bahan dan metode penelitian

BAHAN DAN METODE PENELITIAN
Waktu dan tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan dari bulan Februari sampai Juli 2010 di
Laboratorium
Protozoologi
dan
Helmintologi,
Bagian
Parasitologi
dan
Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan
Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
Bahan dan alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah hewan coba berupa mencit
putih, P. berghei, infusa A. annua L., pakan mencit (pelet ikan), kertas saring,
heparin, NaCl fisiologis, gliserol, metanol, pewarna Giemsa, phosphate buffer
saline (PBS), xylol, minyak emersi, dan tissue.
Alat yang digunakan adalah mikrohematokrit (tabung kapiler), syringe 1 ml,
syringe 10 ml, gelas objek, microtube, cawan penguap, gelas ukur, mortar, sonde
lambung, kandang mencit, timbangan listrik, mikroskop cahaya, dan lemari
pendingin.
Cara kerja
a. Preparasi hewan coba
Penelitian ini menggunakan 30 ekor mencit putih (Mus musculus albinus)
yang terdiri dari 15 ekor mencit jantan dan 15 ekor mencit betina. Mencit
memiliki berat kurang lebih 25 gram. Mencit tersebut dipelihara di dalam 10
kandang yang cukup untuk 3-5 mencit. Kandang terbuat dari plastik yang ditutup
dengan ram kawat dan lantainya dialasi dengan sekam padi. Pakan dan air minum
mencit diberikan secara ad libitum. Pakan yang digunakan untuk hewan coba ini
yaitu berupa pelet ikan yang sudah diatur komposisinya sehingga memenuhi nilai
nutrisi.
b. Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan lima
kelompok perlakuan yaitu 1) kontrol normal (tidak diinfeksi dan tidak diberi
infusa A. annua L.), 2) kontrol negatif (diinfeksi tetapi tidak diberi infusa
21
A. annua L.), 3) AR1 (diinfeksi dan diberi infusa A. annua L. dengan pengenceran
1
1
10-2), 4) AR2 (diinfeksi dan diberi infusa A. annua L. dengan pengenceran
10-4), dan 5) AR3 (diinfeksi dan diberi infusa
pengenceran 1
A. annua L. dengan
10-6). Pengulangan dilakukan sebanyak tiga kali untuk setiap
kelompok perlakuan. Mencit diinfeksi dengan P. berghei secara intraperitoneal
dengan menyuntikkan 0.25 106/µl darah mengandung parasit.
Setiap kelompok perlakuan, kecuali kontrol normal dan negatif, diberikan
infusa A. annua L. secara peroral menggunakan sonde lambung. Infusa
A. annua L. diberikan sebanyak satu kali sehari selama 4 hari berturut-turut.
Pemberian infusa A. annua L. dimulai pada hari pertama setelah infeksi. Darah
mencit diambil dan dibuat preparat ulas darah setiap hari sampai hari ke-11
setelah infeksi. Pengamatan gambaran leukosit mencit dilakukan pada preparat
hari ke-0, 2, 4, 6, 8, 9, 10, dan 11 setelah infeksi.
c. Penyimpanan dan Pembuatan Stok P. berghei
Stok P. berghei diperoleh dari Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia. P. berghei tersebut telah
diinfeksi selama lima hari pada mencit albino. Darah mencit yang tersinfeksi
diambil menggunakan mikrohematokrit atau tabung kapiler yang sudah berisi
antikoagulan melalui intraorbital mata. Darah yang terdapat pada tabung kapiler
kemudian dialirkan ke microtube yang sudah diberikan heparin. Darah yang
terdapat di dalam microtube ditambah dengan gliserol agar darah tidak lisis dan
rusak ketika disimpan dalam lemari pendingin bersuhu -70 ºC (Jekti et al. 1996).
Sediaan ini digunakan untuk menginfeksi mencit-mencit disetiap perlakuan.
d. Dosis Parasit pada Stok P. berghei
P. berghei diinfeksikan pada mencit dengan dosis 0.25
106/µl darah
mengandung parasit. Dosis parasit per µl darah diketahui dengan menghitung
jumlah sel darah merah dan menghitung persentase parasit.
Jumlah sel darah merah dihitung dengan terlebih dahulu mengencerkan
darah menggunakan larutan Hayem. Darah yang telah diencerkan dimasukkan ke
dalam Improved Neubauer Counting Chamber. Sel darah merah yang dihitung
adalah sel darah merah yang terdapat dalam lima kotak kecil dibagian tengah
22
kotak hitung. Jumlah sel darah merah dibagi dengan volume bilik hitung (0.02)
dan dikali dengan faktor pengenceran (200) untuk mendapatkan jumlah sel darah
merah per µl. Persentase parasit diketahui dari ulasan darah yang sudah diwarnai
dengan Giemsa. Pada preparat ulas, jumlah parasit per jumlah sel darah merah
dihitung untuk mengetahui persentase parasit. Jumlah parasit per µl darah
diketahui dengan mengalikan persentase parasit dan jumlah sel darah merah.
e. Pembuatan Infusa A. annua L.
A. annua L. yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Balai
Penelitian Tanaman Obat dan Aromatika, Pusat Penelitian dan Pengembangan,
Departemen Pertanian. Infusa diperoleh dengan merebus batang dan daun
A. annua L. yang telah dikeringkan sebelumnya pada suhu 90°C selama
10-15 menit (Wintarsih et al 2009). Perbandingan A. annua L. dan larutan yang
akan direbus adalah 25:100. Hasil rebusan disaring untuk memisahkan ampas dan
filtrat. Filtrat akan digunakan sebagai infusa. Kadar infusa diketahui dengan
menguapkan 1 ml infusa di dalam rotarievaporator. Berat filtrat setelah diuapkan
ditimbang dan didapat kadar infusa tersebut adalah 0.96 g/ml.
Penelitian ini menggunakan tiga pengenceran yaitu 1
1
10-6. Pengenceran 1
10-2, 1
10-4, dan
10-2 didapat dengan menambahkan 1 ml fitrat ke dalam
99 ml aquades, kemudian dilakukan pengocokan manual sebanyak 170 kali
pengocokan per menit. Pengenceran 1
infusa dengan pengenceran 1
10-4 didapat dengan menambahkan 1 ml
10-2 ke dalam 99 ml aquades. Pengenceran
1
10-6 didapat dengan
1
10-4 ke dalam 99 ml aquades. Kadar infusa yang diberikan untuk tiap
menambahkan 1 ml infusa dengan pengenceran
pengenceran adalah 4.8 mg/0.5 ml (infusa dengan pengenceran 1
0.048 mg/0.5 ml (infusa dengan pengenceran 1
(infusa dengan pengenceran 1
10-2),
10-2), dan 0.00048 mg/0.5 ml
10-2).
f. Infeksi P. berghei
P. berghei diinfeksikan pada mencit jantan dan mencit betina secara
intraperitoneal. Darah mencit mengandung parasit yang telah dihitung dosis
parasitnya disuntikkan pada semua kelompok mencit, kecuali kelompok normal.
22
23
Dosis P. berghei yang diinfeksikan pada mencit adalah 0.25
106/µl darah
mengandung parasit.
g. Pembuatan Preparat Ulas Darah
Pembuatan preparat ulas darah dilakukan dengan cara mengambil darah dari
ekor mencit dan kemudian diteteskan pada objek gelas. Darah diulas pada objek
gelas, kemudian dilakukan fiksasi dengan metanol selama 3-5 menit. Pewarnaan
Giemsa dilakukan selama 30 menit pada ulas darah yang telah difiksasi dengan
metanol. Perbandingan pewarna Giemsa yang digunakan adalah 1 bagian Giemsa
dan 1 bagian phosphate buffer saline (PBS). Preparat yang telah diwarnai dicuci
menggunakan air mengalir dan dikering udarakan.
h. Perhitungan Leukosit
Perhitungan leukosit dari preparat ulas darah dilakukan menggunakan
mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000x. Preparat ulas tersebut ditetesi
dengan minyak emersi untuk memperjelas pengamatan. Jumlah leukosit yang
dihitung adalah sebanyak 100 leukosit untuk setiap preparat. Keseratus leukosit
tersebut dikelompokkan berdasarkan perbedaan ukuran, warna, jumlah dan
granulasi sitoplasma, bentuk kromatin dan inti ke dalam lima kelompok yaitu:
neutrofil, monosit, limfosit, eosinofil dan basofil.
Nilai relatif setiap jenis leukosit dinyatakan dalam satuan persen. Nilai
relatif tersebut didapat dengan membagi jumlah sel leukosit dalam satu jenis
leukosit dengan 100, kemudian dikali dengan 100% (Sastradipradja 1989).
i. Analisis Data
Data hasil pengamatan diolah dengan menggunakan uji ANOVA (Analysis
of Varian) – SPS System 17.0 lalu dilanjutkan dengan uji Duncan Multiple Range
Test dengan taraf 5% untuk mengetahui perbedaan perlakuan yang diberikan
(Mattjik & Sumertajaya 2002).
23