi DNA TRIZOL. Sampel darah 4 3 2 1 Isolasi DNA Metode Trizol 5 3 2 Bercak Sperma Bercak Sperma & Sampel darah Pipet Eppendroff 1 PELAKSANAAN KEGIATAN (2) Isolasi DNA -Kemurnian & Kadar DNA Jenis Tabung - Darah : 1,21 & kadar 483 ng/ul - Bercak : 1,1 & kadar 245 ng/ul Alat Sphectophotometri PELAKSANAAN KEGIATAN (3) PCR MJ Cycler ELEKTROFORESIS & STAINING KUTUB POSITIF Staining Fase Develop KUTUB NEGATIF ELP PELAKSANAAN KEGIATAN (4) Hasil Pemeriksaan: loc. THO1 loc. D17S5 D1 D2 Y1 Y2 M D1 D2 Y1 Y2 203 bp 179 bp PELAKSANAAN KEGIATAN (5) Hasil Pemeriksaan : Locus Alele Bercak Sperma Alele Sampel Darah Keterangan THO1 11.11 11.11 Identik vWA 13.13 13.13 Identik D17S5 4.7 4.7 Identik KESIMPULAN 1.Tahapan Pemeriksan DNA: ISOLASI DNA, Penentuan kemurnian & kadar DNA, PCR, Elektroforesis dan Staining. 2.PCR memungkinkan untuk dianalisa DNA profiling meskipun sample biologis sedikit. 3.Pada pemeriksaan DNA Profiling bercak sperma dan sample darah tersangka pada lokus vWA, THO1 dan D17S5 dengan hasil identik SARAN UNTUK LEBIH SPESIFIK PERLU PEMERIKSAAN DNA MITOKONDRIA (mt DNA) & SEKWENS DNA