10 3. METODE Waktu dan Tempat Penelitian

10
3. METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan September 2011- Juli 2012 di
Laboratorium Protein Terapetik dan Vaksin Pusat Penelitian Bioteknologi
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Cibinong Science Center (CSC).
Bahan
Kerangka baca terbuka hifn-α2a diamplifikasi dari plasmid rekombinan
pcDNA3.1+IFN-gene, vektor yang digunakan untuk kloning di E. coli dan
ekspresi pada P. pastoris adalah plasmid pPICZαB (Invitrogen), galur E. coli XL1
blue, dan galur X33 P. pastoris (Invitrogen).
Alat
Peralatan yang digunakan pada penelitian ini adalah: mesin PCR
(BIOMETRA), Mini Polyacrylamide Gel System (BIORAD), Mini Trans-Blot®
Cell (BIORAD), dan Gene Pulser Xcell Electroporation Systems (BIO-RAD).
Prosedur Kerja
Amplifikasi gen human ifn-α2a
Gen human ifn-α2a diamplifikasi dari rekombinan pcDNA3.1 + IFN-gene
yang telah terinsersi gen hifn-α2a menggunakan teknik PCR dan sekaligus
menambahkan situs restriksi pada kedua ujungnya. Primer dua arah yang
digunakan adalah : F-IFN : 5 ‘CCG CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT
TGT GAT CTG CCT CAA 3’, dan R-IFN : 5’GCT CTA GAG CTT CCT TAC
TTC TTA AAC T 3’. Primer PCR dirancang untuk mengamplifikasi gen hifn-α2a
dengan tambahan oligonukleotida yang mengkode situs pemotongan Kex2 dan
Ste13 dari vektor pPICZαB serta oligonukleotida pengkode asam amino pengkode
KBT hifn-α2a, serta penambahan urutan pengenal enzim restriksi pada ujungujungnya (Invitrogen, 2001).
Reaksi polimerisasi dilakukan dengan siklus sebagai berikut: denaturasi
pada 94 ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) 50ºC selama 1 menit,
dan polimerisasi 72oC selama 1 menit. Produk PCR dikarakterisasi dengan
metoda elektroforesis pada medium agarosa 1%. Gel diwarnai dengan larutan
EtBr dan diamati di bawah sinar UV. Hasil yang diharapkan adalah pita-pita pada
daerah sekitar 500 pasang basa (bp). Setelah itu, pita dengan ukuran tersebut
dipotong dan dipurifikasi dengan kit Agarosa DNA ekstraksi.
Preparasi Vektor pPICZαB
Plasmid pPICZαB (Invitrogen) diperbanyak dalam sel bakteri Eschericia
coli galur XL1 blue menggunakan metode Heat shock. Ditumbuhkan pada media
padat LB yang mengandung antibiotik zeocin pada suhu 37°C selama 24 jam.
11
Setelah diisolasi, DNA plasmid (vektor) dipotong dengan dua macam enzim
restriksi, yaitu Xho1 dan Xba1. Tahap selanjutnya dielektroforesis pada gel
agarosa 1% dengan tegangan 90 volt, lalu dilihat ukuran dan pola pita DNA-nya
dibawah lampu UV (Lampiran 3).
Sintesa Plasmid Rekombinan
Plasmid yang berfungsi sebagai vektor untuk membawa gen target adalah
plasmid pPICZαB. Gen human ifn-α2a dan plasmid pPICZαB yang mengandung
situs restriksi XhoI dan XbaI dipotong dengan enzim restriksi yang sama (XhoI
dan XbaI). Plasmid yang telah terbuka selanjutnya diligasikan dengan gen ifn-α2a
menggunakan enzim T4 DNA ligase. Sebelum ditransformasikan sel XL1 blue
dibuat menjadi sel kompeten. Koloni tunggal XL1 blue diinokulasi dalam 2 ml
media LB cair yang mengandung antibiotik tetrasiklin pada suhu 37°C dan 200
rpm selama 18 jam. Sebanyak 100 µl kultur ditambahkan ke dalam erlemeyer
yang berisi medium LB 100 ml. Kultur diinkubasi lagi selama 4 jam pada suhu
37°C dan 200 rpm. Sebanyak 30 ml kultur disentrifugasi pada 6500 rpm selama
15 menit pada suhu 4°C. Pelet ditambahkan dengan 4 ml larutan CaCl2 60mM
lalu diaduk perlahan sampai pelet larut. Selanjutnya diinkubasi selama 30 menit
pada suhu dingin. Sel disentrifugasi seperti prosedur sebelumnya, lalu pelet
ditambahkan kembali dengan 4 ml larutan CaCl2 60mM kemudian diinkubasi lagi
selama 30 menit pada suhu dingin. Setelah itu sel disentrifugasi, kemudian pelet
dilarutkan dengan 1 ml larutan CaCl2 60mM.
Transformasi dilakukan dengan cara mencampurkan 100 ul sel kompeten
dengan 10 ul campuran ligasi. Selanjutnya campuran diinkubasi selama 30 menit
pada suhu dingin. Campuran reaksi kemudian ditransformasi menggunakan
metode Heat shock pada suhu 42°C selama 2 menit, selanjutnya tabung mikro
yang berisi campuran tersebut diinkubasi selama 5 menit pada suhu dingin.
Ditambahkan 100 ul media LB tanpa antibiotik lalu diinkubasi selama 1 jam pada
suhu 37°C, 100 rpm.
Metode sebar dilakukan untuk menumbuhkan hasil transformasi pada media
padat LB low salt yang mengandung antibiotik zeocin dengan konsentrasi 25
ug/ml untuk proses seleksi transforman. Koloni yang tumbuh selanjutnya diisolasi
DNA plasmid rekombinannya dengan metode Minipreparation of Plasmid DNA.
Sebelum diisolasi koloni-koloni tunggal pada media padat LB low salt
ditumbuhkan semalaman pada suhu 37°C di dalam 2 ml media LB low salt cair.
Setelah itu diambil 1,5 ml kultur dan dipindahkan ke dalam tabung mikro lalu
disentrifugasi pada 13.200 g selama 5 menit. Larutan 1 sebanyak 100 ul (20 mM
Glukosa, 10 mM EDTA, 20 mM Tris dan 5000 ul ddH2O) ditambahkan pada pelet
sambil dilarutkan. Selanjutnya diinkubasi pada 4°C selama 5 menit. Untuk tahap
selanjutnya ditambahkan 200 ul larutan 2 (0,3 N NaOH, 1% SDS dan 4 ml
ddH2O), diaduk perlahan kemudian didinginkan selama 5-10 menit. Ke dalam
tabung selanjutnya ditambahkan 150 ul larutan 3 (3M sodium asetat pH 5,2)
sambil diaduk perlahan. Untuk memisahkan pelet dan supernatan dilakukan
sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 13.200 g. Supernatan (400 ul)
diambil dan ditambahkan larutan fenol (400 ul). Tabung kemudian disentrifugasi
lalu lapisan atas diambil dan dipindahkan ke tabung mikro baru. Ditambahkan ke
dalam tabung mikro pelarut kloroform dengan volume yang sama dengan cairan
12
yang diambil tadi. Tabung dikocok sebentar lalu disentrifugasi kembali selama 5
menit. Lapisan atas cairan diambil lalu dipindahkan ke tabung mikro baru untuk
ditambahkan etanol absolut sebanyak 2,5 volume awal. Tabung mikro yang berisi
plasmid rekombinan kemudian disimpan pada suhu -20°C selama 24 jam, lalu
disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 13.200 g selama 30 menit.
Supernatan dibuang lalu pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikering anginkan
pada suhu ruang. Selanjutnya dilarutkan dengan 20 ul ddH2O.
Plasmid rekombinan yang telah diisolasi selanjutnya dikarakterisasi melalui
analisis pemotongan dengan enzim restriksi, serta analisis urutan nukleotida
(sekuensing). Analisis pemotongan dilakukan dengan prosedur sebagai berikiut:
plasmid rekombinan dimasukkan ke dalam tabung mikro 0,6 ml bersama dengan
enzim Xho1 dan Xba1, buffer Tango, dan ddH2O steril (total volume 20 µl).
Campuran reaksi diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37°C. Hasil analisis restriksi
selanjutnya dielektroforesis pada media agarosa 1% untuk memastikan
keberhasilan tahapan reaksi yang telah dilakukan.
Sebelum dianalisis sekuensing plasmid rekombinan (klon 6) dipurifikasi
dengan maxiprep kit (Qiagen). Klon 6 yang telah dimurnikan kemudian dihitung
konsentrasinya menggunakan Nanofotometer (IMPLEN).
Analisis Sekuensing
Analisis sekuensing plasmid rekombinan pPICZαB-ifnα2a dilakukan di
Pusat Bioteknologi BPPT Serpong. Konsentrasi sampel yang disekuens adalah
100 ng/µl. Pembacaan dilakukan dua arah yaitu arah 5’-3’ dengan primer 5’AOX
(5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’), dan arah 3’-5’ dengan primer
3’AOX(5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’). Konsentrasi masing-masing
primer adalah 10 pmol/µl.
Linearisasi Plasmid Rekombinan
Plasmid rekombinan (klon 6) yang telah dicek kebenaran sekuensnya lalu
dilinearisasi sebanyak 5-10 ug dengan enzim BstX1. Plasmid yang telah linear
kemudian dipurifikasi dengan larutan fenol-kloroform dan diamati pola pitanya
dengan elektroforesis agarosa 1%.
Transformasi Plasmid RekombinanLinear ke dalam Sel P. pastoris
Sel elektrokompeten dari yeast (X33) dibuat dengan prosedur EasySelectTM
Pichia Expression Kit Manual Instruction (Invitrogen. 2001). Ditumbuhkan 1 ml
galur X33 P. pastoris dalam media YPD cair pada suhu 30°C selama 24 jam.
Selanjutnya diinokulasil 100 ul dari kultur tersebut lalu dipindahkan ke dalam 100
ml media YPD cair baru kemudian ditumbuhkan kembali sampai mencapai
OD600= 1,3-1,5. Setelah tercapai kondisi tersebut kultur disentrifugasi pada suhu
4°C selama 5 menit dengan kecepatan 1.100 g. Pelet diresuspen dengan 100 ul
ddH2O dingin. Dilakukan kembali sentrifugasi seperti prosedur sebelumnya,
kemudian pelet diresuspensi dengan 50 ml ddH2O dingin. Sel kemudian
disentrifugasi kembali, lalu pelet diresuspen dengan 4 ml sorbitol 1M dingin.
13
Sentrifugasi sel, lalu pelet diresuspen dengan 200 ul sorbitol 1M dingin. Sel
disimpan pada suhu dingin dan bisa langsung digunakan.
Sebanyak 80 ul sel elektrokompeten dicampur dengan 5-10 ug klon 6 linear
yang telah dipurifikasi. Campuran dipindahkan ke dalam cuvet 0,2 cm yang telah
disimpan pada kondisi dingin. Cuvet kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama
5 menit selanjutnya diberi kejutan listrik menggunakan metode elektroporasi.
Ditambahkan segera 1 ml sorbitol dingin ke dalam cuvet, kemudian ditransfer
seluruh isi cuvet ke dalam tabung steril 15 ml. Tabung selanjutnya diinkubasi
tanpa digoyang pada suhu 30°C selama 1-2 jam. Disebar 10, 25, 50, 100 dan 200
ul transforman pada media YPDS padat yang mengandung 100 ug/ml zeocin.
Plate kemudian diinkubasi 1-10 hari pada suhu 30°C sampai terbentuk koloni.
Skrining Sel P. pastoris yang membawa Plasmid Rekombinan
Proses skrining dilakukan dengan cara menumbuhkan koloni –koloni
tunggal yang tumbuh pada media YPD agar + 100 ug/ml zeocin ke media seleksi
YPDS + 2000 ug/ml zeocin. Pemilihan koloni dilakukan secara acak. Sel
diinkubasi pada suhu 28-30°C selama 2-5 hari. Transforman yang tumbuh pada
media tersebut kemudian diuji ekspresinya.
Ekspresi ke dalam sel P. pastoris
Koloni tunggal dari media YPDS + 2000 ug/ml zeocin ditumbuhkan dalam
2 ml media BMGY. Selanjutnya kultur diinkubasi dalam inkubator shaker pada
suhu 28°-30°C (250-300 rpm) sampai kultur mencapai nilai OD600=2-6. Sel
dipanen menggunakan sentrifugasi (1500-3000 x g) selama 5 menit pada
temperatur ruang. Supernatan yang diperoleh dibuang sedangkan peletnya
diresuspen sampai mencapai nilai OD600=1 dengan menggunakan media ekspresi
BMMY. Kultur ditumbuhkan kembali dalam inkubator bergoyang. Penambahan
100% metanol dengan konsentrasi akhir 0,5% dilakukan untuk interval waktu 24
dan 48 jam. Penambahan metanol dilakukan setiap 24 jam masa inkubasi.
Supernatan dan pelet dipisahkan setelah 48 jam jam lalu disimpan di dalam
tabung mikropada suhu 4°C. Analisis protein rekombinan terhadap supernatan
dilakukan menggunakan teknik Dot blot, SDS-PAGE (Sodium Deodocyl SulfatePolyacrylamide Gel) dan Western blot.
Analisis Dot Blot
Supernatan diteteskan pada membran nitroselulosa sebanyak 15 ul,
kemudian dikering anginkan. Membran yang telah kering direndam dan digoyang
dalam larutan blocking selama 60 menit, kemudian dicuci dengan larutan pencuci
(TBS + 0,1% tween) sebanyak 3 kali (15 menit; 5 menit; 5 menit). Membran
direndam dan digoyang dalam antibodi primer (Anti-α-Interferon Mouse mAb)
yang dimasukkan ke dalam larutan blocking dengan nisbah 1:500 selama 60 menit
dan dicuci seperti sebelumya. Tahap selanjutnya membran direndam dan
digoyang dalam antibodi sekunder (anti-mouse IgG AP conjugate) yang
dimasukkan ke dalam larutan blocking dengan nisbah 1:3000 selama 60 menit
yang dilanjutkan dengan pencucian seperti sebelumnya. Pita protein divisualisasi
14
dengan merendam membran dalam reagen NBT-BCIP yang dimasukkan ke
dalam larutan bufer AP pH 7,5 (Ausubel et al. 1992).
Analisis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel
Electrophoresis) dengan Pewarnaan Comassie Brilliant Blue (CBB)
Sampel protein (supernatan) yang akan dianalisis dengan metode SDSPAGE menggunakan konsentrasi poliakrilamid 12% untuk separating gel dan 3%
untuk stacking gel. Sampel protein (15 ul)dan 5 µl marka protein ditambahkan
dengan5 µl bufer sampel. Tabung yang berisi supernatan dididihkan selama 5
menit kemudian dimasukkan ke dalam sumur, begitu juga dengan marka protein.
Pemisahan protein dilakukan dengan elektroforesis dalam running buffer pada
tegangan 90 volt selama 120 menit. Gel hasil elektroforesis diwarnai dengan
Comassie brilliant blue (CBB) selama 24 jam yang dilanjutkan dengan
penambahan destaining solution.
Analisis Western Blot
Sampel yang akan dianalisis dengan Western blot (positif kontrol,
supernatan, marka protein dan negatif kontrol) terlebih dahulu dielektroforesis
mengunakan metode SDS-PAGE. Gel hasil elektroforesis ditransfer kedalam
membran niroselulosa yang sebelumya telah dibasahi bufer elektrotransfer. Gel
ditempatkan dalam sisi katode yang sebelumnya dilapisi kertas saring dan busa
kemudian membran nitroselulosa diletakkan di atasnya dalam posisi sejajar.
Dipastikan tidak terdapat gelembung. Membran ditutup dengan kertas saring dan
busa (membran nitroselulosa berada di sisi anode). Sandwich yang terbentuk
dimasukkan ke dalam tangki electroblotting, kemudian dilakukan proses transfer
dengan tegangan konstan 90 volt selama 120 menit dalam kondisi dingin (balok es
ditempatkan di dalam tangki dan di luar tangki). Membran yang sudah ditransfer
direndam dan digoyang dalam larutan blocking selama 60 menit, kemudian dicuci
dengan larutan pencuci (TBS + 0,1% tween) sebanyak 3 kali (15 menit; 5 menit; 5
menit). Membran direndam dan digoyang dalam antibodi primer (Anti-αInterferon Mouse mAb) yang dimasukkan ke dalam larutan blocking dengan
nisbah 1:500 selama 60 menit dan dicuci seperti sebelumya. Setelah itu, membran
direndam dan digoyang dalam antibodi sekunder (anti-mouse IgG AP conjugate)
yang dimasukkan ke dalam larutan blocking dengan nisbah 1:3000 selama 60
menit yang dilanjutkan dengan pencucian seperti sebelumnya. Pita protein
divisualisasi dengan merendam membran dalam reagen NBT-BCIP yang
dimasukkan ke dalam larutan bufer AP pH 7,5 (Ausubel et al.1992).