ISOLASI GEN PENGKODE -AMILASE DARI BAKTERI LAUT Vibrio sp

1
Bab I
Pendahuluan
Enzim memegang peranan penting dalam dunia industri karena aplikasinya sangat
luas. Sebanyak 30% dari produksi enzim dunia adalah enzim pemroses pati. αAmilase merupakan salah satu enzim yang paling penting dalam proses hidrolisis
pati. Selain penggunaannya dalam hidrolisis pati, enzim ini juga digunakan dalam
berbagai sektor industri, seperti industri makanan, sabun, farmasi, dan tekstil.
Penjualan α-amilase pada pasar dunia diperkirakan 11 juta dolar pertahun
(Sivaramakrishnan et al., 2006). Dengan meningkatnya penggunaan amilase
dalam beberapa industri, khususnya α-amilase maka diperlukan produksi enzim
ini dalam jumlah yang lebih banyak dan sifat yang lebih baik.
α-Amilase (1,4-α-D-glukan-glukanohidrolase, E.C. 3.2.1.1) adalah endoenzim
yang mengkatalisis hidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada amilosa atau
amilopektin menghasilkan α-limit dekstrin, oligosakarida linier, dan sedikit kecil
maltosa serta glukosa. α-Amilase secara umum dihasilkan oleh hewan, tanaman,
dan mikroba. Meskipun demikian, enzim-enzim yang berasal dari jamur dan
bakteri mendominasi aplikasi dalam sektor industri (Pandey et al., 2000 dalam
Reddy et al., 2003). Keuntungan utama menggunakan mikroorganisme untuk
menghasilkan amilase adalah kapasitas produksinya yang besar dengan biaya
murah dan mikroba mudah dimanipulasi untuk memperoleh enzim dengan
karakteristik yang diinginkan (Gupta et al., 2003). Selain itu, enzim yang berasal
dari mikroba lebih stabil daripada enzim yang diperoleh dari tanaman atau hewan.
Sebagian besar enzim yang sekarang ini digunakan dalam industri berasal dari
mikroba
dan
dihasilkan
dari
sekitar
25
spesies,
termasuk
12
fungi
(Chandrasekaran, 1997).
Hidrolisis pati dapat dilakukan secara enzimatik dengan melibatkan enzim
karbohidrase, terutama α-amilase dan glukoamilase. Tahap pertama pada proses
2
hidrolisis pati berlangsung pada suhu tinggi, yaitu tahap gelatinisasi (100-110°C)
dan liquifaksi (80-90°C) sehingga diperlukan α-amilase termostabil (Reddy et al.,
2003). Keseluruhan proses memerlukan masukan energi yang tinggi sehingga
meningkatkan biaya produksi pada industri berbasis pati. Dengan melihat
besarnya energi, efektifitas penggunaan sumber alam dan masalah viskositas,
hidrolisis pati secara langsung dibawah suhu gelatinisasi sangat diperlukan
(Sivaramakrishnan et al., 2006). Sekarang ini, sakarifikasi enzimatik pada pati
mentah tanpa pemanasan menjadi hal yang paling penting, terutama jika dilihat
dari sudut pandang penghematan energi dan efektivitas penggunaan biomasa yang
dapat mengurangi biaya pengolahan pati. Hal ini memunculkan ketertarikan untuk
dilakukannya penelitian dalam menemukan amilase yang bisa mendegradasi pati
mentah sehingga tidak diperlukan lagi tahap gelatinisasi dan hidrolisis pati mentah
bisa dilakukan secara langsung (Goyal et al., 2005).
Proses α-amilase dalam menghidrolisis granula pati mentah lebih sulit daripada
menghidrolisis pati yang digelatinisasi. Sakarifikasi pati mentah oleh enzim
amilolitik berhubungan dengan besarnya adsorpsi enzim pada granula pati.
Mikroorganisme penghasil amilase yang dapat mendegradasi pati mentah, pada
umumnya berasal dari jamur, seperti Aspergillus sp., Rhizopus sp., dan Corticium
rolfsi (Goyal et al., 2005). Walaupun demikian, beberapa bakteri telah dilaporkan
menghasilkan α-amilase yang dapat mendegradasi pati mentah, diantaranya
Bacillus sp. 1-3 (Goyal et al., 2005), Cytophaga sp. (Jeang et al., 2002), dan
Streptomyces sp. (Kaneko et al., 2005).
Bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 menghasilkan α-amilase yang dapat
mendegradasi pati mentah. Sampai saat ini, belum banyak dilakukan penelitian
terhadap α-amilase yang berasal dari bakteri laut dengan genus Vibrio. α-Amilase
yang telah dimurnikan dan dikarakterisasi adalah ekstraselular α-amilase dari
bakteri laut Vibrio sp. yang berasal dari India, dengan massa molekular 52,480
kDa dan mempunyai aktivitas maksimum pada 55-60°C dan pH 6,5 (Najafi,
2005).
3
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan informasi mengenai keberadaan gen
pengkode α-amilase pada bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3. Sasaran
jangka panjangnya adalah memperoleh urutan nukleotida gen pengkode α-amilase
dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 agar dapat dipelajari sifat-sifat dan
karakteristiknya sehingga diharapkan penggunaannya dapat menjadi salah satu
alternatif dalam proses industri berbasis pati.
Fragmen DNA kromosom EcoRI dari bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3
dengan ukuran 4,5-6 kb diligasi dengan vektor pUC19 yang dipotong dengan
enzim restriksi EcoRI. Penapisan sel transforman yang membawa gen pengkode
α-amilase dengan penambahan iodin dilakukan pada media agar yang
mengandung pati dan diidentifikasi berdasarkan pada pembentukan daerah bening
(halo zone). Selain itu, dilakukan pula analisis in-silico berdasarkan hasil
sekuensing fragmen DNA sisipan pada plasmid rekombinan Vsp.7 terhadap
genom V. parahaemolyticus RIMD.